(10)授權(quán)公告號CN105925538BGO1NGO1N33/577(2006.01)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)白楊街道銀海街550號(72)發(fā)明人蘇娟陳東高飛andCharacterizationofMonocAntibodiesSpecificfo.2016,第35卷(第1期),48-51頁.(特殊普通合伙)33240雜交瘤細胞株及其產(chǎn)生的抗合成大麻單克隆抗體和應(yīng)用本發(fā)明涉及雜交瘤細胞株及其產(chǎn)生的抗合名為雜交瘤細胞株3G8.1,保藏編號為C20163抗合成大麻單克隆抗體由上述雜交瘤細胞株或合成大麻單克隆抗體在制備檢測合成大麻的膠加樣區(qū)金剛烷胺鼠單抗21.一種抗合成大麻單克隆抗體在制備用于檢測JWH-018和JWH-073試劑盒中的應(yīng)用，上述抗合成大麻單克隆抗體由雜交瘤細胞株3G8.1或其傳代細胞株分泌產(chǎn)生，該雜交瘤細胞株3G8.1保藏編號為CCTCCNo.C201635;在制備雜交瘤細胞株過程中采用的抗原是合成大2.一種抗合成大麻單克隆抗體在制備用于檢測JWH-018和JWH-073膠體金免疫診斷試紙條中的應(yīng)用，上述抗合成大麻單克隆抗體由雜交瘤細胞株3G8.1或其傳代細胞株分泌產(chǎn)生，該雜交瘤細胞株3G8.1保藏編號為CCTCCNo.C201635;在制備雜交瘤細胞株過程中采用的抗原是合成大麻抗原JWH-018-BGG。3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于檢測閾值均能達到50ng/ml以下。3技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗合成大麻的雜交瘤細胞株及其制備方法和背景技術(shù)(Zohai),在吸食后會產(chǎn)生與大麻相若的興奮反應(yīng)。[0003]目前市面上主要有4種合成大麻成分：JWH-018、JWH-073、HU-210、CP47,497等共4[0004]JWH-018中文名稱1-戊基-3-(1-萘甲?；?吲哚，英文名稱1-Pentyl--3-(1-naphthoyl)indole,分子式C24H23NO,分子量341.4455,CASRN209414-07-3的分子結(jié)構(gòu)式如式(I)所示，大麻的結(jié)構(gòu)如式(II)所示。[0006]JWH-018最初是由ClemsonUniversity的JohnW.Huffman合成的大麻同型物。JWH-018(類似于THC),可以使人興奮，開心以及全身放松等效果。比起傳統(tǒng)四氫大麻酚(THC),JWH-018在作用于CB1的同時,更能刺激CB2,因此不但能比四氫麻酚(THC)快速4倍起他草藥混合作為焚香銷往全球。[0007]JWH-073中文名稱：1-丁基-3-(1-萘甲?；?吲哚，英文名稱：1-Butyl-3-(1-naphthoyl)indoleor(1-Butyl-1H-indol-3-yl)-1-naphthalenylmethanone分子式：C23H21NO,分子量：327.42,CASRN208987-48-8.所述JWH-073的分子結(jié)構(gòu)式如式(III)所4是CB1的5倍)起到致幻作用。[0010]通過雜交瘤技術(shù)可以制備抗合成大麻抗原雜交瘤細胞株。通過此雜交瘤細胞株制備出的抗體可以用于制備膠體金免疫診斷試紙條，實現(xiàn)了在現(xiàn)場對吸毒人員快速檢測的要發(fā)明內(nèi)容[0011]本發(fā)明的第一個目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種抗合成大麻的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株能產(chǎn)生高效價的抗合成大麻的抗體，能夠特異結(jié)合JHW-018和JWH-[0012]一種分泌抗合成大麻的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株3G8.1,已于2016年3月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection,簡稱CCTCC),保藏編號為CCTCCNo.C201635;中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學保藏中心(武漢大學第一附屬小學對面)。[0013]本發(fā)明采用小劑量肌肉注射免疫方法和尾靜脈免疫相結(jié)合的方法，用合成大麻抗原JWH-018-BGG注射小鼠，獲得免疫的小鼠脾細胞，進而將免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，用JWH-018篩選從而獲得所述雜交瘤細胞株。[0014]JWH-018本身的分子量太小，不具有免疫原性，即缺乏T細胞表位而無法直接誘導動物機體產(chǎn)生特異性抗體，因此本發(fā)明對JWH-018進行化學修白)獲得能誘導B細胞的增殖和分化繼而產(chǎn)生特異性抗體的人工抗原。[0016]采用小劑量肌肉注射免疫方法和尾靜脈免疫相結(jié)合的方法免疫小鼠，免疫效價[0017]本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細胞株在制備用于檢測合成大麻的試紙條中的應(yīng)用。[0018]本發(fā)明的第二個目的是提供了一種抗合成大麻單克隆抗體，由所述雜交瘤細胞株[0019]本發(fā)明的第三個目的是提供了所述抗合成大麻單克隆抗體在制備合成大麻檢測試劑盒中的應(yīng)用；或上述抗合成大麻單克隆抗體在制備檢測合成大麻的膠體金免疫診斷試紙條中的應(yīng)用。[0020]進一步地，所述的用于檢測合成大麻的膠體金免疫診斷試紙條，包括樣品墊、標記物墊、反應(yīng)膜和吸樣墊；所述標記物墊包被有膠體金標記的所述抗合成大麻的單克隆抗體，所述反應(yīng)膜的檢測線(T線)處包被有合成大麻-牛血清白蛋白復合物，所述反應(yīng)膜的質(zhì)控線5(C線)處包被有二抗。[0021]本發(fā)明的試紙條也是以競爭抑制原理制備的，合成大麻-牛血清白蛋白復合物的包被量也是以所述抗合成大麻單克隆抗體對合成大麻的檢測限為宜。檢測時，若只有C線顯色，表示待測樣品中含有JWH-018或JWH-073且檢測合成大麻的含量高于檢測限；若C線和T和JWH-073;若C線和T線均不顯色，表示試紙條已經(jīng)失效。[0023]本發(fā)明利用JWH-018-BGG免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾細胞制備獲得雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株分泌的抗合成大麻的單克隆抗體效價高，特異性強，可用于對JWH-018和JWH-073進行快速、準確的免疫檢測和免疫分析。[0025]圖1為本發(fā)明一種合成大麻膠體金檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實施方式[0026]下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明做進一步詳細說明。[0027]實施例1雜交瘤細胞株的制備[0029]選擇8周齡的BALB/c雌鼠用JWH-018-BGG10μg與quickantibody-5w佐劑等體積混合成100μ1,注射小鼠后小腿肌肉；所述的后小腿肌肉部位為小鼠腿部暴露在外部有大塊肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮膚包裹，也可找到膝關(guān)節(jié)區(qū)分小腿大腿；兩周后[0031]取經(jīng)步驟(1)處理的BALB/c雌鼠的脾臟，研磨脾臟細胞至懸液；淋巴細胞懸液離[0033](3-1)飼養(yǎng)細胞制備：小鼠摘眼球處死，浸泡于75%酒精中消毒10min,撕開小鼠腹外皮膚，暴露其腹膜，用無菌注射器注入8mL37℃預熱的IMDM無血清培養(yǎng)基，輕揉小鼠腹得到飼養(yǎng)細胞懸液。[0034](3-2)小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的培養(yǎng)：把小鼠骨髓瘤細胞SP2/0用含體積分數(shù)為10%的FBS的IMDM培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)，細胞融合前一天進行傳代，以保證小鼠骨髓瘤細胞SP2/0適合生長狀態(tài)良好用于細胞融合。[0035](3-3)淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合：將調(diào)整濃度后的淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按細胞個數(shù)比為2:1混合均勻，1500rpm下離心洗滌細胞1次，去除上清液，輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀松動，置于37℃水浴，在90s內(nèi)緩緩加入1mL37℃預溫的1mLPEG1450,邊加邊輕微搖動；加入25ml37℃預溫的IMDM無血清培養(yǎng)基終止PEG作用；1000rpm下離心5min,取沉淀；然后在沉淀中加入步驟(3-1)制備的飼養(yǎng)細胞懸液，接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37℃,5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。[0036](4).雜交瘤細胞的融合篩選6[0038]步驟(3-3)中融合細胞在5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，換用1×HT的IMDM培續(xù)培養(yǎng)4天后，觀察96孔細胞培養(yǎng)板里的融合細胞生長情況，在細胞生長到細胞團簇(在16倍物鏡和10倍目鏡下觀察，細胞大小以占滿1/3視野為宜)時，吸取融合細胞培養(yǎng)上清液，采用間接ELISA方法篩選陽性克隆。[0039]間接ELISA方法的操作步驟是：[0040]①用pH9.6濃度為0.05M的碳酸鹽緩沖每孔中分別加入100μ1稀釋后的抗原，4℃包被過夜，用含0.05%tween20的PBS緩沖液洗板3[0041]②將PBS緩沖液加入到融合細胞培養(yǎng)上清液稀釋至25倍體積，然后在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100μ1稀釋后的融合細胞培養(yǎng)上清液，同時設(shè)立陰性對照，37℃反應(yīng)60分鐘后，用含0.05%tween20的PBS緩沖液洗板1次；[0042]③將PBS緩沖液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀釋到5000倍體積，然后在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100μ1稀釋后的羊抗鼠IgG-HRP,37℃反應(yīng)30分鐘后，用含0.05%tween20的PBS緩沖液洗板3次；[0043]④每孔加入50μ1底物TMB,37℃下反應(yīng)8分鐘；清液OD450值/陰性對照OD450值>2.5為陽性克隆，將篩選到的陽性克隆進一步地用競爭抑制ELISA方法進行復篩。[0046]競爭抑制ELISA方法的操作步驟是：[0047]①將50μ1濃度為50ng/ml的JWH-018標準品加入酶標孔中，再加入陽性克隆培養(yǎng)上清液同時設(shè)計空白對照，即先加入50μlPBS緩沖液再加入50μ1陽性克隆培養(yǎng)上清液到酶標孔中，37℃孵育60分鐘后，用含0.05%tween20的PBS緩沖液洗板1次；[0048]②將PBS緩沖液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀釋到5000倍體積，然后在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100μ1稀釋后的羊抗鼠IgG-HRP,37℃下孵育30分鐘，用含0.05%tween20的PBS緩沖液洗板3次；[0049]③每孔加入50μ1底物TMB,3結(jié)果如表1所示。[0052]表1各雜交瘤細胞株的競爭抑制ELISA結(jié)果細胞株競爭抑制OD值競爭抑制率7培養(yǎng)。[0055](4-3)雜交瘤細胞株3G8的克隆化[0056]雜交瘤細胞株3G8的克隆化培養(yǎng)按有限稀釋法進行，準確計數(shù)細胞，用含體積分數(shù)為15%的FBS的IMDM培養(yǎng)基稀釋成4個/mL的細胞懸液，然后以每孔200μ1接種到養(yǎng)板中，7天后觀察細胞生長情況，并檢測細胞培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng)上清液的抗體水平，選擇3個抗體效價最高的單克隆，再次做克隆化培養(yǎng)，直至單克隆孔抗體檢測陽性率達到100%;然后挑取單克隆細胞，命名為3G8.1,擴大培養(yǎng)后進行抗合成大麻單克隆抗體純化。[0057](5)抗合成大麻單克隆抗體純化[0058]取擴大培養(yǎng)后的雜交瘤細胞株3G8.1,接種1×106細胞于小鼠腹腔，10天后采集腹水。取12ml腹水，用2倍體積的PBS稀釋，再加入3倍體積的飽和硫酸銨，將得到混合液離心，[0059]實施例2抗合成大麻單克隆抗體的反應(yīng)活性測試[0060]采用間接ELISA方法檢測實施例1制備的抗合成大麻單克隆抗體的反應(yīng)活性，檢測步驟包括：①用pH9.6濃度為0.05M的碳酸鹽緩沖液稀釋JWH-018-BGG抗原至50n在96孔酶標板中分別加入100μ1/每孔稀釋后的抗原，4℃包被過夜；[0061]②用含0.05%tween20的PBS緩沖液洗板3次；然后加入100μ1濃合成大麻單克隆抗體溶液，做1:3稀釋，同時設(shè)立陰性對照，37℃反應(yīng)60分鐘后，用含0.05%tween20的PBS緩沖液洗板1次；[0062]③將PBS緩沖液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀釋到5000倍體積，然后在96孔細胞培養(yǎng)板中加入100μ1/每孔稀釋后的羊抗鼠IgG-HRP,37℃反應(yīng)30分鐘，用含0.05%tween20的PBS緩450nm測定其OD值，以抗合成大麻的單克隆抗體溶液0D450值/陰性對照OD450值>2