蒺藜苜蓿TML2基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)摘要：蒺藜苜蓿（Medicago

truncatula）是近年來被廣泛用來研究豆科植物生長發(fā)育的模式植物。在豆科植物中，根據(jù)環(huán)境條件根系除了形成側(cè)根外，還可以形成特殊的器官根瘤。TML

基因在根瘤發(fā)育調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，但其影響根瘤發(fā)育的分子機(jī)制尚不明確，作為一

種

F-Box

類蛋白，它在豆科植物根瘤自調(diào)節(jié)途徑（AON）的后期可能參與目的蛋白酶體降解，從而控制根瘤數(shù)目及根瘤的發(fā)育過程。因此，關(guān)于蒺藜苜蓿

TML

基因的研究對豆科植物共生固氮、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域有著重要的意義。本項目通過RNA提取和反轉(zhuǎn)錄、PCR技術(shù)成功從中克隆得到TML2基因；利用無縫克隆技術(shù)完成了pGEX-6P-1-TML2和pCold-TF-TML2原核表達(dá)載體的構(gòu)建；成功將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Rosetta并完成表達(dá)；確定了TML2蛋白的表達(dá)部位少量位于上清，大量位于沉淀中，形成包涵體。前言：1.蒺藜苜蓿簡介蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）是一年生的豆科草本植物，是一種放牧型牧草，具有強(qiáng)耐旱性且適宜堿性土壤，在可持續(xù)性農(nóng)業(yè)體系中可以被用作放牧草地的主要草種。同時，由于蒺藜苜蓿具有染色體倍數(shù)?。?n=16），基因組?。▎伪扼w基因組大小約為500Mb），生長周期短，自花授粉植物并具有較短的生物周期，能產(chǎn)生大量種子，遺傳轉(zhuǎn)化效率高，與大多數(shù)豆科作物及牧草（例如紫花苜蓿）親緣關(guān)系近等特點(diǎn)，常常被用作研究豆科植物基因組以及基因功能的模式植物。2003年,國際上啟動了蒺藜苜蓿基因組大規(guī)模測序項目。生態(tài)型JemalongA17基因組測序已經(jīng)完成并且可以利用，目前，蒺藜苜?；蚪M草圖新版本（Mt4.0V2）已經(jīng)構(gòu)建完成，這將提供更為全面，準(zhǔn)確度更高的基因組數(shù)據(jù)庫。2.豆科共生固氮生物固氮對自然界的氮素循環(huán)有著十分重要的意義。每年全球的生物固氮量為175×107噸,是工業(yè)固氮的3倍。其中農(nóng)田固定的氮素約9×107噸,而根瘤菌與豆科植物的共生固氮能力居各類固氮體系之首,為3.7×107噸。此外，根瘤菌與豆科植物共生固氮體系對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展至關(guān)重要,也是研究原核與真核生物互利共生的模式體系之一，因此蒺藜苜蓿的研究對豆科植物的共生固氮（SymbioticNitrogenFixation）研究有著重要參考意義。根瘤菌在根皮層中繁殖，刺激皮層細(xì)胞分裂，導(dǎo)致根組織膨大突出形成根瘤。根瘤菌能把空氣中游離的氮轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锬芾玫暮衔铮垂痰饔?。聚集在根毛頂端的根瘤菌分泌一種纖維素酶，這種酶可以將根毛細(xì)胞壁溶解掉，隨后根瘤菌從根毛尖端侵入根的內(nèi)部，產(chǎn)生感染絲（即由根瘤菌排列成行，外面包有一層黏液的結(jié)構(gòu)）。根瘤菌不斷地進(jìn)入根毛，并且大量繁殖。在根瘤菌侵入的刺激下，根細(xì)胞分泌一種纖維素，將感染絲包圍起來，形成一條分枝或不分枝的纖維素鞘，即侵入線。侵入線不斷地延伸，直到根的內(nèi)皮層。根的內(nèi)皮層處的薄壁細(xì)胞，受到根瘤菌分泌物的刺激，產(chǎn)生大量的皮層細(xì)胞，從而使該處的組織膨大，最后形成根瘤。3.根瘤調(diào)節(jié)途徑研究觀察發(fā)現(xiàn)，蒺藜苜蓿Mt.CompactRootArchitecture2(CRA2)基因突變體與野生型植株相比具有更多的側(cè)根和更少的根瘤。CRA2分別參與兩條獨(dú)立的信號通路調(diào)節(jié)植物側(cè)根和根瘤的形成：一條為根系局部信號通路，MtCRA2通過未知途徑抑制根系中生長素生物合成基因MtYUC2的轉(zhuǎn)錄水平，抑制生長素生物合成，從而調(diào)節(jié)側(cè)根的形成；在低氮條件下，MtCEP1激活MtCRA2并磷酸化MtEIN2，抑制乙烯對根瘤菌感染的抑制作用；另一條為地下-地上-地下的長距離結(jié)瘤自調(diào)節(jié)通路（Autoregulation，AON），在此通路中，植物根系產(chǎn)生的CEP小肽被地上部分的CRA2識別，促進(jìn)miR2111microRNA的表達(dá)，從而促進(jìn)根瘤的形成。miR2111是一種可以系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)的保守小RNA，通過靶向降解根系中的負(fù)調(diào)控根瘤數(shù)目的TML（toomuchlove）蛋白，對根瘤形成起正向調(diào)節(jié)作用。同時在豆科植物中還存在著與CEP-CRA2類似的CLE-SUNN負(fù)調(diào)控結(jié)瘤的信號途徑：根系中產(chǎn)生的CLE小肽由地上部分的SUNN識別，抑制miR2111的表達(dá)從而抑制結(jié)瘤。由此可見miR2111作用于SUNN負(fù)調(diào)控通路和CRA2正調(diào)控通路的交叉點(diǎn)，以CEP-CRA2、CLE-SUNN代表的AON途徑是豆科植物調(diào)節(jié)根瘤數(shù)目，平衡能量消耗與共生固氮的關(guān)鍵(圖1)。miR2111-TML對結(jié)瘤的調(diào)控是AON途徑共有的后期調(diào)控，起到十分重要的作用。因此，TML基因在根瘤發(fā)育調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。但其影響根瘤發(fā)育的分子機(jī)制尚不明確。TML基因編碼一種含Kelch重復(fù)結(jié)構(gòu)域的F-box蛋白，在蒺藜苜蓿中有同源的兩個基因MtTML1，MtTML2，作為一種F-Box類蛋白，它在豆科植物根瘤自調(diào)節(jié)途徑（AON）的后期可能參與目的蛋白酶體降解，從而控制根瘤數(shù)目及根瘤的發(fā)育過程。因此，關(guān)于蒺藜苜蓿TML基因的研究對豆科植物共生固氮、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等領(lǐng)域有著重要的意義。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)對蒺藜苜蓿TML基因進(jìn)行表達(dá)，從而為后續(xù)驗證該基因在調(diào)控豆科植物根瘤發(fā)育方面提供理論基礎(chǔ)。圖1miR2111-TML作用于SUNN負(fù)調(diào)控通路和CRA2正調(diào)控通路的交叉點(diǎn)[2]1材料與方法1.1材料1.1.1實驗材料大腸桿菌Rosetta；表達(dá)質(zhì)粒pCold-TF，pGEX-6P-1；野生型蒺藜苜蓿A17植株1.1.2試劑購自TaKaRa公司的限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、購自NEB公司的XhoⅠ、羧芐青霉素、IPTG、瓊脂糖、溴酚蘭、DNAMarker、蛋白Marker、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉、凝膠回收試劑盒（Tiangen）、質(zhì)粒小提中量試劑盒（Tiangen）、RNA提取試劑盒（Trandge）、

ClonExpress?IIOneStepCloningKit（Vazyme）、TaqDNAPolymerase（Vazyme）、GST-TagmAb（ABMART）、Phanta?MaxSuper-FidelityDNAPolymerase（Vazyme）SDS相關(guān)試劑

12%分離膠（5mL體系）：依次加入雙蒸水1.65mL，pH8.81.5mol/L的Tris-HCl

1.25mL，Acr/Bis

2.0mL，10%SDS

50μL混勻，臨灌膠前再加入TEMED

5μL和10%AP

50μL后混勻；

4%濃縮膠（1.5mL體系）：依次加入雙蒸水0.9mL，pH6.81.0mol/L的Tris-HCl

0.375mL，Acr/Bis

0.2mL，10%SDS

15μL混勻，臨灌膠前再加入TEMED

2.5μL和10%AP

15μL后混勻；

10×SDSRunning

buffer：稱取30.0g

Tris

base，144.0g

Glycine，10g

SDS，用ddH2O補(bǔ)足至1L；

10×Transfer

buffer：稱取30.0g

Tris

base，144.0g

Glycine，用ddH2O補(bǔ)足至1L；1×Transfer

buffer：50mL

10×Transfer

buffer，100mL甲醇，用ddH2O補(bǔ)足至500mL

考馬斯亮藍(lán)染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)R250，10mL冰醋酸，45mL甲醇，用ddH2O定容至100mL；

脫色液：100mL冰醋酸，450mL甲醇，使用ddH2O定容至1000mL。GST裂解緩沖液：配方為150mMNaCl，20mM、pH8.8的Tris-HCl，5mMMgCl2，1%Triton-X-100，1mMDTT，1mMPMSF和Inhibitorcocktail。其中DTT和蛋白酶抑制劑現(xiàn)用現(xiàn)加，其余的組分配置好后之后存于4℃冰箱保存。His裂解緩沖液:稱取13.609gKH2PO4和22.818gK2HPO4分別溶于100mLddH2O以配成1M的KH2PO4和1M的K2HPO4溶液。然后取0.3mL所配的KH2PO4溶液、4.7mL所配的K2HPO4溶液、2.3gNaCl、0.75gKCl、10mLglycerol、0.5mLTriton-X-100和68mgimidazole溶于90mLddH2O以配成100mL體系，調(diào)節(jié)pH至7.8。1.1.3主要設(shè)備及儀器超凈工作臺；立式高壓滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫?fù)u床；電子天平；小型高速離心機(jī)；凝膠成像儀；PCR儀；通風(fēng)櫥；超聲破碎儀；pH計；超純水系統(tǒng)；移液器（Eppendorf）；電泳儀（BIO-RAD電泳系統(tǒng)）；核酸濃度檢測儀(NanoDrop)；冷凍冰箱，超低溫冰箱等。1.1.4培養(yǎng)基制備LB液體培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10.0g、NaCl10.0g、酵母提取物5.0g，加入適量超純水用玻璃棒攪拌至全部溶化，補(bǔ)加超純水至1000mL，高壓蒸汽滅菌20min。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度為1.5%，高壓滅菌20min。2YT培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、酵母提取物5.0g，加入800mL去離子水用玻璃棒攪拌至全部溶化，補(bǔ)加去離子水至1000mL，高壓蒸汽滅菌20min。1.2方法1.2.1引物設(shè)計根據(jù)蒺藜苜蓿基因組的信息，設(shè)計TML2基因的引物，并送公司合成。本實驗利用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建載體，設(shè)計的引物如下：NameOligo(5'-3')ProteinsizeTML2-pGEX-6P-FGGGATCCCCGGAATTCATGAGTTATAGTGTGTCTAGTAAAAGATC~72kD(GST-tag)TML2-pGEX-6P-RGTCGACCCGGGAATTCTCAAGCCAACATCACAGCACAATTGTGAATTML2-pCold-T-FCTCGGTACCCTCGAGATGAGTTATAGTGTGTCTA~95kD(His-tag)TML2-pCold-TF-RTTCGGATCCCTCGAGTCAAGCCAACATCACAGCACAAT1.2.2獲取目的基因用HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒提取蒺藜苜蓿野生型A17RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA備用。反應(yīng)體系如表1、表2所示：表1去除基因組DNA反應(yīng)體系成分體積（μL）10×gDNAEraserBuffer1ulgDNAEraser0.5ulRNATemplate10pg-1ugRNase-FreeWater總體系Upto10ul10表2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系成分體積（μL）表一反應(yīng)液10HiFiScript,200U/uL1PrimerMix1)45×ScriptRTBuffer4RNase-FreeWater總體系4201.2.3表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因克隆以cDNA作為模板以擴(kuò)增目的基因。反應(yīng)體系如表3，PCR反應(yīng)程序如表4。表3PCR反應(yīng)體系成分體積（μL）2×PhantaMasBuffer25dNTPs1模板DNA1ForwardPrimer（10μM）2ReversePrimer（10μM）2PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase（1U/μL）1.5ddH2O17.5總體系50表4PCR反應(yīng)程序預(yù)變性變性退火延伸1-4徹底延伸保溫94℃5min95℃30sec55℃30sec72℃30sec/Kb30cycles72℃10min16℃forever將PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，并在切膠儀上盡可能少地切下凝膠上的PCR產(chǎn)物，放置于2mL離心管中用以后續(xù)回收純化。線性化載體制備選擇pCold-TF（圖2）和pGEX-6P-1質(zhì)粒（圖3）作為載體質(zhì)粒，分別利用XhoⅠ和E.coRⅠ37℃酶切30min，將載體質(zhì)粒線性化。酶切體系如表5、表6。表5pGEX-6P-1酶切反應(yīng)體系成分體積（μL）質(zhì)粒3E.coRⅠ110×FastDigestGreenBuffer5ddH2O41總體系50表6pCold-TF酶切反應(yīng)體系成分體積（μL）質(zhì)粒3XhoⅠ110×NEBuffer3.15ddH2O41總體系50圖2pCold-TF圖3pGEX-6P-PCR產(chǎn)物回收與純化將以cDNA為模板克隆目的片段得到的PCR產(chǎn)物和酶切反應(yīng)后的載體質(zhì)粒經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后,按照Tiangen公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的說明書操作:（1）在紫外燈下用手術(shù)刀切下對應(yīng)大小的單一目的條帶，要求盡量快速準(zhǔn)確，把切下來的膠塊放入到1.5mL的EP管中；（2）稱量切下膠塊的重量，加入等體積的溶膠液PN(1g對應(yīng)1mL);55℃金屬浴加熱至膠塊融化；（3）向吸附柱中加入500μL的平衡液BL，12000rpm，離心1min，棄去收集管中的液體，平衡吸附柱；（4）向平衡過的吸附柱中加入已溶解并冷卻的膠塊混合液，靜置2min；（5）12000rpm離心30s，棄去收集管中的液體；（6）加入漂洗液PW600μL，靜置2-5min，12000rpm離心1min，棄去收集管中的液體；（7）重復(fù)上一步驟一次；（8）空吸附柱12000rpm離心2min，離心后，將吸附柱放入新的1.5mLEP管中，置于55℃金屬浴上數(shù)分鐘，至沒有乙醇?xì)馕?；?）吸附柱中加入50μLddH2O室溫放置2min后，12000rpm離心2min，將收集的液體放在-20℃保存。目的基因與載體的連接利用重組酶將線性化的pCpld-TF和pGEX-6P-1載體與目的基因連接，采用無縫克隆技術(shù)，按照表7所示體系加入試劑，37℃水浴30min，構(gòu)建完整的表達(dá)載體。表7目的基因與線性化載體的連接體系成分體積（μL）線性化載體pGEX-6P-1/pCold-TF3ExnaseⅡ15×CEⅡBuffer2目的基因4總體系101.2.4表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞Rosetta感受態(tài)細(xì)胞制備（1）取-80℃凍存的菌株，用接種環(huán)劃線接種于固體平板上，做好標(biāo)記，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；（2）第二天，從平板上挑取單個菌落，接種至4mLLB培養(yǎng)液的試管中，37℃，200rpm，震蕩培養(yǎng)過夜。次日取菌液100uL接種至含有10mLLB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)約2-3小時至對數(shù)生長期；（3）當(dāng)菌液OD600值達(dá)到0.3-0.5時，將錐形瓶取出放置于冰上10-15min。在無菌條件下把菌液倒入10mL的預(yù)冷的離心管中，離心4℃,5000rpm離心10min；（4）棄去上清，加入約1mL的預(yù)冷的CaCl2溶液，吹打混勻，懸浮菌體，放入冰浴30min；（5）離心4℃，5000rpm離心10min，棄去上清，加入約200μL預(yù)冷的CaCl2溶液，重新懸浮菌體；（6）將用CaCl2溶液處理后的菌體分裝于1.5mL的EP管中，每管50μL，保存于-80℃的超低溫冰箱中備用。質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（1）取1管50μL的感受態(tài)細(xì)胞，用Marker筆標(biāo)記載體名稱。加入10ng的載體質(zhì)粒DNA，輕輕彈動管壁以混合內(nèi)容物，冰上放置30min；（2）將離心管放到42℃水浴鍋中熱激90s，期間不要搖動。然后在冰浴中迅速冷卻2min；（3）離心管中加入400μLLB液體培養(yǎng)基，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中復(fù)蘇1h；將離心管用離心機(jī)在9000rpm下離心4min，吸去上清300μL，剩余的100μL菌液重懸后，滴加在含有羧芐青霉素的選擇平板上，用涂布棒將菌液涂勻，待菌液晾干后，貼封口膜，將平板倒置培養(yǎng)在37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜；（4）第二天早晨觀察轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的情況，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定。轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定挑取單菌落混入表8中所示體系，進(jìn)行PCR；制備含有熒光染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳15-20min，用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行觀察，用biovision軟件進(jìn)行拍照，確定陽性克隆菌落。表8轉(zhuǎn)化子PCR檢測體系成分體積（μL）10×Taqbuffer2.5dNTPs1ForwardPrimer1ReversePrimer1TaqEnzyme0.5ddH2O19總體系質(zhì)粒提取與測序檢測利用質(zhì)粒小提中量取試劑盒提取上述陽性克隆菌落質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度及純度后，將質(zhì)粒送往西安擎科生物公司測序，檢測是否進(jìn)一步篩選陽性克隆菌落。1.2.5TML2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)（1）從新鮮的劃線平板中挑取單克隆到5mL含50mg/L羧芐青霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，37℃搖瓶培養(yǎng)過夜；（2）取出1mL菌液加入50mL含50mg/L羧芐青霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，含有pGEX-6P-1-tml2的菌和含有pCold-TF-TML2的菌在37℃搖瓶培養(yǎng)至OD600為0.6，取出1ml菌液作為誘導(dǎo)前的對照，保存在-20℃冰箱中備用；（3）培養(yǎng)基中加入1MIPTG至終濃度為1mM，含有pGEX-6P-1-TML2的菌和含有pCold-TF-TML2的菌分別在37℃、15℃誘導(dǎo)6h、24h；（4）取出1mL菌液，和誘導(dǎo)前的菌液一起離心（4℃，5,000rpm，10min）,棄掉上清，沉淀用100μL2×SDSBuffer重懸；（5）樣品95℃煮5min，進(jìn)行SDS分析。1.2.6確定TML2蛋白表達(dá)部位從表達(dá)目的蛋白的陽性克隆中選取一個菌株，分析目標(biāo)蛋白的溶解性，確定蛋白是否形成包涵體。（1）含有pGEX-6P-1-TML2的菌和含有pCold-TF-TML2的菌分別在37℃和15℃下加入IPTG分別誘導(dǎo)6h、24h之后，離心(4℃,4000rpm，20min)，棄上清，沉淀分別用10mLGST裂解液、His裂解液重懸，立即放到冰上；（2）重懸液中加入溶菌酶（終濃度為1mg/mL），4℃冰箱過夜；（3）超聲波破碎細(xì)胞，超聲6×9s,10s間隔一次，總時間15-90min，功率：200w-350w，樣品始終都要保持在冰上；（4）4℃，4000rpm，離心30min，收集上清，記做A（可溶部分），保存在冰上備用；（5）沉淀分別用10mLGST裂解液、His裂解液重懸記做B（不溶部分），保存在冰上備用；（6）取A和B各50μL，加入等體積的2×SDSBuffer，95℃煮5min，進(jìn)行SDS分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)部位。1.2.7表達(dá)產(chǎn)物的WesternBlot分析利用WesternBlot分析進(jìn)一步檢測表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)情況。由于原核表達(dá)載體pGEX-6P-1載體本身含有GST標(biāo)簽，所以本試驗選用小鼠抗GST-Tag單克隆抗體作為第一抗體分析表達(dá)產(chǎn)物是否為帶有GST的融合蛋白。（1）將表達(dá)目的蛋白的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并且進(jìn)行SDS電泳分離；（2）SDS電泳結(jié)束后，取下凝膠，轉(zhuǎn)移到CN膜上(濕轉(zhuǎn)）；（3）從轉(zhuǎn)移裝置中取出硝酸纖維素膜，將膜放入封閉液中，室溫下封閉1.5h；（4）膜放入15mL含一抗（用封閉液1：3000稀釋）的溶液中，室溫下反應(yīng)1.5h；（5）用TBST洗膜4次，每次20min；（6）膜放入10mL含兔抗鼠IgG二抗（HRP標(biāo)記）（用封閉液1：8000稀釋）的溶液中，室溫下反應(yīng)1.5h；（7）用TBST洗膜三次，每次15min；（8）在膜上加入HRP顯色底物，放入化學(xué)發(fā)光儀中曝光顯色拍照。1.2.8IPTG濃度和誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)的影響探究（1）從含有pGEX-6P-1-TML2的菌的新鮮的劃線平板中挑取單克隆到5mL含50mg/L羧芐青霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，37℃搖瓶培養(yǎng)過夜；（2）取出1mL菌液分別加入50mL含50mg/L羧芐青霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，37℃搖瓶培養(yǎng)至OD600為0.6，取出1mL菌液作為誘導(dǎo)前的對照，保存在-20℃冰箱中備用；（3）向培養(yǎng)基中分別加入1MIPTG至終濃度為1mM，分別取0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h時的菌液1mL，-20℃冰箱保存；（4）將每組所取1mL菌液，和誘導(dǎo)前的菌液一起離心（4℃，5000rpm，10min）,棄掉上清，沉淀用100μL2×SDSBuffer重懸；（5）樣品95℃煮5min，進(jìn)行SDS分析。（6）另取7ml菌液分別加入7瓶20ml含50mg/L羧芐青霉素的2YT液體培養(yǎng)基中，37℃搖瓶培養(yǎng)至OD600為0.6，取出1ml菌液作為誘導(dǎo)前的對照，保存在-20℃冰箱中備用；（7）向七組培養(yǎng)基中分別加入1MIPTG至終濃度為0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM，37℃搖床6h；（8）每組取出1mL菌液，和誘導(dǎo)前的菌液一起離心（4℃，5000rpm，10min）,棄掉上清，沉淀用100μL2×SDSBuffer重懸；（9）樣品95℃煮5min，進(jìn)行SDS分析。2實驗結(jié)果及結(jié)論2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化2.1.1目的基因的克隆用TransZolUpPlusRNAKit提取蒺藜苜蓿野生型A17RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得到PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示（圖5），1218bp處有明顯的亮帶，確認(rèn)得到目的基因。cspApromoterTriggerFactorTML2GeneAMP+HiscspApromoterTriggerFactorTML2GeneAMP+HisTacpromoterGSTTagTML2GeneAMP+pColdTacpromoterGSTTagTML2GeneAMP+圖4重組載體構(gòu)建示意圖1kb1kb1218bp圖5PCR擴(kuò)增目的基因2.1.2轉(zhuǎn)化子PCR鑒定對經(jīng)過感受態(tài)細(xì)胞法轉(zhuǎn)化后的Rosetta菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化子PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳所得結(jié)果顯示（圖6），具有明顯的帶，說明轉(zhuǎn)化成功。pCold-TFpCold-TF-TML2inRosettapGEX-6P-1-TML2inRosetta圖6轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定。M為DNAmarker，1~5為5個單克隆。2.1.3質(zhì)粒提取與測序檢測提取陽性克隆轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒，送往測序公司進(jìn)行測序，所得結(jié)果顯示（圖7、圖8），部分陽性克隆轉(zhuǎn)化子中確實含有表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化成功。圖7pGEX-6P-1-TML2表達(dá)載體測序結(jié)果圖8pCold-TF-TML2表達(dá)載體測序結(jié)果2.2重組質(zhì)粒表達(dá)的表達(dá)和純化2.2.1目的蛋白的表達(dá)情況裂解菌體的SDS結(jié)果（圖9）顯示，IPTG6h誘導(dǎo)條件下，pGEX-6P-1-TML2載體表達(dá)出72kD大小的蛋白，pCold-TF-TML2載體表達(dá)出95kD大小的蛋白，說明轉(zhuǎn)化菌體中目的蛋白得到成功表達(dá)；不同濃度IPTG誘導(dǎo)結(jié)果（圖10）顯示，未添加IPTG與添加IPTG情況下表達(dá)量差異明顯，而添加不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)量沒有明顯差別；不同IPTG誘導(dǎo)時間結(jié)果（圖10）顯示，誘導(dǎo)0h組沒有蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)時間為1h、2h、3h的3組之間，隨著誘導(dǎo)時間增加，蛋白表達(dá)量逐漸增加，誘導(dǎo)時間為4h、5h、6h的三組之間，誘導(dǎo)時間增加，表達(dá)量沒有明顯變化。pGEX-6pGEX-6P-1-TML2pCold-TF-TML2圖9菌株蛋白SDS分析。M為ProteinMarker；1為0h時未添加IPTG誘導(dǎo)時菌體的蛋白表達(dá)情況；左圖2為37oC下，1mMIPTG誘導(dǎo)6h時菌體的蛋白表達(dá)情況，右圖2為15oC下1mMIPTG誘導(dǎo)24h時菌體的蛋白表達(dá)情況。M1234567M1234567M1234567M123456775kD75kD圖10不同誘導(dǎo)條件下含pGEX-6P-1-TML2表達(dá)載體的菌體蛋白表達(dá)的SDS分析。左圖為1mMIPTG誘導(dǎo)下，不同誘導(dǎo)時間下蛋白表達(dá)情況，其中M為ProteinMarker，1~7分別對應(yīng)0、1、2、3、4、5、6h的誘導(dǎo)時間；右圖為不同濃度IPTG誘導(dǎo)下蛋白表達(dá)情況，1~7分別對應(yīng)0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mM的IPTG濃度。2.2.2目的蛋白表達(dá)部位的確定pCold-TF-TML2pGEX-6P-1-TML2將超聲波破碎后菌體離心所得的上清和沉淀進(jìn)行SDS分析，所得結(jié)果（圖11）顯示，IPTG6h誘導(dǎo)條件下，pGEX-6P-1-TML2載體轉(zhuǎn)化菌的上清中沒有72kD大小的蛋白表達(dá)，而沉淀中含有72kD大小的蛋白；IPTG24h誘導(dǎo)條件下，pCpCold-TF-TML2pGEX-6P-1-TML295kD75kD95kD75kD圖11經(jīng)超聲波破碎后的SDS分析。左圖為含pGEX-6P-1-TML2的菌株在37oC、1mMIPTG誘導(dǎo)條件下，經(jīng)超聲波破碎后的蛋白情況，其中M為ProteinMarker，1、2分別為0h誘導(dǎo)時間下，經(jīng)超聲波破碎后的上清部分和沉淀部分。3、4為6h誘導(dǎo)時間下，經(jīng)超聲波破碎后的上清部分和沉淀部分；右圖為含pCold-TF-TML2的菌株在15oC、1mMIPTG誘導(dǎo)條件下，經(jīng)超聲波破碎后的蛋白情況，其中M為ProteinMarker，1、2分別為0h誘導(dǎo)時間下，經(jīng)超聲波破碎后的上清部分和沉淀部分。3、4為24h誘導(dǎo)時間下，經(jīng)超聲波破碎后的上清部分和沉淀部分。2.2.3表達(dá)產(chǎn)物的WesternBlot分析對SDS所得條帶進(jìn)行Western-Blot分析，結(jié)果（圖11）顯示，沉淀中有大量蛋白。75kD75kD圖11含pGEX-6P-1-TML2表達(dá)載體的菌株蛋白表達(dá)情況的WesternBlot分析。其中M為ProteinMarker；1為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株；2為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株，超聲波破碎后的沉淀；3為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌株，超聲波破碎后的上清液。2.3總結(jié)本項目通過RNA提取和反轉(zhuǎn)錄的方法成功獲得了野生型蒺藜苜蓿A17的cDNA；通過PCR技術(shù)成功從中克隆得到TML2基因；利用無縫克隆技術(shù)完成了pGEX-6P-1-TML2和pCold-TF-TML2原核表達(dá)載體的構(gòu)建；成功將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Rosetta并完成表達(dá)；確定了TML2蛋白的表達(dá)部位少量位于上清，大量位于沉淀中，形成包涵體。所得結(jié)果和經(jīng)驗為下一步繼續(xù)分離和純化TML2蛋白奠定了基礎(chǔ)。致謝感謝蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院給予我們這次科研訓(xùn)練的機(jī)會。感謝我們的導(dǎo)師陳玉輝老師，不論是在完成實驗項目過程中遇到的問題，還是對于日后的人生道路選擇，陳老師都極其耐心解答我們的困惑，并主動分享寶貴的人生經(jīng)驗，我們受益匪淺。感謝李宇赫師兄、裴悅師姐在日常的實驗中給予我們的悉心指導(dǎo)與耐心講解。感謝在項目進(jìn)行過程中團(tuán)隊成員：周千行、白婉欣、陳龍文、劉琳、李堃宇五名同學(xué)之間的合作互助。也感謝同實驗室其他師兄師姐指導(dǎo)與幫助。參考文獻(xiàn)[1]FuguiZhuetal.ACEPPeptideReceptor-LikeKinaseRegulatesAuxinBiosynthesisandEthyleneSignalingtoCoordinateRootGrowthandSymbioticNodulationinMedicagotruncatula.PlantCell.2020Sep;32(9):2855-2877.[2]GautratP,LaffontC,FrugierF.CompactRootArchitecture2PromotesRootCompetenceforNodulationthroughthemiR2111SystemicEffector.CurrBiol.2020Apr6;30(7):1339-1345.e3.doi:10.1016/j.cub.2020.01.084.Epub2020Feb27.PMID:32109394.[3]Masahiro,Takahara,Shimpei,Magori,Takashi,Soyano,Satoru,Okamoto,Chie,Yoshida,Koji,Yano,Shusei,Sato,Satoshi,Tabata,Katsushi,Yamaguchi,Shuji,Shigenobu,Naoya,Take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22.4(2010):259-68.[5]陳愛民,連瑞麗,孫杰,等.豆科模式植物——蒺藜苜蓿.植物生理學(xué)報,2006,42(5):997-1003.作者簡介：白婉欣，女，1998年9月出生于陜西省神木縣，2017年從西安市鐵一中學(xué)考入蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。在校期間積極參加各種活動，刻苦學(xué)習(xí)。大學(xué)四年期間參與多項創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目，均順利結(jié)項，有較為豐富的科研經(jīng)歷。曾在校學(xué)生會秘書處、院學(xué)生會媒體中心任職，工作認(rèn)真，責(zé)任心較強(qiáng)，有一定領(lǐng)導(dǎo)能力。李堃宇，男，2000年3月出生于山西省呂梁市離石區(qū)，2018年從呂梁市高級中學(xué)考入蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，在校期間被評為“蘭州大學(xué)優(yōu)秀共青團(tuán)員”、“優(yōu)秀學(xué)生