高鐵-硫酸顯色法測定血清總膽固醇

血清膽固醇(CHOL)測定方法種類繁多，化學(xué)方法大都用有機溶劑提取血清中的CHOL，用特殊試劑顯色，然后比色測定。主要顯色反應(yīng)有Liebermann—Burchard(L-B)反應(yīng)及高鐵—硫酸反應(yīng)等兩類。這些方法須用腐蝕性的濃酸試劑，特異性差，干擾因素多，準(zhǔn)確測定有賴于從血清中提取膽固醇，并對抽提液進(jìn)行純化。因此操作步驟多，不適于常規(guī)應(yīng)用。

美國疾病控制中心(CDC)脂類測定標(biāo)準(zhǔn)化實驗室所審定的ALBK(Abell-Levy-Brodie-Kendall)法，由于抽提液中基本上不存在L-B反應(yīng)的干擾物，結(jié)果準(zhǔn)確，為目前國際上通用的參考方法。此法雖然不很復(fù)雜，但也不易準(zhǔn)確掌握?，F(xiàn)在還有少數(shù)實驗室應(yīng)用L—B試劑直接顯色法、鄰苯二甲醛法等，準(zhǔn)確性差，已在淘汰之列。

化學(xué)測定法通常需抽提純化。顯色劑主要有兩類：①醋酸-醋酐-硫酸②高鐵硫酸。

這些顯色反應(yīng)須用強酸試劑，干擾因素多，準(zhǔn)確測定有賴于從標(biāo)本中抽提、皂化、純化過程，因而操作較繁，不適于分析大批量標(biāo)本，且不適于自動分析。

特點：

1．Liberman-Burchard反應(yīng)

1885年Liberman發(fā)現(xiàn)膽固醇在硫酸、醋酐溶液中顯色，1890年Burchard用此反應(yīng)測定膽固醇稱為L-B反應(yīng)。

1953年Zak提出用硫酸、醋酸和Fe3+等與膽固醇作用生成紫紅色化合物來測定膽固醇，稱為Zak反應(yīng)。2．Zak反應(yīng)【目的要求】1.掌握血漿膽固醇總量的測定方法，包括脂溶性物質(zhì)的定量提取，使用易燃有機溶劑的注意事項及膽固醇的顯色。2.熟悉測定原理及影響因素。3.了解血漿膽固醇總量的正常范圍及臨床意義。【實驗原理】

用異丙醇沉淀血清蛋白質(zhì)，提取上清液中的膽固醇，再用氧化鋁吸附膽紅素、磷脂、甘油等干擾物，離心后于上清液中加入高鐵-硫酸試劑，反應(yīng)產(chǎn)物顯紫紅色，其顯色程度與TC成都成正比?！静僮鳌?.提取純化分別吸取血清和標(biāo)準(zhǔn)液200ul，加至帶塞的離心管中，在向離心管底部加入異丙醇5ml，是蛋白質(zhì)沉淀，然后加入氧化鋁1g，與振蕩器上混合10min，2000r/min離心10min.2.顯色分別取上清液1ml,分別加入到測定管和標(biāo)準(zhǔn)管，空白管加異丙醇1ml,56度水浴5min，再沿管壁加入顯色劑3ml，充分混勻，水浴保溫25min,冷卻至室溫比色。3.比色在540nm處，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度?！居嬎恪垦錞C=A測/A標(biāo)*5.17mmol/L血清參考值3.0-5.2mmol/L【注意事項】1.抽提液與顯色液混合時產(chǎn)生大量的熱，影響顯色反應(yīng)。（1）在測定同一批標(biāo)本是選用型號一致的試管，口徑大的試管便于快速混合。（2）加入顯色劑時，應(yīng)使之與異丙醇分兩層，然后迅速混合，是完全顯色。（3）顯色劑要逐管加入快速混合，不可成批加入。2.反應(yīng)中所用試管和比色杯應(yīng)清潔干燥。3.防止?jié)饬蛩嵛绊?/p>