實驗二十碘淀粉比色法測定血清淀粉酶α-淀粉酶（α-Amylase，AMY或AMS）即1，4-α-D-葡萄糖4-葡聚糖水解酶，作用于多糖分子α-1，4糖苷鍵，生成麥芽糖和葡萄糖。淀粉酶在人體內(nèi)的分布很廣，主要存在于胰腺和唾液腺中，對食物中多糖化合物的消化起重要作用。

AMY有兩種同工酶，即同工酶P（來源于胰腺），及同工酶S（來源于唾液腺及其它組織），又可以分為多種亞型，S1、S2、S3、S4、和P1、P2、P3，淀粉酶分子量小，可以從腎小球濾過出現(xiàn)在尿液中。有時淀粉酶與抗淀粉酶自身抗體形成高分子復(fù)合物，稱為巨型淀粉酶。血清淀粉酶增高對急性胰腺炎有診斷價值。多年來，由于它的測定方法簡單，快速，一直被用于胰腺炎的診斷和急腹癥的鑒別診斷，但其總酶活力測定缺乏靈敏性和特異性，而其同工酶分析則有助于克服這些缺點。淀粉酶活性測定方法大致分為粘度測量法、比濁法、碘量法、糖化法和染料釋放法5種，其中碘淀粉比色法操作簡便，結(jié)果可靠在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。目前國內(nèi)外臨床實驗室應(yīng)用較多的是以麥芽多糖為底物的方法，如2-氯-對硝基苯麥芽三糖苷（CNP-G3）和亞乙基封閉的對硝基苯麥芽庚糖苷（4NP-G7）法（亦稱EPS法），以后者最常用，也是IFCC的推薦方法。1．反應(yīng)原理4NP-G7AMY4NP-G4,3,2+G5,4,34NP-G4,3,2α-葡萄糖苷酶4NP-G4+G+4NP

式中G為葡萄糖，4NP為對硝基酚（黃色）。對硝基苯酚的生成量在一定范圍內(nèi)與AMY活性成正比，在405nm可以進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測即可測出AMY的活性。使用2-氯-4-硝基苯-麥牙三糖(G3-CNP)作底物直接測定淀粉酶也有多篇文獻(xiàn)報道，該法延滯時間較短，CNP的摩爾消光系數(shù)不易受pH的影響，C3-CNP法更符合IFCC提出的理想Amy測定方法的條件，但因受內(nèi)源性葡萄糖苷酶的干擾，而且使用NaN3或KSCN可能導(dǎo)致α-淀粉酶的異構(gòu)，同時帶來其它一些不利因素，被IFCC拒絕成為參考方法。新底物2-氯-4-硝基苯-o-半乳糖-麥芽糖苷(Cal-G2-α-CNP)，與G3-CNP相比，在非還原性末端用半乳糖代替葡萄糖，從而避免了內(nèi)源性葡萄糖苷酶的影響。實驗在試劑中加入α葡萄糖苷酶對結(jié)果無影響，證明可以避免內(nèi)源性葡萄苷酶的干擾。由于血清中淀粉酶存在起源于胰腺P和唾液腺S的兩種同工酶，它們對同一底物Km不同。曾對一唾液樣品測定Km，測得Km＝1．44，明顯高于急性胰腺炎血清標(biāo)本。說明在該系統(tǒng)下測定S型淀粉酶時，底物濃度不足，認(rèn)為加入154mmol／L的NaN3對兩種同工酶具有相同的激活作用，但NaN3可能對α淀粉酶有異構(gòu)作用，故本文建議不加入NaN3?？紤]價格因素也不增加底物濃度，這樣更能反映淀粉酶對急生胰腺炎的診斷價值。

本法不需要輔助酶，不受內(nèi)源性葡萄糖苷酶的干擾，延滯時間短，線性范圍寬，試劑穩(wěn)定性好，不失為測定淀粉酶的理想方法。

【原理】

血清中α淀粉酶催化淀粉分子中α-1，4糖苷鍵水解，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖及含有α-1，6糖苷鍵支鏈的糊精。在底物過量的條件下，反應(yīng)后加入碘液與未被水解的淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物，其藍(lán)色的深淺與未經(jīng)酶促反應(yīng)的空白管比較，從而推算出淀粉酶的活力單位?！静僮鳌?.血清先用生理鹽水作10倍稀釋。0.1ml血清＋0.9ml蒸餾水。加入物(ml)測定管對照管緩沖淀粉溶液(37度預(yù)溫5min)1.0

1.0血清－

0.2

37度水浴7.5min碘應(yīng)用液1.0

1.0蒸餾水6.26.02.混勻，以波長660nm，蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。單位定義100ml血清中的淀粉酶，在37度15min水解淀粉5mg為1個單位?！居嬎恪康矸勖福娇瞻坠芪舛龋瓬y定管吸光度/空白管吸光度*0.4/5*15/7.5*100/0.02如進(jìn)行時間進(jìn)程曲線其相應(yīng)的時間應(yīng)取不同的值?！緟⒖挤秶垦?0-180，尿液100-1200【臨床意義】淀粉酶可通過腎小球濾過。流行性腮腺炎，特別是急性胰性炎時，血和尿中的AMY顯著增高，急性胰腺炎發(fā)病后8-12小時血清AMY開始增高，12-24小時達(dá)高峰，2-5天下降至正常。如超過500U有意義，達(dá)350U時應(yīng)懷疑此病。而尿AMY約于發(fā)病后12-24小時開始升高，維持時間較長，連續(xù)增高時間可達(dá)1－2周，下降也比血清AMY慢，因此，在急性胰腺炎后期測定尿AMY更有價值。急性闌尾炎、腸梗阻、胰腺癌、膽石癥、潰瘍病穿孔及嗎啡注射后等均可見血清AMY增高，但常低于500U。唾液腺疾病如腮腺炎患者血AMY也可升高，但臨床上不難鑒別，且主要為S-AMY升高，有別于胰腺炎以P-AMY升高為主。進(jìn)一步測定AMY同工酶，發(fā)現(xiàn)在腮腺、骨骼肌、輸卵管、子宮、胃和肺內(nèi)并無P-AMY，只含S-AMY，而胰腺內(nèi)無S-AMY，只含P-AMY。因此，上述組織損傷時，血液中必然有不同的同工酶水平升高。由于正常人血清中AMY主要由肝產(chǎn)生，故血清與尿中AMY同時減低主要見于肝炎、肝硬化、肝癌及急性和慢性膽囊炎等。腎功能障礙時，血清AMY也可降低?！咀⒁馐马棥?,酶活性在400U以下時，與底物的水解量成線性，如測定管吸光度小于空白管吸光度一半時，應(yīng)加大血清稀釋倍數(shù)或減少稀釋血清加入量，測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)2,草酸鹽、枸椽酸鹽、EDTA-NA2及氟化鈉對AMY活性有抑制作用，肝素?zé)o抑制作用。3，唾液含有高濃度淀粉酶，須防止帶入。4，淀粉產(chǎn)品不同，其空白吸光度可有明顯差異，一般空白吸光度應(yīng)在0.4以上。5，緩沖淀粉溶液若出現(xiàn)混濁或絮狀物，表示緩沖淀粉溶液受污染或變質(zhì)，不能再用，應(yīng)重新配制。6，本法亦適用于其他體液淀粉的測定，尿液先作20倍稀釋后測定?！驹u價】

本法線性范圍＜400U，批內(nèi)3.1-9.0%，批間12.4-15.1%，與對-硝基苯麥芽庚糖苷法比較，在酶活性低時相關(guān)性較好，但酶活性較高時相關(guān)性差，因此，該法不能認(rèn)為是淀粉酶測定的理想方法，但由于該法簡單，易行，不需特殊設(shè)備，試劑價廉，仍然為我國目前應(yīng)用較為廣泛的方法。1、比色法測乳酸脫氫酶正向反應(yīng)生成的丙酮酸與溶于酸的2，4二硝基苯肼作用生成丙酮酸－二硝基苯腙，后者在酸性環(huán)境中呈草黃色，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色的深淺與丙酮酸的濃度成正比，與標(biāo)準(zhǔn)濃度的丙酮酸生成的苯腙進(jìn)行比色，可推算LDH的活力。

單位定義：以100ml血清，37度，作用底物15min，產(chǎn)生1umol丙酮酸為一個金氏單位。2、血清谷—丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測定（改良賴氏法）

血清中的谷-丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的條件下，可催化基質(zhì)（底物）液中的丙氨酸與α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸，丙酮酸可與起終止和顯色作用的2,4二硝基苯肼發(fā)生加成反應(yīng)，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，進(jìn)而在堿性環(huán)境中生成紅棕色的苯腙硝醌化合物，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與丙酮酸的生成量，亦即與ALT活性的高低成正比關(guān)系。據(jù)此與同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液相比較，便可算出或通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查出血清中ALT的活性。1個卡門氏單位的定義是：在溫度25℃，pH7.4，波長340nm，光徑1cm的條件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的轉(zhuǎn)氨酶活性?？梢娍ㄩT氏單位不是用物質(zhì)的量濃度，而是用物質(zhì)的吸光度表示酶的活性單位的。3、血清堿性磷酸酶的磷酸苯二鈉法測定堿性磷酸酶在堿性環(huán)境中作用于磷酸苯二鈉，使之水解釋放出酚和磷酸。酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化形成紅色醌類化合物，根據(jù)紅色的深淺確定ALP活性。單位定義：100ml血清在3