(12)發(fā)明專利濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)啟迪路198號(hào)杭州灣信合伙)33213一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類本發(fā)明公開了一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法及其檢測(cè)試表達(dá)人源大麻素受體CB1基因的單克隆細(xì)胞系21.一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于包括以2)將步驟1)pCMV-CB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，并建立CB1穩(wěn)轉(zhuǎn)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤Neo為對(duì)照空載體，建立一個(gè)轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增得到對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液；3)步驟2)檢測(cè)組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入四氫大麻酚并充分反應(yīng)，配制一系列不同四氫大麻酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)液；將標(biāo)準(zhǔn)液離心分離后，取上清液并用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)多巴胺效應(yīng)下的吸光度OD值，以測(cè)得的吸光度OD值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液中的四氫大麻酚濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算擬合回歸方程；4)步驟2)檢測(cè)組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入待測(cè)樣本，充分反應(yīng)，離心分離后取上清液，對(duì)反應(yīng)后的檢測(cè)組細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)多巴胺效應(yīng)下的吸光度OD?值；步驟2)對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入待測(cè)樣本，充分反應(yīng)，離心分離后取上清液，對(duì)反應(yīng)后的對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)多巴胺效應(yīng)下的吸光度OD?值；計(jì)算吸光度OD?值與吸光度OD?值之差，并帶入步驟3)回歸方程，即可推算出待測(cè)樣本中的大物質(zhì)的效應(yīng)含量；pH2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至慢病毒包裝細(xì)胞293V,制備得到CMV-CB1慢病毒；將CMV-CB1慢病毒感染SK-N-SH細(xì)胞得到CB1/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，用含新霉素G418的條件培養(yǎng)基篩選CB1/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，并通過挑取克隆的方法獲得穩(wěn)定表達(dá)人源大麻素受體CB1基因的單克隆細(xì)胞系2.如權(quán)利要求1所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方3.如權(quán)利要求2所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于步驟2)中，建立轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的過程為：將pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo對(duì)照空載體空載體慢病毒；將空載體慢病毒感染SK-N-SH細(xì)胞得到Neo/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，用含新霉素G418的條件培養(yǎng)基篩選Neo/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，并通過挑取克隆的方法獲得空白對(duì)照細(xì)胞4.如權(quán)利要求1所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于步驟3)中，向檢測(cè)組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入四氫大麻酚并充分反應(yīng)，配制四氫大5.如權(quán)利要求1所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方6.如權(quán)利要求1所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方3液，或者為天然大麻、天然大麻制品、合成大麻、合成大麻制品、污水、土壤、水塘中的任意一種。4技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒。背景技術(shù)[0002]對(duì)于吸毒人員吸食大麻類毒品的檢測(cè)和監(jiān)管一直是各國(guó)監(jiān)管部門的難題。因?yàn)槟壳暗臋z測(cè)手段主要依賴于抗體(如抗四氫大麻抗體)的免疫法，包括層析法、ELISA法等；以及氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用等大型儀器分析。但大麻類在人體內(nèi)代謝較快，造成檢測(cè)樣本中目標(biāo)基于抗體的免疫檢測(cè)法幾乎不可能，甚至氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用也無法檢測(cè)。發(fā)明內(nèi)容[0003]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒。[0004]本發(fā)明構(gòu)思為：無論是天然大麻素，還是各種各樣的合成大麻素，其在機(jī)體內(nèi)都會(huì)作用到大麻素受體這個(gè)靶點(diǎn)，從而產(chǎn)生其生物學(xué)效應(yīng)。大麻素受體至少包括CB1、CB2兩種類作用后信號(hào)通路激活，即通過IP3-DAG信號(hào)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)儲(chǔ)存的Ca2+迅速釋放到的細(xì)胞質(zhì)，胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度升高，從而產(chǎn)生細(xì)胞應(yīng)答，如神經(jīng)細(xì)胞釋放多巴胺。由于多巴胺的測(cè)定有成熟的ELISA檢測(cè)試劑盒，因而我們通過建立穩(wěn)轉(zhuǎn)CB1的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系CB1/SK-N-SH,建立一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)檢測(cè)方法，應(yīng)用于快速、高效、精準(zhǔn)、高通量的檢測(cè)各種樣品中的大麻素類活性物質(zhì)。[0005]所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：[0006]1)將人源大麻素受體CB1基因克隆到慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的[0007]2)將步驟1)pCMV-CB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，并建立CB1穩(wěn)轉(zhuǎn)的神經(jīng)母細(xì)EF1-Neo為對(duì)照空載體，建立一個(gè)轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系，進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增得到對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液；[0008]3)步驟2)檢測(cè)組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入四氫大麻酚并充分反應(yīng)，配制一系列不同四氫大麻酚濃度的標(biāo)準(zhǔn)液；將標(biāo)準(zhǔn)液離心分離后，取上清液并用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)多巴胺效應(yīng)下的吸光度OD值，以測(cè)得的吸光度OD值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液中的四氫大麻酚濃度為橫坐[0009]4)步驟2)檢測(cè)組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入待測(cè)樣本，充分反應(yīng)，離心分離后取上清液，對(duì)5反應(yīng)后的檢測(cè)組細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)多巴胺效應(yīng)下的吸光度OD?值；步驟2)對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入待測(cè)樣本，充分反應(yīng)，離心分離后取上清液，對(duì)反應(yīng)后的對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)多巴胺效應(yīng)下的吸光度OD?值；計(jì)算吸光度OD?值與吸光度OD?值之差，并帶入步驟3)回歸方程，即可推算出待測(cè)樣本中的大麻素類活性物質(zhì)的效應(yīng)含量。[0010]所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在[0011]所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在SH細(xì)胞得到CB1/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，用含新霉素G418的條件培養(yǎng)基篩選CB1/SK胞，并通過挑取克隆的方法獲得穩(wěn)定表達(dá)人源大麻素受體CB1基因的單克隆細(xì)胞系CB1/SK-[0012]所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在Neo對(duì)照空載體、pH1質(zhì)粒、pH2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至慢病毒包裝細(xì)胞293V,制備得到空載體慢病毒；將空載體慢病毒感染SK-N-SH細(xì)胞得到Neo/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，用含新霉素G418的條件培養(yǎng)基篩選Neo/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，并通過挑取克隆的方法獲得空白對(duì)照細(xì)胞系Neo/SK-N-SH。[0013]所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于步驟3)中，向檢測(cè)組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入四氫大麻酚并充分反應(yīng)，配制四氫大麻酚濃度分反應(yīng)3~10分鐘。[0014]所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在[0015]所述的一種基于細(xì)胞多巴胺釋放效應(yīng)的大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在[0016]所述的一種大麻素類活性物質(zhì)的檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述檢測(cè)試劑盒包括檢測(cè)組試劑盒和對(duì)照組試劑盒兩種成分，所述檢測(cè)組試劑盒包括穩(wěn)定表達(dá)人源大麻素受體CB1基因的單克隆細(xì)胞系CB1/SK-N-SH和ELISA檢測(cè)試劑盒，所述對(duì)照組試劑盒包括空白對(duì)[0018](1)避免了免疫檢測(cè)法依賴于抗體的局限，可直接對(duì)所有大麻素類活性物質(zhì)進(jìn)行通用檢測(cè)，沒有非特異性結(jié)合問題，無需昂貴人力物力和繁復(fù)長(zhǎng)周期的抗體研發(fā)過程；同時(shí)也避免了氣質(zhì)聯(lián)用、液質(zhì)聯(lián)用法依賴于對(duì)照品的局限、有限的檢測(cè)限、以及復(fù)雜的樣品前處理工作。本發(fā)明的技術(shù)方案可實(shí)現(xiàn)所有大麻素類活性物質(zhì)的精確、高靈敏的快速檢測(cè)，無論是天然大麻素、還是合成大麻素，包括層出不窮的新型合成大麻素活性物質(zhì)，可解決大麻類精神活性物質(zhì)監(jiān)管難的問題。[0019](2)可利用現(xiàn)有的多巴胺ELISA檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè)分析。6[0020](3)可用通用的熒光酶標(biāo)儀測(cè)定，可在絕大多數(shù)普通實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。[0021](4)由于是基于受體信號(hào)通路的生物學(xué)效應(yīng)的檢測(cè)，結(jié)果不僅可正確判斷是否是大麻素類活性物質(zhì)，而且可以對(duì)其活性進(jìn)行定量評(píng)估，為監(jiān)管、和醫(yī)學(xué)干預(yù)提供可靠的實(shí)驗(yàn)[0022](5)本發(fā)明提供一種穩(wěn)定表達(dá)人源大麻素受體CB1基因的單克隆細(xì)胞系CB1/SK-N-SH,其能夠通過CB1的IP3-DAG信號(hào)通路對(duì)包括天然大麻素和合成大麻素在內(nèi)的所有大麻素類活性物質(zhì)產(chǎn)生應(yīng)答，細(xì)胞釋放多巴胺，從而可應(yīng)用于大麻素類活性物質(zhì)的高靈敏的通用檢測(cè)，該穩(wěn)轉(zhuǎn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中包含一個(gè)由CMV啟動(dòng)高表達(dá)基因CB1,當(dāng)大麻素類活性物質(zhì)作用于CB1時(shí)，即可啟動(dòng)IP3-DAG信號(hào)通路，使神經(jīng)細(xì)胞迅速釋放多巴胺；因而可利用現(xiàn)(皮克級(jí))、精確、高通量的大麻素類活性物質(zhì)通用檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒基于CB1受體的IP3-DAG信號(hào)通路，通過檢測(cè)細(xì)胞迅速釋放的多巴胺檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)快速、靈敏、精確的定量檢測(cè)分析。附圖說明[0023]圖1為pCMV-CB1質(zhì)粒圖譜。[0024]圖2為以THC標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，多巴胺檢測(cè)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。[0025]圖3為采用本發(fā)明的大麻素類活性物質(zhì)通用檢測(cè)試劑盒對(duì)毛發(fā)樣本的檢測(cè)結(jié)果。[0026]圖4為競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)0-12.8ng/ml濃度THC的檢測(cè)結(jié)果，曲線表明THC檢測(cè)極限>[0027]圖5為競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)0.4-12.8ng/ml濃度THC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。[0028]圖6為競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)毛發(fā)樣本的檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。[0030]以下實(shí)施例中，慢病毒包裝系細(xì)胞293V購(gòu)自于北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司。[0032]通過連接酶切位點(diǎn)EcoRI和NotI,將人源大麻素受體CB1基因克隆到慢病毒表達(dá)[0033]實(shí)施例2建立CB1/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和空白對(duì)照Neo/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系霉素、100μg/mL鏈霉素雙抗)將慢病毒包裝系細(xì)胞293V配成1×10?個(gè)/mL濃度接種于一個(gè)[0036]2)轉(zhuǎn)染：待培養(yǎng)皿中細(xì)胞長(zhǎng)至70%-80%的融合度時(shí)，用PEI轉(zhuǎn)染試劑(參照其標(biāo)準(zhǔn)7中的細(xì)胞293V。[0037]3)收集病毒：步驟2)培養(yǎng)72小時(shí)后收集上清液；在4℃溫度且8000g相對(duì)離心力的[0038]4)病毒濃縮：取步驟3)濾過的上清病毒液(約30mL),在4℃溫度且90000g相對(duì)離心力的條件下離心分離90分鐘，去上清，沉淀即為CMV-CB1慢病毒，用1mL的DMEM-H完全培養(yǎng)[0039]5)SK-N-SH細(xì)胞準(zhǔn)備：預(yù)先將1×10?個(gè)/mL濃度的SK-N-SH[0040]6)SK-N-SH細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將步驟5)的12孔板中的培養(yǎng)SK-N-SH細(xì)胞的培養(yǎng)液吸掉，加培養(yǎng)液。[0041]7)CB1/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選：上述步驟6)轉(zhuǎn)染后的SK-N-SH細(xì)胞培養(yǎng)一周以上后，配成1×10?個(gè)/mL濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2mL/孔；第二天細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，培養(yǎng)液(含600μg/mL的G418的DMEM-H完全培養(yǎng)液),21-30天后換含有200μg/mL的G418的[0042]8)單克隆CB1/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系建立：將上述步驟7)的CB1/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞配成1×103個(gè)/mL濃度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2mL/孔；培養(yǎng)10天后在顯微鏡下用50μL的移液槍挑取單個(gè)克隆移至新的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，1個(gè)克隆/孔；擴(kuò)增后用PCR檢測(cè)CB1基因、WB檢測(cè)CB1蛋白，以獲得高、中、低不同表達(dá)水平的CB1/SK效應(yīng)程度的大麻素類活性物質(zhì)檢測(cè)。[0043]空白對(duì)照Neo/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立：依上述1)-7)的步驟，建立空白對(duì)照Neo/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，不同之處在于：步驟2)中的pCMV-CB1質(zhì)粒用同等質(zhì)量的pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo質(zhì)粒替換，最后得到空白對(duì)照Neo/SK-N-SH穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。[0044]實(shí)施例3大麻素類活性物質(zhì)通用檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用[0045]基于本發(fā)明技術(shù)方案研發(fā)的大麻素類活性物質(zhì)通用檢測(cè)試劑盒可應(yīng)用于含大麻素類活性物質(zhì)的各種樣本檢測(cè)。本實(shí)施例中我們以吸食大麻人員的毛發(fā)為例。具體步驟如[0046]1)毛發(fā)樣本處理：取6份大麻吸食人員的毛發(fā)樣本和8份無吸食史的正常人的毛發(fā)[0047]剪取發(fā)根3cm以內(nèi)的毛發(fā)樣本20mg/份，剪碎后放入5mL的EP管，加2mL含1%角蛋白酶的HBSS緩沖液(pH7.4),加入少量鋯珠和石英砂，粉碎儀上振蕩粉碎1分鐘。表1毛發(fā)樣本編號(hào)樣本大麻吸食人員的毛發(fā)樣本無吸食史的正常人的毛發(fā)樣本編號(hào)[0049]2)細(xì)胞準(zhǔn)備：提前一天將5×10?個(gè)/mL濃度的單克隆CB1/SK-N-SH和空白對(duì)照Neo/8[0052]樣本組：CB1/SK-N-SH細(xì)胞共42孔(每樣3個(gè)重復(fù)孔),分別加入步驟1)所得樣本液，[0053]4)檢測(cè)：對(duì)步驟3)處理的標(biāo)準(zhǔn)品組和樣本組，分別進(jìn)行多巴胺濃度測(cè)試，標(biāo)準(zhǔn)品組和樣本組的檢測(cè)方法步驟相同。標(biāo)準(zhǔn)品組的檢測(cè)過程為：步驟3)處理后的標(biāo)準(zhǔn)品組混勻，37℃反應(yīng)5-10分鐘后，在800g相對(duì)離心力的條件下離心分離5分鐘，吸取上清液加到多巴胺ELISA檢測(cè)試劑盒的孔板進(jìn)行定量測(cè)定分析。[0054]5)結(jié)果：以THC標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，多巴胺檢測(cè)的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=1.6053x+0.6044,R2=0.9835,如圖2所示。樣本組多巴胺檢測(cè)的OD值的結(jié)果如圖3,可明顯區(qū)分陽性樣本和陰性樣本；根據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算，陰性樣本均檢測(cè)不到大麻素成分，陽性樣本中大麻素相對(duì)含量分別為(ng/mg):C1:0.0101、C2:0.0537、[0055]對(duì)比例1:競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)大麻吸食人員的毛發(fā)樣本[0056]目前大麻類檢測(cè)主要依賴于免疫法檢測(cè)，包括膠體金免疫層析法和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。膠體金法適合快檢，但在靈敏度上ELISA法要比膠體金法高1個(gè)數(shù)量級(jí)。本對(duì)比例即以ELISA法檢測(cè)大麻吸食人員的毛發(fā)樣本為例。具體步驟如下：[0057]1)毛發(fā)樣本處理：用實(shí)施例3中同一的處理樣本，分別得到相應(yīng)的樣本液(毛發(fā)樣本編號(hào)與表1相同)。[0058]2)包被抗原：用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)將THC-BSA抗原蛋白配制成1μg/異性結(jié)合。[0060]標(biāo)準(zhǔn)曲線組：將THC標(biāo)準(zhǔn)品用PBS緩沖液(pH7.4)配成終濃度分別為0、0.1、0.2、[0062]4)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合與測(cè)定：上述各組37℃孵育30分鐘，倒去溶液，用PBS緩沖液(pH7.4)[0063]