血清谷—丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定（改良賴氏法）1.掌握血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定的基本原理。2.熟悉血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定的具體操作方法。3.了解血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定的臨床意義。目的要求血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用于由丙氨酸及a一酮戊二酸組成的基質(zhì)。產(chǎn)生丙酮酸及谷氨酸血清加基液保溫后產(chǎn)生丙酮酸的多少，即反應(yīng)出谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的大小。丙酮酸與2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在酸性溶液中顯黃色，在堿性溶液中成醌型顯棕紅色。實(shí)驗(yàn)原理血清中的谷-丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的條件下，可催化基質(zhì)（底物）液中的丙氨酸與α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：

生成的丙酮酸可與起終止和顯色作用的2,4二硝基苯肼發(fā)生加成反應(yīng)，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，進(jìn)而在堿性環(huán)境中生成紅棕色的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與丙酮酸的生成量，亦即與ALT活性的高低成正比關(guān)系。據(jù)此與同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液相比較，便可算出或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出血清中ALT的活性。

盡管基質(zhì)液中余下的a-酮戊二酸同樣可生成紅棕色苯腙硝醌化合物而影響測(cè)定結(jié)果，但因其量不多，加之對(duì)505nm的吸光度遠(yuǎn)不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物強(qiáng)，尤其用標(biāo)準(zhǔn)曲線作測(cè)定時(shí)，所用的酶活性單位通過(guò)卡門(mén)氏分光光度速率法矯正，擯棄了賴氏法一些固有弊端，結(jié)果比其他比色法準(zhǔn)確。故衛(wèi)生部臨檢中心建議國(guó)內(nèi)無(wú)條件使用連續(xù)監(jiān)測(cè)法的單位使用賴氏法。1981年全國(guó)常規(guī)生化檢驗(yàn)方法學(xué)術(shù)討論會(huì)認(rèn)為賴氏法測(cè)定ALT活性較為合理，全國(guó)肝炎協(xié)作會(huì)議也建議統(tǒng)一使用改良賴氏法。本實(shí)驗(yàn)是在堿性條件下，生成醌類化合物的量反應(yīng)丙酮酸的量，即反應(yīng)了谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性。求酶活性單位的方法：

1、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照法：檢品與標(biāo)準(zhǔn)丙酮酸液同樣處理呈色，進(jìn)行比色，計(jì)算出酶活性單位。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線法：取含待測(cè)物的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得活性單位。取干凈試管12支，按下表所示標(biāo)號(hào)，要求各S管和U管進(jìn)行雙管平行操作。先做對(duì)照管和測(cè)定管，在30min保溫期間再做空白管和標(biāo)準(zhǔn)管。1.賴氏法測(cè)定ALT的標(biāo)準(zhǔn)曲線(即劑量反應(yīng)曲線)在坐標(biāo)紙上以上表中An－A0之值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的酶活性的卡門(mén)氏單位為橫坐標(biāo)作圖，即得賴氏法測(cè)定ALT的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.標(biāo)本中ALT活性結(jié)果查標(biāo)準(zhǔn)曲線利用測(cè)定所得的吸光度結(jié)果(AU－AB)，便可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得標(biāo)本的ALT結(jié)果5-25卡門(mén)單位

參考范圍⑴常溫下標(biāo)本不宜久置，采血4個(gè)小時(shí)內(nèi)應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。⑵嚴(yán)重脂血、黃疸、溶血和糖尿病酮癥酸中毒病人血清標(biāo)本可增加測(cè)定的吸光度，測(cè)定這類標(biāo)本應(yīng)做血清標(biāo)本對(duì)照管。⑶當(dāng)標(biāo)本的酶活力超過(guò)150K氏單位時(shí)，應(yīng)將血清用0.145mol/L氯化鈉液稀釋重做，其結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。注意事項(xiàng)⑷α-酮戊二酸，2,4-二硝基苯肼是直接顯色物,NaOH的濃度與顯色深淺有關(guān),因此它們的濃度必須很準(zhǔn)確。操作中加0.4NNaOH液時(shí)，需以較慢速度加入，并且邊加邊搖勻加快時(shí)則a一戊酮二酸引起的發(fā)色增強(qiáng)。⑸丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度要求十分精確。由于丙酮酸開(kāi)封后易變質(zhì)為多聚丙酮酸，而影響丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液的有效濃度而不易察覺(jué)。建議使用質(zhì)量可靠的市售丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液。⑹加入2,4-二硝基苯肼溶液后應(yīng)充分混勻，使反應(yīng)完全。

⑺保溫溫度、作用時(shí)間、加入試劑的方式方法、速度和時(shí)間間隔都應(yīng)準(zhǔn)確掌握。建議將試管架置37℃水浴中操作。從第一管加液混勻后開(kāi)始計(jì)時(shí)，以一定時(shí)間間隔、加液方式和混勻方式依次向各管加入基質(zhì)液；當(dāng)?shù)谝还鼙剡_(dá)到30min時(shí)，即刻以加基質(zhì)液相同的時(shí)間間隔和加液、混勻方式，依次又向各管加入2,4-二硝基苯肼，如是操作，直到做完本實(shí)驗(yàn)。⑻每批試劑的空白管吸光度上下波動(dòng)不應(yīng)超過(guò)0.015A，若有超出，應(yīng)仔細(xì)檢查試劑與儀器方面的問(wèn)題。【方法評(píng)價(jià)】ALT活性測(cè)定主要有兩類。一是卡門(mén)氏（Karman）分光光度法，測(cè)定的是酶促反應(yīng)速率。其原理如下：由于NADH在波長(zhǎng)340nm處有特異吸收峰，因此ALT的活性可通過(guò)NADH的減少量，亦即通過(guò)340nm吸光度的減少量間接作出定量測(cè)定。這一方法特異性、準(zhǔn)確性高。但是此法除要加入待測(cè)酶ALT的底物外，還需要加入指示酶LDH及其輔酶NADH，又需用紫外分光光度計(jì)，因此不易為一般臨床化驗(yàn)室推廣。

二是比色測(cè)定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun

法）和賴氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、試劑、操作步驟及作用溫度等完全相同。不同之處在于作用時(shí)間：King法60min，Mohun法和Reiman法30min。因此它們的單位定義和標(biāo)準(zhǔn)曲線制備也不同。

King法單位定義是：每1ml血清在37℃條件下與底物作用60min，生成1μmol丙酮酸稱為一個(gè)單位。

Mohun法單位定義是：每毫升血清在pH=7.4，37℃條件下與底物作用30min，每生成2.5微克丙酮酸為1單位。賴氏法沒(méi)有制定自身的單位定義，而是以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)套用速率法的卡門(mén)氏單位作表示的。1個(gè)卡門(mén)氏單位的定義是：在溫度25℃，pH7.4，波長(zhǎng)340nm，光徑1cm的條件下，每分鐘1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的轉(zhuǎn)氨酶活性。若將卡門(mén)氏單位的定義條件代入國(guó)際單位計(jì)算公式，即得卡門(mén)氏單位與國(guó)際單位的換算關(guān)系：1卡門(mén)氏單位=0.4821IU/L(25℃)，便可將卡門(mén)氏單位兌換成國(guó)際單位。改原賴氏法的反應(yīng)溫度(40℃改為37℃)和底物濃度(改為低濃度)的改良賴氏法，對(duì)卡門(mén)氏單位的科學(xué)套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其結(jié)果與速率法較為一致，能較好反映酶的真實(shí)活性。由于賴氏法設(shè)計(jì)的底物濃度,如a-酮戊二酸不足，反應(yīng)速度只能達(dá)到最大速度的65%；顯色劑2,4-二硝基苯肼的用量只及反應(yīng)液中酮酸濃度的一半；保溫30min的酶促反應(yīng)后，新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在著無(wú)法人為控制的競(jìng)爭(zhēng)顯色的幾率問(wèn)題，產(chǎn)物旁路效應(yīng)，使賴氏法的重現(xiàn)性較差，在測(cè)量精度上仍與連續(xù)監(jiān)測(cè)法相差甚大。

肝細(xì)胞中含ALT最豐富，因此當(dāng)肝臟疾病致肝細(xì)胞受損傷時(shí)，ALT即大量釋放入血液，致使血清中ALT活性增高。測(cè)定ALT是檢查肝功能的重要指標(biāo)之一。ALT顯著增高見(jiàn)于