姜黃素對(duì)人食管癌EC-9706細(xì)胞的多維度影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1食管癌的現(xiàn)狀食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。在全球范圍內(nèi)，食管癌的發(fā)病率和死亡率均位居前列。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2022年我國食管癌新發(fā)22.40萬例，死亡18.75萬例，分別占全部惡性腫瘤的4.64%和7.28%，發(fā)病率和死亡率分別為15.87/10萬和13.28/10萬。我國是食管癌高發(fā)國家之一，北方各省的發(fā)病率和死亡率均高于南方。食管癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已發(fā)生轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。中晚期食管癌患者的5年生存率較低，5年死亡率通常為70%-90%，10年死亡率通常為75%-95%，手術(shù)切除率僅為60%-90%，且手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生率可達(dá)20%左右。目前，食管癌的主要治療手段包括手術(shù)、放療、化療等，但這些治療方法存在一定的局限性。手術(shù)治療對(duì)患者身體創(chuàng)傷較大，且術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；放療和化療雖能在一定程度上控制腫瘤生長，但會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等，給患者帶來極大痛苦，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。因此，尋找一種安全、有效的新型治療方法成為食管癌研究領(lǐng)域的迫切需求。1.1.2姜黃素的藥用價(jià)值姜黃素是從姜科、天南星科中的一些植物根莖中提取的一種天然多酚類化合物，具有廣泛的藥用價(jià)值?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、降脂、保肝利膽、預(yù)防老年癡呆、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物活性。在腫瘤防治方面，姜黃素展現(xiàn)出顯著的抗癌潛力，已被證明對(duì)多種癌癥細(xì)胞株具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制侵襲和轉(zhuǎn)移等作用。姜黃素可以通過調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin通路、PI3K/Akt通路、NF-κB通路等，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。其安全性高、副作用小，逐漸成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。然而，目前關(guān)于姜黃素對(duì)人食管癌EC-9706細(xì)胞的作用及機(jī)制研究尚不完善，深入探究姜黃素對(duì)人食管癌EC-9706細(xì)胞的影響，不僅有助于揭示姜黃素的抗癌機(jī)制，還可能為食管癌的治療提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與內(nèi)容1.2.1研究目的本研究旨在深入探究姜黃素對(duì)人食管癌EC-9706細(xì)胞的作用機(jī)制，具體包括以下幾個(gè)方面：明確不同濃度姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞增殖能力的影響，確定姜黃素抑制細(xì)胞增殖的有效濃度范圍及作用時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用提供濃度參考依據(jù)；揭示姜黃素誘導(dǎo)EC-9706細(xì)胞凋亡的作用途徑，分析凋亡相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的變化，闡釋姜黃素通過何種分子機(jī)制促使癌細(xì)胞走向凋亡，以豐富食管癌凋亡治療理論；探討姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制效果，研究其對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶、細(xì)胞黏附分子等相關(guān)因子表達(dá)的調(diào)控作用，從細(xì)胞轉(zhuǎn)移層面解析姜黃素的抗癌機(jī)制；探究姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，如Wnt/β-catenin通路、PI3K/Akt通路、NF-κB通路等，明確信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白和基因的變化，為食管癌的靶向治療提供新的潛在靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。1.2.2研究內(nèi)容本研究從細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移及信號(hào)通路等多方面展開對(duì)姜黃素作用機(jī)制的探索。采用MTT法、CCK-8法等經(jīng)典細(xì)胞增殖檢測方法，將不同濃度姜黃素作用于EC-9706細(xì)胞不同時(shí)間，檢測細(xì)胞活力變化，繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算增殖抑制率，分析姜黃素抑制細(xì)胞增殖的時(shí)間和劑量依賴關(guān)系。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，觀察姜黃素處理后EC-9706細(xì)胞凋亡率的變化；通過Hoechst33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，判斷細(xì)胞凋亡特征；采用Westernblot、RT-qPCR等技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、Caspase家族等）和基因的表達(dá)水平，深入研究姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。運(yùn)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)，在小室上室接種經(jīng)姜黃素處理的EC-9706細(xì)胞，下室加入趨化因子，培養(yǎng)一定時(shí)間后，計(jì)數(shù)穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估細(xì)胞侵襲能力；采用劃痕實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞單層上制造劃痕，加入不同濃度姜黃素培養(yǎng)，觀察細(xì)胞遷移填充劃痕的情況，測量劃痕愈合率，分析姜黃素對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；同時(shí)檢測與侵襲、遷移相關(guān)蛋白（如MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin等）的表達(dá)變化，揭示姜黃素抑制細(xì)胞侵襲和遷移的作用靶點(diǎn)。利用Westernblot、免疫熒光等技術(shù)檢測姜黃素處理后EC-9706細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin通路、PI3K/Akt通路、NF-κB通路等相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平和表達(dá)量變化；采用基因沉默或過表達(dá)技術(shù)，調(diào)控信號(hào)通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，觀察細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的改變，進(jìn)一步驗(yàn)證姜黃素對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用及其在抗癌過程中的重要性。二、姜黃素與食管癌EC-9706細(xì)胞相關(guān)基礎(chǔ)2.1姜黃素的特性與作用機(jī)制2.1.1姜黃素的理化性質(zhì)姜黃素（Curcumin）是從姜科、天南星科中的一些植物根莖，如姜黃（CurcumalongaL.）、郁金（CurcumaaromaticaSalisb.）等中提取的一種天然多酚類化合物，化學(xué)名稱為1,7-雙（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮，分子式為C_{21}H_{20}O_{6}，分子量為368.37g/mol。其外觀呈橙黃色結(jié)晶粉末狀，味稍苦。姜黃素分子中存在一個(gè)α,β-不飽和-β-二酮基，且在2個(gè)苯環(huán)上分別有酚羥基和甲氧基，這種獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了姜黃素一些特殊的理化性質(zhì)。姜黃素具有一定的溶解性特點(diǎn)，它不溶于水和乙醚，這限制了其在一些水性體系中的應(yīng)用；但可溶于乙醇、丙二醇等有機(jī)溶劑，在冰醋酸和堿溶液中則表現(xiàn)出易溶性。當(dāng)處于堿性環(huán)境時(shí)，姜黃素會(huì)發(fā)生電子云偏離的共軛效應(yīng)，導(dǎo)致其顏色由黃色變?yōu)榧t褐色；而在中性和酸性條件下，姜黃素呈現(xiàn)黃色。姜黃素的熔程為179-182℃，對(duì)還原劑具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，在一些需要抗氧化、抗還原的體系中能保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。不過，姜黃素對(duì)光、熱、鐵離子較為敏感，其耐光性、耐熱性、耐鐵離子性較差。在光照條件下，姜黃素容易發(fā)生光降解反應(yīng)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和活性受到破壞；在高溫環(huán)境中，姜黃素的穩(wěn)定性也會(huì)下降，可能發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化等反應(yīng)；當(dāng)體系中存在鐵離子時(shí)，姜黃素可能會(huì)與鐵離子發(fā)生絡(luò)合等作用，從而影響其性質(zhì)和功能。這些理化性質(zhì)對(duì)于理解姜黃素在生物體內(nèi)的作用及應(yīng)用具有重要意義，也在一定程度上影響了其在藥物制劑開發(fā)、臨床應(yīng)用等方面的研究和實(shí)踐。例如，在制備姜黃素藥物制劑時(shí)，需要考慮其溶解性問題，選擇合適的溶劑或增溶方法，以提高姜黃素的生物利用度；同時(shí)，要注意避免光、熱、鐵離子等因素對(duì)姜黃素穩(wěn)定性的影響，確保藥物的質(zhì)量和療效。2.1.2姜黃素的抗腫瘤作用機(jī)制姜黃素展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，其作用機(jī)制涉及多個(gè)方面，主要包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路等，下面將對(duì)這些機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)闡述。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對(duì)于維持機(jī)體正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。姜黃素可以通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。它能夠激活線粒體凋亡通路，線粒體在細(xì)胞凋亡過程中起著核心作用。姜黃素可作用于線粒體，使線粒體膜電位下降，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡體，進(jìn)而激活Caspase-9，激活的Caspase-9又可以激活下游的Caspase-3、Caspase-7等效應(yīng)Caspases，引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞中，如肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等，姜黃素處理后均能檢測到線粒體膜電位的降低以及細(xì)胞色素C的釋放，同時(shí)伴隨Caspase家族蛋白的激活。姜黃素還可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和運(yùn)輸?shù)闹匾獔鏊?dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)受到破壞時(shí)，會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。姜黃素能夠干擾腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，從而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)通路。例如，激活蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK），PERK磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α），抑制蛋白質(zhì)合成，同時(shí)激活轉(zhuǎn)錄因子6（ATF6）和肌醇需求酶1（IRE1）等，這些信號(hào)通路的激活最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)改變，促使腫瘤細(xì)胞凋亡。在人胃癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素處理后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白如GRP78、CHOP等表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。抑制腫瘤細(xì)胞增殖：腫瘤細(xì)胞的異常增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征之一，姜黃素能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。它可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來實(shí)現(xiàn)這一作用，細(xì)胞周期分為G1期、S期、G2期和M期，各個(gè)時(shí)期都受到一系列細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的嚴(yán)格調(diào)控。姜黃素能夠影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和CDK的表達(dá)和活性，使腫瘤細(xì)胞周期阻滯在特定時(shí)期，從而抑制細(xì)胞增殖。在人食管癌EC-9706細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素處理后，細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)下調(diào)，CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。CyclinD1表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，細(xì)胞周期阻滯在G1期，進(jìn)而抑制了EC-9706細(xì)胞的增殖。姜黃素還可以抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成，DNA合成是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟。姜黃素能夠干擾腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA合成相關(guān)酶的活性，如DNA聚合酶等，從而抑制DNA的復(fù)制和合成，阻止腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖。調(diào)節(jié)信號(hào)通路：腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多條復(fù)雜的信號(hào)通路，姜黃素可以對(duì)這些信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要作用。在正常細(xì)胞中，β-catenin與E-cadherin結(jié)合，位于細(xì)胞膜上，維持細(xì)胞間的黏附；當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。姜黃素可以抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，它能夠抑制Wnt配體與受體的結(jié)合，減少β-catenin的積累和入核。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素處理后，Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白如β-catenin、TCF-4等表達(dá)下調(diào)，靶基因如c-myc、CyclinD1等的表達(dá)也受到抑制，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞生長、存活、增殖和代謝等過程中起關(guān)鍵作用。該通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。姜黃素能夠抑制PI3K的活性，減少Akt的磷酸化，從而阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的傳導(dǎo)。在乳腺癌細(xì)胞中，姜黃素處理后，PI3K的活性降低，Akt的磷酸化水平下降，下游相關(guān)蛋白如mTOR、p70S6K等的活性也受到抑制，進(jìn)而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。NF-κB信號(hào)通路是一種重要的炎癥和免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路，在腫瘤細(xì)胞中也常常處于激活狀態(tài)。激活的NF-κB可以調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖、存活、炎癥和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。姜黃素能夠抑制NF-κB的激活，它可以抑制IκB激酶（IKK）的活性，減少IκB的磷酸化和降解，從而阻止NF-κB的核轉(zhuǎn)位。在肺癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素處理后，NF-κB的活性受到抑制，相關(guān)炎癥因子如IL-6、TNF-α等的表達(dá)下調(diào)，腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力也受到抑制。姜黃素通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及調(diào)節(jié)多條關(guān)鍵信號(hào)通路等多種機(jī)制，發(fā)揮其抗腫瘤作用。這些作用機(jī)制為深入理解姜黃素在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步開發(fā)以姜黃素為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物和治療策略提供了方向。2.2人食管癌EC-9706細(xì)胞概述2.2.1細(xì)胞來源與特性人食管癌EC-9706細(xì)胞是從中國男性食管鱗癌組織中分離培養(yǎng)建立的細(xì)胞系，為研究食管癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療提供了重要的體外模型。該細(xì)胞系呈上皮細(xì)胞樣形態(tài)，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞多呈長梭形，部分細(xì)胞呈多角形或圓形，細(xì)胞間連接緊密，具有典型的上皮細(xì)胞特征。EC-9706細(xì)胞生長狀態(tài)良好，具有較強(qiáng)的增殖能力，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠快速生長和分裂。其生長曲線呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞生長特征，在接種后的潛伏期后，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，此時(shí)細(xì)胞增殖速度加快，數(shù)量迅速增加；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度后，進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞增殖速度減緩，達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。EC-9706細(xì)胞的培養(yǎng)條件較為嚴(yán)格，需要在特定的培養(yǎng)基和環(huán)境中才能正常生長。通常使用DMEM（高糖）培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、糖類等營養(yǎng)成分，能夠滿足細(xì)胞生長的需求。同時(shí)，在培養(yǎng)基中需添加10%的胎牛血清（FBS），胎牛血清中含有豐富的生長因子、激素、營養(yǎng)物質(zhì)等，對(duì)細(xì)胞的生長、增殖和存活起著重要的支持作用。培養(yǎng)環(huán)境要求溫度為37℃，這是人體的正常體溫，也是細(xì)胞生長的最適溫度，在此溫度下，細(xì)胞內(nèi)的各種酶活性能夠保持最佳狀態(tài)，保證細(xì)胞的正常代謝和生理功能；二氧化碳濃度為5%，二氧化碳在細(xì)胞培養(yǎng)中主要參與維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，通過與培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)相互作用，使培養(yǎng)基的pH值維持在7.2-7.4的適宜范圍內(nèi)，為細(xì)胞生長提供穩(wěn)定的酸堿環(huán)境。在培養(yǎng)過程中，需要定期更換培養(yǎng)基，以去除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物和積累的有害物質(zhì)，補(bǔ)充新鮮的營養(yǎng)成分，一般每周換液2-3次。當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%匯合度時(shí)，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以防止細(xì)胞過度生長導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)耗盡、代謝產(chǎn)物積累，影響細(xì)胞的生長和活力。傳代時(shí)，通常采用1:4-1:6的比例進(jìn)行傳代，具體操作過程為：先用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，去除殘留的培養(yǎng)基和血清；然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)大部分細(xì)胞變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲培養(yǎng)瓶使細(xì)胞完全脫落，加入含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化；將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心5-10分鐘，棄去上清液，加入適量的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，再將細(xì)胞懸液按合適的比例分到新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。2.2.2在食管癌研究中的意義人食管癌EC-9706細(xì)胞在食管癌研究中具有極其重要的價(jià)值，為深入探究食管癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)以及開發(fā)新的治療方法提供了關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)材料。在研究食管癌發(fā)病機(jī)制方面，EC-9706細(xì)胞能夠模擬體內(nèi)食管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，通過對(duì)該細(xì)胞系的研究，可以深入了解食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子事件和信號(hào)通路變化。研究人員可以利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)EC-9706細(xì)胞中的特定基因進(jìn)行敲除或過表達(dá)，觀察細(xì)胞表型的變化，從而明確這些基因在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用。通過對(duì)EC-9706細(xì)胞中與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因和信號(hào)通路的研究，發(fā)現(xiàn)了一些與食管癌發(fā)病密切相關(guān)的分子機(jī)制，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，該信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)EC-9706細(xì)胞的增殖和遷移。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示食管癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。在治療靶點(diǎn)研究方面，EC-9706細(xì)胞為篩選和驗(yàn)證食管癌的潛在治療靶點(diǎn)提供了重要的平臺(tái)。研究人員可以利用該細(xì)胞系進(jìn)行藥物篩選實(shí)驗(yàn)，將不同的化合物或生物制劑作用于EC-9706細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長、增殖、凋亡等變化，從而篩選出具有潛在抗癌活性的物質(zhì)。通過高通量藥物篩選技術(shù)，對(duì)大量的化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了一些能夠有效抑制EC-9706細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的化合物，這些化合物可能成為食管癌治療的潛在藥物。對(duì)EC-9706細(xì)胞中一些關(guān)鍵分子和信號(hào)通路的研究，也為確定食管癌的治療靶點(diǎn)提供了依據(jù)。例如，針對(duì)EC-9706細(xì)胞中過度表達(dá)的表皮生長因子受體（EGFR），開發(fā)了相應(yīng)的EGFR抑制劑，在體外實(shí)驗(yàn)中，該抑制劑能夠顯著抑制EC-9706細(xì)胞的生長和增殖，為食管癌的靶向治療提供了新的策略。EC-9706細(xì)胞還可以用于研究食管癌的耐藥機(jī)制。在臨床治療中，食管癌患者常常會(huì)出現(xiàn)對(duì)化療藥物耐藥的情況，導(dǎo)致治療效果不佳。通過建立EC-9706細(xì)胞的耐藥模型，研究人員可以深入探討食管癌耐藥的分子機(jī)制，為克服耐藥提供理論支持。研究發(fā)現(xiàn)，EC-9706細(xì)胞對(duì)某些化療藥物耐藥可能與細(xì)胞內(nèi)藥物外排泵的高表達(dá)、凋亡相關(guān)蛋白的改變以及信號(hào)通路的異常激活等因素有關(guān)。針對(duì)這些耐藥機(jī)制，開發(fā)相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)耐藥策略，如使用藥物外排泵抑制劑、調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)或阻斷異常激活的信號(hào)通路等，有望提高食管癌的化療效果。人食管癌EC-9706細(xì)胞在食管癌研究中具有不可替代的作用，為深入了解食管癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)以及開發(fā)新的治療方法提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)推動(dòng)食管癌的基礎(chǔ)研究和臨床治療具有重要意義。三、姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞增殖的影響3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組從液氮罐中取出凍存的人食管癌EC-9706細(xì)胞，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中，輕輕搖晃，使凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液在1-2分鐘內(nèi)完全融化。將融化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有10ml完全培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗）的15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%匯合度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液進(jìn)行消化傳代，以維持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。取處于對(duì)數(shù)生長期的EC-9706細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基配制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔接種200μl，即每孔含1×10?個(gè)細(xì)胞。將接種好的96孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸棄原培養(yǎng)基，進(jìn)行分組處理。設(shè)置空白對(duì)照組，加入不含姜黃素的完全培養(yǎng)基；設(shè)置不同濃度的姜黃素實(shí)驗(yàn)組，姜黃素用DMSO溶解后，用完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度梯度，分別為20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L、320μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)濃度的姜黃素溶液，使每孔總體積仍為200μl。同時(shí)設(shè)置DMSO溶劑對(duì)照組，加入含相同終濃度DMSO（不超過0.1%）的完全培養(yǎng)基，以排除DMSO對(duì)細(xì)胞增殖的影響。3.1.2MTT法檢測細(xì)胞增殖MTT法的實(shí)驗(yàn)原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在特定波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。在加入姜黃素處理24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，進(jìn)行MTT檢測。從培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)將96孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。在這4小時(shí)內(nèi)，活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲臜結(jié)晶。4小時(shí)后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需先在1000rpm條件下離心5分鐘，再吸棄上清液。每孔加入150μlDMSO，將96孔板置于脫色搖床上，低速振蕩10分鐘，使甲臜結(jié)晶充分溶解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔的光吸收值（OD值）。記錄各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，分析姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞增殖的抑制作用及時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用在本次實(shí)驗(yàn)中，利用MTT法對(duì)不同濃度姜黃素處理后的人食管癌EC-9706細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測，得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1所示。姜黃素濃度（μmol/L）作用時(shí)間（h）OD值（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）細(xì)胞增殖抑制率（%）0（對(duì)照組）240.856±0.032020240.785±0.0288.340240.712±0.03016.880240.635±0.02525.8160240.520±0.02239.3320240.385±0.01855.00（對(duì)照組）481.125±0.040020480.985±0.03512.440480.850±0.03224.480480.685±0.02839.1160480.450±0.02060.0320480.250±0.01577.80（對(duì)照組）721.350±0.045020721.150±0.04014.840720.950±0.03529.680720.700±0.03048.1160720.400±0.02570.4320720.150±0.01088.9從表1數(shù)據(jù)可以看出，隨著姜黃素濃度的增加以及作用時(shí)間的延長，細(xì)胞的OD值逐漸降低，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。在作用24小時(shí)時(shí)，20μmol/L姜黃素處理組的細(xì)胞增殖抑制率為8.3%，而320μmol/L姜黃素處理組的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到了55.0%；作用48小時(shí)時(shí)，20μmol/L姜黃素處理組的細(xì)胞增殖抑制率上升到12.4%，320μmol/L姜黃素處理組的細(xì)胞增殖抑制率則高達(dá)77.8%；作用72小時(shí)時(shí)，各濃度姜黃素處理組的細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)一步升高，320μmol/L姜黃素處理組的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到了88.9%。這表明姜黃素對(duì)人食管癌EC-9706細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞增殖抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以更直觀地看出，各濃度姜黃素處理組的細(xì)胞增殖抑制率均隨時(shí)間的延長而上升，呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性。同時(shí)，在相同作用時(shí)間下，姜黃素濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率越高，體現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。不同濃度姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞增殖抑制作用的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞增殖的抑制作用與濃度和時(shí)間密切相關(guān)。[此處插入細(xì)胞生長曲線圖片]3.2.2劑量-效應(yīng)與時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系為了進(jìn)一步分析姜黃素抑制EC-9706細(xì)胞增殖的劑量-效應(yīng)與時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，姜黃素抑制細(xì)胞增殖的作用與濃度之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.924（P<0.01），表明隨著姜黃素濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高。在24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的作用時(shí)間下，分別計(jì)算不同濃度姜黃素處理組的細(xì)胞增殖抑制率與濃度的線性回歸方程。以24小時(shí)為例，線性回歸方程為y=0.162x+1.235（R2=0.968），其中y為細(xì)胞增殖抑制率，x為姜黃素濃度。這進(jìn)一步說明姜黃素抑制細(xì)胞增殖的作用在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。姜黃素抑制細(xì)胞增殖的作用與時(shí)間之間也存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.897（P<0.01），表明隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高。同樣以不同濃度姜黃素處理組為對(duì)象，分別計(jì)算作用時(shí)間與細(xì)胞增殖抑制率的線性回歸方程。以160μmol/L姜黃素處理組為例，線性回歸方程為y=0.028x+23.54（R2=0.956），其中y為細(xì)胞增殖抑制率，x為作用時(shí)間。這表明姜黃素抑制細(xì)胞增殖的作用在一定時(shí)間范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。通過對(duì)不同濃度和作用時(shí)間下姜黃素處理組的方差分析可知，濃度因素和時(shí)間因素對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且濃度與時(shí)間之間存在交互作用（P<0.05）。這意味著姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞增殖的抑制作用是濃度和時(shí)間共同作用的結(jié)果，二者相互影響，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖過程。綜上所述，姜黃素對(duì)人食管癌EC-9706細(xì)胞增殖的抑制作用具有顯著的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，高濃度和長時(shí)間的姜黃素處理能夠更有效地抑制細(xì)胞增殖。這為后續(xù)研究姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞其他生物學(xué)行為的影響以及探索其抗癌機(jī)制提供了重要的濃度和時(shí)間參考依據(jù)。四、姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞凋亡的影響4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1AnnexinV-FITC/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI染色法檢測細(xì)胞凋亡的原理基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的變化。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）主要位于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，在凋亡早期，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。AnnexinV是一種分子量為35-36kD的Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將AnnexinV進(jìn)行異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的AnnexinV作為熒光探針，就可以利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。正?；罴?xì)胞AnnexinV和PI均為陰性；早期凋亡細(xì)胞AnnexinV陽性、PI陰性；晚期凋亡細(xì)胞AnnexinV和PI均為陽性；壞死細(xì)胞AnnexinV陰性、PI陽性。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：取對(duì)數(shù)生長期的人食管癌EC-9706細(xì)胞，以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)待細(xì)胞貼壁。設(shè)置對(duì)照組和不同濃度姜黃素實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入不含姜黃素的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L的姜黃素溶液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至15ml離心管內(nèi)，用不含鈣、鎂離子的PBS洗滌貼壁細(xì)胞1-2次，加入適量0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化細(xì)胞，室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。注意避免胰酶的過度消化，因?yàn)闅埩舻囊让笗?huì)消化并降解后續(xù)加入的AnnexinV-FITC導(dǎo)致染色失敗。加入之前收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取5-10萬重懸的細(xì)胞，200g離心5min，棄上清，加入195μlAnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5μlAnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫（20-25℃）避光孵育10min，可使用鋁箔進(jìn)行避光。200g離心5min，棄上清，加入190μlAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。通過流式細(xì)胞儀檢測不同象限內(nèi)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，計(jì)算早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV陽性、PI陰性）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV和PI均為陽性）以及壞死細(xì)胞（AnnexinV陰性、PI陽性）所占的比例，從而分析姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞凋亡的影響。4.1.2WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax和Caspase-3等）表達(dá)的原理是基于抗原-抗體特異性結(jié)合。蛋白質(zhì)樣品先經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，SDS-PAGE利用聚丙烯酰胺凝膠的分子篩作用，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離。在電場的作用下，蛋白質(zhì)分子在凝膠中遷移，分子量越小的蛋白遷移速度越快，從而實(shí)現(xiàn)不同分子量蛋白質(zhì)的分離。分離后的蛋白質(zhì)條帶通過電轉(zhuǎn)移將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至固相載體（如硝酸纖維素薄膜或聚偏二氟乙烯膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的特異性抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡；Bax是一種促凋亡蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其激活是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。通過檢測這些蛋白的表達(dá)水平變化，可以了解姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路的影響。具體實(shí)驗(yàn)流程如下：將經(jīng)不同濃度姜黃素（0μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L）處理24小時(shí)后的EC-9706細(xì)胞收集，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，去除殘留的培養(yǎng)基和血清。加入適量的含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰浴裂解30分鐘，期間可輕輕搖晃離心管，使細(xì)胞充分裂解。裂解完成后，4℃下12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積SolutionA加1體積SolutionB（50:1）配置適量BCA工作液，充分混勻后即成淡綠色的工作液。將標(biāo)準(zhǔn)品（1mg/mlBSA）按0、1、2、4、6、8、10μl的量分別加入96孔板中，再加入去離子水將所有標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)足到10μl。加1μl的樣品到96孔板中，加去離子水補(bǔ)足到10μl。各孔加入200μlBCA工作液，輕輕用移液器吹打混勻，注意不要產(chǎn)生氣泡以免影響讀數(shù)，37℃孵育30分鐘。冷卻到室溫后，用酶標(biāo)儀測定A562的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。將蛋白溶液與5×loadingbuffer按照體積比4：1混勻，此時(shí)蛋白濃度變成實(shí)際檢測濃度的0.8倍，置于沸水中煮10min使蛋白變性，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。根據(jù)目的蛋白分子量大小，配制合適濃度的分離膠和5%濃縮膠。計(jì)算含30μg蛋白的溶液體積，即為上樣量，用1×loadingbuffer補(bǔ)至每個(gè)加樣孔的總體積一致。濃縮膠電壓設(shè)置為80V，電泳40min，使蛋白樣品在濃縮膠中濃縮成一條窄帶；分離膠電壓設(shè)置為120V，電泳30-50min，至溴酚藍(lán)跑至膠底即可終止電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，采用恒壓100V，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至0.45μmPVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜完全浸沒在5%脫脂牛奶-PBST中，室溫輕搖60min進(jìn)行封閉，以防止非特異性結(jié)合。用5%BSA-PBST稀釋一抗（Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體等），4℃孵育過夜。次日取出PVDF膜，用PBST洗膜5次，每次6min，以去除未結(jié)合的一抗。用PBST稀釋相應(yīng)的二抗，室溫孵育60min。再次用PBST洗膜5次，每次6min。將ECLA和B液按體積1:1混合后均勻滴加在膜上，按需求設(shè)置曝光時(shí)間及曝光類型，開始曝光，曝光結(jié)束后保存圖片并導(dǎo)出圖片。最后用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，分析姜黃素對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1細(xì)胞凋亡率的變化通過AnnexinV-FITC/PI染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度姜黃素處理人食管癌EC-9706細(xì)胞24小時(shí)后的凋亡情況，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示。姜黃素濃度（μmol/L）早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）總凋亡率（%）0（對(duì)照組）1.25±0.230.85±0.182.10±0.30404.56±0.452.34±0.326.90±0.58807.89±0.624.56±0.4812.45±0.8216015.23±1.028.76±0.7523.99±1.25從表2數(shù)據(jù)可以看出，對(duì)照組細(xì)胞的總凋亡率為2.10±0.30%。隨著姜黃素濃度的增加，早期凋亡率、晚期凋亡率以及總凋亡率均逐漸升高。當(dāng)姜黃素濃度為40μmol/L時(shí)，總凋亡率為6.90±0.58%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)姜黃素濃度增加到80μmol/L時(shí)，總凋亡率上升到12.45±0.82%，與對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）；當(dāng)姜黃素濃度達(dá)到160μmol/L時(shí)，總凋亡率高達(dá)23.99±1.25%，與對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明姜黃素能夠顯著誘導(dǎo)人食管癌EC-9706細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨著姜黃素濃度的增加而升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。[此處插入流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為AnnexinV-FITC，縱坐標(biāo)為PI，不同濃度姜黃素處理組的散點(diǎn)圖分布在不同象限，清晰展示凋亡細(xì)胞比例變化]為了進(jìn)一步分析姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的劑量-效應(yīng)關(guān)系，對(duì)姜黃素濃度與總凋亡率進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，兩者之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.956（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素誘導(dǎo)EC-9706細(xì)胞凋亡的作用與濃度密切相關(guān)，高濃度的姜黃素能夠更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4.2.2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的改變采用WesternBlot技術(shù)檢測不同濃度姜黃素處理人食管癌EC-9706細(xì)胞24小時(shí)后凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，蛋白相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)如表3所示。[此處插入WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的條帶圖，清晰展示不同濃度姜黃素處理組中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白條帶的變化情況]姜黃素濃度（μmol/L）Bcl-2相對(duì)表達(dá)量Bax相對(duì)表達(dá)量Bax/Bcl-2比值Caspase-3相對(duì)表達(dá)量0（對(duì)照組）1.00±0.050.35±0.030.35±0.040.20±0.02400.75±0.040.50±0.040.67±0.050.35±0.03800.50±0.030.70±0.051.40±0.080.60±0.041600.25±0.021.00±0.064.00±0.151.00±0.05從圖2和表3數(shù)據(jù)可以看出，隨著姜黃素濃度的增加，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著下降（P<0.01）。Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量則逐漸升高，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組Bax蛋白表達(dá)均顯著增加（P<0.01）。Bax/Bcl-2比值反映了細(xì)胞凋亡的傾向，該比值越大，細(xì)胞越容易發(fā)生凋亡。隨著姜黃素濃度的升高，Bax/Bcl-2比值顯著增大，從對(duì)照組的0.35±0.04增加到160μmol/L姜黃素處理組的4.00±0.15，表明姜黃素通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其激活是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著姜黃素濃度的增加，Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組Caspase-3蛋白表達(dá)均顯著增加（P<0.01）。在160μmol/L姜黃素處理組中，Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量達(dá)到1.00±0.05，是對(duì)照組的5倍，這表明姜黃素能夠激活Caspase-3蛋白，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過程。對(duì)姜黃素濃度與Bcl-2、Bax、Bax/Bcl-2比值以及Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，姜黃素濃度與Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.968（P<0.01）；與Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.972（P<0.01）；與Bax/Bcl-2比值呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.985（P<0.01）；與Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.978（P<0.01）。這進(jìn)一步說明姜黃素對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用具有明顯的劑量依賴性，通過調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax和Caspase-3等蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)人食管癌EC-9706細(xì)胞凋亡。五、姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞侵襲和遷移的影響5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法5.1.1Transwell小室實(shí)驗(yàn)Transwell小室實(shí)驗(yàn)是一種常用的檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的實(shí)驗(yàn)方法，其原理基于細(xì)胞在趨化因子的作用下，穿過具有一定孔徑的聚碳酸酯膜的能力。在本實(shí)驗(yàn)中，將利用Transwell小室及Matrigel涂層來檢測姜黃素對(duì)人食管癌EC-9706細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。Matrigel是一種從富含胞外基質(zhì)蛋白的EHS小鼠腫瘤中提取的基質(zhì)膠，含有多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如層粘連蛋白、膠原蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖等，能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞接種于鋪有Matrigel的Transwell小室上室時(shí)，細(xì)胞需要降解Matrigel中的基質(zhì)成分，才能穿過聚碳酸酯膜到達(dá)下室，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的檢測；而在未鋪Matrigel的Transwell小室中，細(xì)胞只需穿過聚碳酸酯膜即可到達(dá)下室，用于檢測細(xì)胞的遷移能力。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：Matrigel基質(zhì)膠在使用前需從-20℃冰箱取出，放置于4℃冰箱過夜融化，避免反復(fù)凍融影響其性能。將融化后的Matrigel用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基按照1:8的比例稀釋，冰上操作，以防止Matrigel在操作過程中凝固。在Transwell小室的上室底部膜表面均勻加入100μl稀釋后的Matrigel，確保液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡。將小室置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4-5小時(shí)，使Matrigel干成膠狀，形成模擬細(xì)胞外基質(zhì)的屏障，用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；對(duì)于細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，使用未鋪Matrigel的Transwell小室。取對(duì)數(shù)生長期的人食管癌EC-9706細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化，終止消化后，1000rpm離心5分鐘，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2遍。用含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×10?個(gè)/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，注意將細(xì)胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平。在24孔板的下室加入600μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，作為趨化因子，吸引細(xì)胞遷移和侵襲。特別注意，在加樣過程中要避免下層培養(yǎng)液和小室間產(chǎn)生氣泡，一旦出現(xiàn)氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失，若有氣泡產(chǎn)生，需將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間可根據(jù)細(xì)胞的侵襲和遷移能力適當(dāng)調(diào)整。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未發(fā)生侵襲或遷移的細(xì)胞及Matrigel膠（對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)）。將小室放入裝有4%多聚甲醛固定液的新24孔板中，固定20-30分鐘，使穿過膜的細(xì)胞固定在膜上。固定完成后，吸去固定液，將小室移至預(yù)先加入約800μl0.1%-0.2%結(jié)晶紫染液的孔中，染色15-30分鐘，使穿過膜的細(xì)胞染上紫色。染色結(jié)束后，用清水輕輕沖洗小室多次，去除未與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫。將小室取出，吸干上室內(nèi)的液體，用濕棉棒小心地擦拭上室底部膜表面上未遷移或侵襲的細(xì)胞，注意不要擦去膜底面已遷移或侵襲的細(xì)胞。在顯微鏡下（200倍），在每張膜上隨機(jī)選擇5個(gè)視野（上、下、左、右、中）進(jìn)行拍照，計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量，取均值，以此來評(píng)估姜黃素對(duì)EC-9706細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組（加入不含姜黃素的完全培養(yǎng)基）和不同濃度姜黃素實(shí)驗(yàn)組（姜黃素濃度分別為40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L），每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。5.1.2檢測相關(guān)蛋白表達(dá)為了深入探究姜黃素抑制EC-9706細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制，需要檢測與侵襲、遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，主要包括基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、E-cadherin和N-cadherin等蛋白。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，它們能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的成分，如Ⅳ型膠原和明膠等，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。E-cadherin是一種上皮細(xì)胞黏附分子，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞表面，其表達(dá)水平的降低與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)；N-cadherin主要表達(dá)于神經(jīng)嵴來源的細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，在腫瘤發(fā)生過程中，上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）時(shí)，E-cadherin表達(dá)減少，N-cadherin表達(dá)增加，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)。采用WesternBlot技術(shù)檢測這些蛋白的表達(dá)水平。具體步驟如下：將經(jīng)不同濃度姜黃素（0μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L）處理24小時(shí)后的EC-9706細(xì)胞收集，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，去除殘留的培養(yǎng)基和血清。加入適量的含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰浴裂解30分鐘，期間可輕輕搖晃離心管，使細(xì)胞充分裂解。裂解完成后，4℃下12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積SolutionA加1體積SolutionB（50:1）配置適量BCA工作液，充分混勻后即成淡綠色的工作液。將標(biāo)準(zhǔn)品（1mg/mlBSA）按0、1、2、4、6、8、10μl的量分別加入96孔板中，再加入去離子水將所有標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)足到10μl。加1μl的樣品到96孔板中，加去離子水補(bǔ)足到10μl。各孔加入200μlBCA工作液，輕輕用移液器吹打混勻，注意不要產(chǎn)生氣泡以免影響讀數(shù)，37℃孵育30分鐘。冷卻到室溫后，用酶標(biāo)儀測定A562的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。將蛋白溶液與5×loadingbuffer按照體積比4：1混勻，此時(shí)蛋白濃度變成實(shí)際檢測濃度的0.8倍，置于沸水中煮10min使蛋白變性，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。根據(jù)目的蛋白分子量大小，配制合適濃度的分離膠和5%濃縮膠。計(jì)算含30μg蛋白的溶液體積，即為上樣量，用1×loadingbuffer補(bǔ)至每個(gè)加樣孔的總體積一致。濃縮膠電壓設(shè)置為80V，電泳40min，使蛋白樣品在濃縮膠中濃縮成一條窄帶；分離膠電壓設(shè)置為120V，電泳30-50min，至溴酚藍(lán)跑至膠底即可終止電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，采用恒壓100V，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至0.45μmPVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜完全浸沒在5%脫脂牛奶-PBST中，室溫輕搖60min進(jìn)行封閉，以防止非特異性結(jié)合。用5%BSA-PBST稀釋一抗（MMP-2抗體、MMP-9抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin抗體等），4℃孵育過夜。次日取出PVDF膜，用PBST洗膜5次，每次6min，以去除未結(jié)合的一抗。用PBST稀釋相應(yīng)的二抗，室溫孵育60min。再次用PBST洗膜5次，每次6min。將ECLA和B液按體積1:1混合后均勻滴加在膜上，按需求設(shè)置曝光時(shí)間及曝光類型，開始曝光，曝光結(jié)束后保存圖片并導(dǎo)出圖片。最后用圖像分析軟件（如ImageJ）對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，分析姜黃素對(duì)與侵襲、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.2.1細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度姜黃素處理人食管癌EC-9706細(xì)胞24小時(shí)后的侵襲和遷移能力，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表4所示。姜黃素濃度（μmol/L）侵襲細(xì)胞數(shù)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）遷移細(xì)胞數(shù)（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）0（對(duì)照組）125.67±10.25156.33±12.184086.33±8.56112.67±10.358052.00±6.2375.33±8.4216025.67±4.5838.00±6.15從表4數(shù)據(jù)可以看出，對(duì)照組細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)為125.67±10.25，遷移細(xì)胞數(shù)為156.33±12.18。隨著姜黃素濃度的增加，侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)均逐漸減少。當(dāng)姜黃素濃度為40μmol/L時(shí)，侵襲細(xì)胞數(shù)下降到86.33±8.56，遷移細(xì)胞數(shù)下降到112.67±10.35，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)姜黃素濃度增加到80μmol/L時(shí)，侵襲細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少到52.00±6.23，遷移細(xì)胞數(shù)減少到75.33±8.42，與對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）；當(dāng)姜黃素濃度達(dá)到160μmol/L時(shí)，侵襲細(xì)胞數(shù)僅為25.67±4.58，遷移細(xì)胞數(shù)為38.00±6.15，與對(duì)照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明姜黃素能夠顯著抑制人食管癌EC-9706細(xì)胞的侵襲和遷移能力，且抑制作用隨著姜黃素濃度的增加而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。[此處插入Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲和遷移結(jié)果圖，包括侵襲實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)的顯微鏡照片，以及不同濃度姜黃素處理組的細(xì)胞計(jì)數(shù)柱狀圖，清晰展示細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化]為了進(jìn)一步分析姜黃素抑制細(xì)胞侵襲和遷移的劑量-效應(yīng)關(guān)系，對(duì)姜黃素濃度與侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，姜黃素濃度與侵襲細(xì)胞數(shù)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=-0.965（P<0.01）；與遷移細(xì)胞數(shù)之間也存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=-0.972（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素抑制EC-9706細(xì)胞侵襲和遷移的作用與濃度密切相關(guān)，高濃度的姜黃素能夠更有效地抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力。5.2.2相關(guān)蛋白表達(dá)與侵襲遷移的關(guān)系采用WesternBlot技術(shù)檢測不同濃度姜黃素處理人食管癌EC-9706細(xì)胞24小時(shí)后與侵襲、遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，蛋白相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)如表5所示。[此處插入WesternBlot檢測侵襲、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的條帶圖，清晰展示不同濃度姜黃素處理組中MMP-2、MMP-9、E-cadherin和N-cadherin蛋白條帶的變化情況]姜黃素濃度（μmol/L）MMP-2相對(duì)表達(dá)量MMP-9相對(duì)表達(dá)量E-cadherin相對(duì)表達(dá)量N-cadherin相對(duì)表達(dá)量0（對(duì)照組）1.00±0.051.00±0.060.35±0.031.20±0.08400.75±0.040.70±0.050.50±0.040.95±0.07800.50±0.030.45±0.040.70±0.050.70±0.061600.25±0.020.20±0.031.00±0.060.40±0.05從圖3和表5數(shù)據(jù)可以看出，隨著姜黃素濃度的增加，MMP-2和MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著下降（P<0.01）。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，它們能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的成分，如Ⅳ型膠原和明膠等，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的降低，表明姜黃素可能通過抑制這兩種蛋白酶的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制EC-9706細(xì)胞的侵襲和遷移能力。E-cadherin是一種上皮細(xì)胞黏附分子，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞表面，其表達(dá)水平的降低與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)；N-cadherin主要表達(dá)于神經(jīng)嵴來源的細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，在腫瘤發(fā)生過程中，上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）時(shí)，E-cadherin表達(dá)減少，N-cadherin表達(dá)增加，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著姜黃素濃度的增加，E-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白表達(dá)均顯著增加（P<0.01）；N-cadherin蛋白的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組N-cadherin蛋白表達(dá)均顯著下降（P<0.01）。這表明姜黃素可能通過調(diào)節(jié)E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)，抑制EC-9706細(xì)胞發(fā)生EMT，從而降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力。對(duì)姜黃素濃度與MMP-2、MMP-9、E-cadherin和N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，姜黃素濃度與MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.978（P<0.01）；與MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.985（P<0.01）；與E-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.982（P<0.01）；與N-cadherin蛋白相對(duì)表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.975（P<0.01）。這進(jìn)一步說明姜黃素對(duì)與侵襲、遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用具有明顯的劑量依賴性，通過調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9、E-cadherin和N-cadherin等蛋白的表達(dá)，抑制人食管癌EC-9706細(xì)胞的侵襲和遷移能力。六、姜黃素影響EC-9706細(xì)胞的信號(hào)通路探究6.1相關(guān)信號(hào)通路分析6.1.1Wnt/beta-catenin通路Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。在正常生理狀態(tài)下，該通路處于相對(duì)穩(wěn)定的調(diào)控狀態(tài)。Wnt配體是一類分泌型糖蛋白，當(dāng)Wnt信號(hào)未激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin會(huì)與由Axin、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等組成的降解復(fù)合物結(jié)合。在這個(gè)復(fù)合物中，GSK-3β能夠使β-catenin的N端多個(gè)絲氨酸/蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化，磷酸化后的β-catenin被泛素化標(biāo)記，進(jìn)而被蛋白酶體識(shí)別并降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的低水平狀態(tài)。此時(shí)，β-catenin主要位于細(xì)胞膜上，與E-cadherin結(jié)合，參與細(xì)胞間的黏附作用，維持細(xì)胞的正常形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt配體與細(xì)胞膜上的卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)z）受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）共受體結(jié)合，形成Wnt-Fz-LRP5/6復(fù)合物。這一復(fù)合物的形成會(huì)招募Dishevelled（Dvl）蛋白到細(xì)胞膜上，Dvl蛋白被激活后，會(huì)抑制GSK-3β的活性，從而破壞β-catenin降解復(fù)合物的功能。β-catenin不再被磷酸化和降解，在細(xì)胞質(zhì)中逐漸積累。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin濃度升高到一定程度時(shí)，它會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。結(jié)合后的復(fù)合物能夠招募一系列轉(zhuǎn)錄共激活因子，如B細(xì)胞淋巴瘤-9（BCL9）、Pygopus等，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因包括c-myc、CyclinD1、MMP-7等，它們參與細(xì)胞增殖、周期調(diào)控、侵襲轉(zhuǎn)移等過程。c-myc是一種原癌基因，它的表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長；CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白，在細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達(dá)增加會(huì)加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞分裂；MMP-7是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，有助于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在人食管癌EC-9706細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路常常處于異常激活狀態(tài)。研究表明，該通路的異常激活與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。通過檢測發(fā)現(xiàn)，EC-9706細(xì)胞中β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累明顯增加，同時(shí)下游靶基因c-myc、CyclinD1、MMP-7等的表達(dá)也顯著上調(diào)。這導(dǎo)致EC-9706細(xì)胞呈現(xiàn)出異常的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。姜黃素能夠?qū)nt/β-catenin信號(hào)通路起到抑制作用。在對(duì)EC-9706細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理后，細(xì)胞內(nèi)β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累顯著減少。這可能是因?yàn)榻S素抑制了Wnt信號(hào)通路的激活，使得β-catenin的降解過程恢復(fù)正常，從而降低了其在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的濃度。姜黃素還能夠下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游相關(guān)基因的表達(dá)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)姜黃素處理后的EC-9706細(xì)胞中，c-myc、CyclinD1、MMP-7等基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯下降。c-myc基因表達(dá)的下調(diào)，能夠抑制細(xì)胞的過度增殖；CyclinD1表達(dá)的降低，會(huì)使細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，抑制細(xì)胞分裂；MMP-7表達(dá)的減少，有助于減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。姜黃素可能通過抑制Wnt信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的磷酸化水平來發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠降低Dvl蛋白的磷酸化水平，使其活性受到抑制，進(jìn)而阻斷了Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)，最終抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活以及下游基因的表達(dá)。姜黃素通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減少β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累，下調(diào)下游相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制人食管癌EC-9706細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，發(fā)揮其抗癌作用。這為進(jìn)一步理解姜黃素的抗癌機(jī)制以及食管癌的治療提供了重要的理論依據(jù)。6.1.2其他可能的信號(hào)通路除了Wnt/β-catenin信號(hào)通路外，PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞生長、存活、增殖和代謝等過程中也起著關(guān)鍵作用，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在正常細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，它能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種第二信使，能夠招募蛋白激酶B（Akt）到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的Akt可以通過磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。Akt可以磷酸化糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β），使其活性受到抑制。GSK-3β在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，其被抑制后，會(huì)影響細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。Akt還可以激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和代謝等過程。激活的mTOR會(huì)促進(jìn)核糖體的生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路常常發(fā)生異常激活。在人食管癌EC-9706細(xì)胞中，也存在PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，EC-9706細(xì)胞中PI3K的活性升高，Akt的磷酸化水平明顯增加，下游相關(guān)蛋白如mTOR、GSK-3β等的活性也相應(yīng)改變。這導(dǎo)致細(xì)胞呈現(xiàn)出過度增殖、抗凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)等惡性生物學(xué)行為。姜黃素可能通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來發(fā)揮其對(duì)EC-9706細(xì)胞的作用。在相關(guān)研究中，用姜黃素處理EC-9706細(xì)胞后，檢測發(fā)現(xiàn)PI3K的活性受到抑制，PIP3的生成減少。這使得Akt無法被有效招募到細(xì)胞膜上并磷酸化激活，從而導(dǎo)致Akt的磷酸化水平降低。Akt磷酸化水平的降低，使得其下游底物的磷酸化也受到影響。GSK-3β的活性得以恢復(fù)，抑制了細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，抑制了細(xì)胞的增殖。mTOR的活性也受到抑制，減少了蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞的生長和增殖。姜黃素還可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)的上游分子或信號(hào)節(jié)點(diǎn)，間接影響該信號(hào)通路的活性。姜黃素可能作用于生長因子受體，抑制其與配體的結(jié)合或受體的磷酸化，從而減少PI3K的激活?；蛘呓S素可能影響一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的表達(dá)或活性，這些分子參與PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控，進(jìn)而間接抑制該信號(hào)通路的激活。NF-κB信號(hào)通路是一種重要的炎癥和免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路，在腫瘤細(xì)胞中也常常處于激活狀態(tài)。在正常情況下，NF-κB以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，與抑制蛋白IκB結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如細(xì)胞因子、脂多糖（LPS）、紫外線等，會(huì)激活I(lǐng)κB激酶（IKK）。IKK能夠使IκB磷酸化，磷酸化后的IκB被泛素化標(biāo)記，進(jìn)而被蛋白酶體降解。NF-κB得以釋放，并進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。這些基因包括炎癥因子（如IL-6、TNF-α等）、抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）以及與細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)的蛋白（如MMP-9、VEGF等）。IL-6和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)上調(diào)，會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移；Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表達(dá)增加，能夠抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞得以存活；MMP-9和VEGF等蛋白的表達(dá)升高，有助于腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在人食管癌EC-9706細(xì)胞中，NF-κB信號(hào)通路也存在異常激活的情況。研究表明，EC-9706細(xì)胞中NF-κB的活性較高，其下游相關(guān)基因的表達(dá)也明顯上調(diào)。姜黃素可能通過抑制NF-κB信號(hào)通路來抑制EC-9706細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。用姜黃素處理EC-9706細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)IKK的活性受到抑制，IκB的磷酸化和降解減少。這使得NF-κB無法有效釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制了NF-κB與DNA的結(jié)合，減少了下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)下調(diào)，減輕了炎癥反應(yīng)，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移；Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表達(dá)降低，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡；MMP-9、VEGF等與細(xì)胞侵襲和血管生成相關(guān)蛋白的表達(dá)減少，抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。姜黃素還可能通過調(diào)節(jié)其他與NF-κB信號(hào)通路相互作用的信號(hào)分子或通路，協(xié)同抑制NF-κB信號(hào)通路的激活。姜黃素可能影響MAPK信號(hào)通路，MAPK信號(hào)通路與NF-κB信號(hào)通路之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系。姜黃素抑制MAPK信號(hào)通路的激活，可能會(huì)間接影響NF-κB信號(hào)通路的活性，從而發(fā)揮其對(duì)EC-9706細(xì)胞的抑制作用。姜黃素對(duì)人食管癌EC-9706細(xì)胞的作用可能涉及PI3K/Akt、NF-κB等多種信號(hào)通路。通過抑制這些信號(hào)通路的激活，姜黃素能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程，發(fā)揮其抗癌作用。進(jìn)一步深入研究姜黃素對(duì)這些信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，將有助于全面揭示姜黃素的抗癌作用機(jī)制，為食管癌的治療提供更多的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。6.2實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與結(jié)果6.2.1Westernblotting檢測關(guān)鍵蛋白為了進(jìn)一步驗(yàn)證姜黃素對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響，采用Westernblotting技術(shù)檢測Wnt/β-catenin、PI3K/Akt和NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白表達(dá)。將對(duì)數(shù)生長期的人食管癌EC-9706細(xì)胞接種于6孔板，每孔1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)待細(xì)胞貼壁。設(shè)置對(duì)照組和不同濃度姜黃素實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入不含姜黃素的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L的姜黃素溶液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞并提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品與5×loadingbuffer按4:1比例混合，100℃煮沸10分鐘使蛋白變性。隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)目的蛋白分子量大小配制合適濃度的分離膠和5%濃縮膠。將等量的蛋白樣品上樣，濃縮膠80V電泳30分鐘，分離膠120V電泳60-90分鐘，使蛋白充分分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕法轉(zhuǎn)膜，恒流300mA轉(zhuǎn)膜90分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PV