(10)授權(quán)公告號(hào)CN107589203B(65)同一申請(qǐng)的已公布的文獻(xiàn)號(hào)(43)申請(qǐng)公布日2018.01.16(73)專利權(quán)人黑龍江省科學(xué)院大慶分院地址163319黑龍江省大慶市高新區(qū)博學(xué)大街45號(hào)(72)發(fā)明人張旭高寶昌田媛石雨崔寶玉(74)專利代理機(jī)構(gòu)哈爾濱市偉晨專利代理事務(wù)所(普通合伙)23209代理人張?jiān)聦彶閱T黎作佳(54)發(fā)明名稱一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法(57)摘要本發(fā)明屬于植物成分檢測(cè)方法領(lǐng)域，具體涉及一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法。本發(fā)明將固相萃取-高效液相色譜法應(yīng)用到漢麻中大麻酚類化合物的檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物，并對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析。本發(fā)明首先確定高效液相色譜條件，通過(guò)對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測(cè)繪制三種大麻酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、確定線性回歸方程；再對(duì)漢麻樣品進(jìn)行固相萃取除雜，最后對(duì)樣品進(jìn)行高效液相檢測(cè)并通過(guò)計(jì)算得出漢麻中三種大麻酚類化合物的含量。本發(fā)明固相萃取將待測(cè)大麻酚類化合物與雜質(zhì)分離，減少雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響，為液相檢測(cè)提供了良好基礎(chǔ)。本發(fā)明檢21.一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法，其特征在于該方法二、配制混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：配制同時(shí)含有相同質(zhì)量濃度的三種大麻酚類化合物CBD、三、確定線性回歸方程：將步驟二配制的各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次采用步驟一高效液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，根據(jù)各濃度所測(cè)峰面積的大小與其濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分別確定三種大麻酚類化合物的線性回歸方程，所述三種大麻酚類化合物的線性回歸方程為：其中：Y為大麻酚類化合物所對(duì)應(yīng)的峰面積，X為大麻酚類化合物的質(zhì)量濃度，n為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的不同混合標(biāo)準(zhǔn)品濃度取值個(gè)數(shù)，R2為線性相關(guān)性系數(shù)；四、制備固相萃取預(yù)處理樣品：將漢麻樣品進(jìn)行干燥粉碎處理，取漢麻樣品粉末于離心管并加入甲醇，采用超聲協(xié)助萃取漢麻樣品粉末中的大麻酚類化合物；離心處理萃取液并取上清液以甲醇定容，得到固相萃取預(yù)處理樣品；五、固相萃取：采用保留干擾物的固相萃取模式，將步驟四得到的固相萃取預(yù)處理樣品加入C18/500mg固相小柱，流動(dòng)相為甲醇，流速1mL/min,壓力為0.1MPa,等度洗脫，收集流出液；用少量色譜級(jí)甲醇對(duì)所述固相小柱進(jìn)行淋洗，收集流出液；六、高效液相色譜檢測(cè)：將步驟五收集的流出液混合并以甲醇重新定容，膜過(guò)濾后采用步驟一高效液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得樣品中各組分的峰面積，以保留時(shí)間定性，根據(jù)步驟三確定的線性回歸方程定量，計(jì)算樣品中三種大麻酚類化合2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法，其特征在于步驟二所述不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制方法是從同時(shí)含有CBD、容量瓶并以甲醇定容。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法，其特征在于所述混合標(biāo)準(zhǔn)品母液的配制方法是分別取0.5mL質(zhì)量濃度均為1mg/mL的4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法，其特征在于步驟四所述漢麻樣品為漢麻葉，所述干燥粉碎處理是將漢麻葉置于鼓風(fēng)干燥箱中40℃烘干6小時(shí)，取適量烘干后的漢麻葉于粉碎機(jī)中粉碎至末。36.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法，其特征在于步驟四所述超聲協(xié)助萃取是精取漢麻葉粉末0.1g于10ml離心管中，加入6ml7.根據(jù)權(quán)利要求6所述一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法，其特征在于步驟四所述離心處理是3000r/min離心5min;取上清液于10mL容量瓶并以甲醇定容。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法，其特征在于步驟五所述固相小柱使用前用5mL色譜級(jí)甲醇過(guò)柱進(jìn)行活化柱效。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法，其特征在于步驟六流出液混合并以甲醇重新定容至25mL。4方法技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于植物成分檢測(cè)方法領(lǐng)域，具體涉及一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法。背景技術(shù)[0002]漢麻作為地球上最古老的作物之一，早在一萬(wàn)年以前，就為人類所利用。漢麻韌皮纖維是最好的天然纖維之一，它比棉花纖維更長(zhǎng)，韌性和吸濕性更強(qiáng)，隔熱絕緣效果更好，是上等的紡織和造紙?jiān)牧?。隨著現(xiàn)代化科技的發(fā)展，漢麻中的有效成分逐漸引起關(guān)注，其中大麻酚類化合物因數(shù)量及生物活性成分較多而受到重視。大麻酚類化合物主要包括四氫大麻酚(THC)、大麻二酚(CBD)、大麻酚(CBN)及大麻萜酚(CBC)等成分。[0003]由于大麻酚類化合物種類繁多，且這些物質(zhì)極性相似，現(xiàn)有技術(shù)很難將其中不同大麻酚類化合物成分進(jìn)行有效的分離，因無(wú)法徹底分離而夾雜在檢測(cè)樣品中的雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生了很大影響。[0004]現(xiàn)有技術(shù)中大部分關(guān)于大麻酚類化合物成分的檢測(cè)都局限于漢麻仁油中THC或方法較為全面。但這些檢測(cè)方法大多是針對(duì)單一大麻酚類化合物進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)需要檢測(cè)漢麻中的多種大麻酚類化合物時(shí)，需要采用各自的前處理技術(shù)和分析方法，檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且消耗資金大。發(fā)明內(nèi)容[0005]本發(fā)明克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，將固相萃取-高效液相色譜法(SPE-HPLC)應(yīng)用到漢麻中大麻酚類化合物的檢測(cè)，提供了一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法。[0006]本發(fā)明一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法步驟如下：[0009]二、配制混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：配制同時(shí)含有相同質(zhì)量濃度的三種大麻酚類化合物[0010]三、確定線性回歸方程：將步驟二配制的各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次采用步驟一高效液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以保留時(shí)間定性，根據(jù)各濃度所測(cè)峰面積的大小與其濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分別確定三種大麻酚類化合物的線性回歸方程；離心管并加入甲醇，采用超聲協(xié)助萃取漢麻樣品粉末中的大麻酚類化合物；離心處理萃取5液并取上清液以甲醇定容，得到固相萃取預(yù)處理樣品；[0012]五、固相萃?。翰捎帽Ａ舾蓴_物的固相萃取模式，將步驟四得到的固相萃取預(yù)處理樣品加入C18/500mg固相小柱，流動(dòng)相為甲醇，流速1mL/min,壓力為0.1MPa,等度洗脫，收集流出液；用少量色譜級(jí)甲醇對(duì)所述固相小柱進(jìn)行淋洗，收集流出液；[0013]六、高效液相色譜檢測(cè)：將步驟五收集的流出液混合并以甲醇重新定容，膜過(guò)濾后采用步驟一高效液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得樣品中各組分的峰面積，以保留時(shí)間定性，根據(jù)步驟三確定的線性回歸方程定量，計(jì)算樣品中三種大麻酚類化合物CBD、CBN、THC的濃度，[0014]進(jìn)一步的，步驟二所述不同質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制方法是從同時(shí)含有[0015]進(jìn)一步的，所述混合標(biāo)準(zhǔn)品母液的配制方法是分別取0.5mL質(zhì)量濃度均為1mg/mL[0016]進(jìn)一步的，步驟三所述保留時(shí)間為：CBD:8.3min,CBN:14.9min,THC:18.6min。[0017]進(jìn)一步的，步驟三所述三種大麻酚類化合物的線性回歸方程為：[0018]CBD:Y=74725X+38049,X[0020]THC:Y=72297X+21790,X的使用范圍：0.05-[0021]其中：Y為大麻酚類化合物所對(duì)應(yīng)的峰面積，X為大麻酚類化合物的質(zhì)量濃度。[0022]進(jìn)一步的，步驟四所述漢麻樣品為漢麻葉，所述干燥粉碎處理是將漢麻葉置于鼓風(fēng)干燥箱中40℃烘干6小時(shí)，取適量烘干后的漢麻葉于粉碎機(jī)中粉碎至末。[0023]進(jìn)一步的，步驟四所述超聲協(xié)助萃取是精取漢麻葉粉末0.1g于10mL離心管中，加入6mL甲醇，超聲協(xié)助萃取30min。[0024]進(jìn)一步的，步驟四所述離心處理是3000r/min離心5min;所述取上清液以甲醇定容的體積是10mL。[0025]進(jìn)一步的，步驟五所述固相小柱使用前用5mL色譜級(jí)甲醇過(guò)柱進(jìn)行活化柱效。[0026]進(jìn)一步的，步驟六所述流出液混合并重新定容的體積為25mL。[0027]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：[0028]1、本發(fā)明建立了一種利用固相萃取-高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法，能夠?qū)h麻中大麻酚類化合物進(jìn)行定性和定量分析，為大麻酚類化合物成分和含量的準(zhǔn)確判定和快速檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)；[0029]2、本發(fā)明采用固相萃取技術(shù)作為高效液相檢測(cè)的前處理環(huán)節(jié)，利用固相小柱對(duì)葉綠素等雜質(zhì)成分的良好吸附作用，將待測(cè)大麻酚類化合物與雜質(zhì)成分分離，減少了雜質(zhì)成分對(duì)檢測(cè)的影響，為液相檢測(cè)提供了良好基礎(chǔ)。[0030]3、本發(fā)明C18固相小柱對(duì)于三種大麻酚類化合物的吸附率低，是很好的脫色材質(zhì)的固相小柱；本發(fā)明固相萃取操作簡(jiǎn)單、消耗溶劑少、成本低、分離效果好。[0031]4、本發(fā)明較傳統(tǒng)方法即實(shí)現(xiàn)了三種大麻酚類化合物的同時(shí)檢測(cè)又減少了每種大麻酚類化合物的相對(duì)保留時(shí)間，可在19分鐘內(nèi)完成對(duì)三種大麻酚類化合物的定量檢測(cè)，提6高了檢測(cè)效率。[0032]5、本法建立的色譜條件對(duì)三種大麻酚類化合物均具有較好的分離度，且分析條件適宜：本發(fā)明三種大麻酚類化合物的線性回歸方程R2均大于0.999,表明其在相應(yīng)的適用范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；本發(fā)明檢測(cè)方法精密度實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD均在1%之內(nèi)，表明其精密度、重復(fù)性良好；本發(fā)明檢測(cè)方法加樣回收率實(shí)驗(yàn)回收率范圍在99%—113%之間，表明其準(zhǔn)確度良好。[0033]6、本發(fā)明中樣品的前處理采用超聲協(xié)助萃取，更利于大麻酚類化合物的充分溶附圖說(shuō)明[0034]圖1是本發(fā)明實(shí)施例一步驟三測(cè)得的CBD標(biāo)準(zhǔn)曲線；[0035]圖2是本發(fā)明實(shí)施例一步驟三測(cè)得的CBN標(biāo)準(zhǔn)曲線；[0036]圖3是本發(fā)明實(shí)施例一步驟三測(cè)得的THC標(biāo)準(zhǔn)曲線；[0037]圖4是本發(fā)明實(shí)施例一步驟三測(cè)得的大麻酚類化合物含量為40μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高效液相色譜圖；[0038]圖5是本發(fā)明實(shí)施例一步驟六測(cè)得的漢麻中三種大麻酚類化合物的高效液相色譜[0039]圖6是實(shí)驗(yàn)例1測(cè)得的漢麻中三種大麻酚類化合物的高效液相色譜圖。具體實(shí)施方式[0040]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。[0041]實(shí)施例一：本發(fā)明一種利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法[0047]三、確定線性回歸方程：將步驟二配制的各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次采用步驟一高效液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，其中40μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，以保留時(shí)間定性，三種大麻酚類化合物的保留時(shí)間：CBD:8.3min,CBN:14.9min,THC:18.6m7各濃度所測(cè)峰面積的大小與其濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中CBD、CBN、THC的標(biāo)準(zhǔn)曲[0051]其中：Y為大麻酚類化合物所對(duì)應(yīng)的峰面積，X為大麻酚類化合物的質(zhì)量濃度，n為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的不同混合標(biāo)準(zhǔn)品濃度取值個(gè)數(shù)，R2為線性相關(guān)性系數(shù)。[0052]本發(fā)明高效液相色譜檢測(cè)較傳統(tǒng)方法即實(shí)現(xiàn)了多種大麻酚的同時(shí)檢測(cè)又減少了每種大麻酚的相對(duì)保留時(shí)間，均在19分鐘內(nèi)即可完成對(duì)三種大麻酚的定量檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率。三種大麻酚的線性回歸方程R2均大于0.999,表明其在相應(yīng)的適用范圍內(nèi)線性關(guān)系[0053]四、制備固相萃取預(yù)處理樣品：將漢麻葉置于鼓風(fēng)干燥箱中40℃烘干6小時(shí)，取適量烘干后的漢麻葉于粉碎機(jī)中粉碎至末，精取漢麻葉粉末0.1g于10ml離心管中，加入6ml甲醇，超聲協(xié)助萃取30min,將萃取液以3000r/min離心5min;取上清液于10mL容量瓶并以甲醇[0054]五、固相萃取：采用保留干擾物的固相萃取模式，固相小柱使用前用5mL色譜級(jí)甲醇過(guò)柱進(jìn)行活化柱效，將步驟四得到的固相萃取預(yù)處理樣品加入C18/500mg固相小柱，流動(dòng)相為甲醇，流速1mL/min,壓力為0.1MPa,等度洗脫，樣品中綠色色素成分被吸附保留，大部分酚類物質(zhì)存在于流出液中，收集流出液；用少量色譜級(jí)甲醇對(duì)所述固相小柱進(jìn)行淋洗，收集流出液；[0055]六、高效液相色譜檢測(cè)：將步驟五收集的流出液混合并以甲醇重新定容至25mL,膜過(guò)濾后采用步驟一高效液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，測(cè)得樣品中各組分的峰面積，以保留時(shí)間定性，根據(jù)步驟三確定的線性回歸方程定量，計(jì)算樣品中三種大麻酚類化合物的濃度，由此計(jì)算出漢麻樣品中三種大麻酚類化合物的含量分別為：CBD:1550μg/g;[0056]實(shí)驗(yàn)例1:固相小柱對(duì)樣品中三種大麻酚類化合物的吸附率實(shí)驗(yàn)：[0057]取實(shí)施例一步驟四得到的固相萃取預(yù)處理樣品為測(cè)試樣品，取20μL膜過(guò)濾后采用實(shí)施例一步驟一的高效液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，測(cè)得樣品中各組分的峰面積，以保留時(shí)間定性，根據(jù)步驟三確定的線性回歸方程定量，計(jì)算樣品中三種大麻酚類化合物的濃度，由此計(jì)算出不經(jīng)固相萃取的漢麻樣品中三種大麻酚類化合物的含量分別[0058]固相小柱對(duì)三種大麻酚類化合物的吸附率w=(A-a)÷A×100%,其中A為實(shí)驗(yàn)例1測(cè)得的大麻酚類化合物含量，a為實(shí)施例一測(cè)得的大麻酚類化合物含量。[0059]固相小柱對(duì)三種大麻酚類化合物的吸附率如表1所示：8實(shí)驗(yàn)例1實(shí)施例一吸附率W由表1可知，固相小柱對(duì)于三種大麻酚類化合物的吸附率在11-17%,表明其對(duì)于這三種大麻酚類化合物的吸附率很低，可以作為很好的脫色材質(zhì)的固相小柱。因此，本發(fā)明采用保留干擾物的固相萃取模式，以固相萃取技術(shù)作為高效液相檢測(cè)的前處理環(huán)節(jié)，操作簡(jiǎn)單、消耗溶劑少、成本低，利用固相小柱對(duì)葉綠素等雜質(zhì)成分的良好吸附作用，有效的去除了漢麻葉中的顏色(葉綠素a和葉綠素b),將待測(cè)大麻酚類化合物與雜質(zhì)成分分離，減少了雜質(zhì)成分對(duì)檢測(cè)的影響，為液相檢測(cè)提供了良好基礎(chǔ)。[0063]實(shí)驗(yàn)例2:本發(fā)明SPE-HPLC方法的精密度實(shí)驗(yàn)[0064]精取1份漢麻葉樣品，按照本發(fā)明實(shí)施例一的方法進(jìn)行預(yù)處理并將所得檢測(cè)樣品連續(xù)進(jìn)樣三次(N-1、N-2、N-3),測(cè)得三種大麻酚類化合物的含量數(shù)據(jù)如表2所示：取樣量M(g)[0067]由表2可知，精密度實(shí)驗(yàn)RSD值均在1%以內(nèi)，說(shuō)明本發(fā)明利用SPE-HPLC同時(shí)檢測(cè)漢麻中三種大麻酚類化合物的方法精密度良好。[0068]實(shí)驗(yàn)例3:本發(fā)明SPE-HPLC方法的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)[0069]精取6份不同漢麻葉樣品(N1-N6),按照本發(fā)明實(shí)施例一的方法進(jìn)行預(yù)處理并將所得檢測(cè)樣品依次進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得三種大麻酚類化合物的含量數(shù)據(jù)如表3所示：9[0072]由表3可知，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD值均在1.05%以內(nèi)，說(shuō)明本發(fā)明利用SPE-HPLC