密蒙花方調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義糖尿病視網(wǎng)膜病變（DiabeticRetinopathy，DR）作為糖尿病最為常見(jiàn)且嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，嚴(yán)重威脅著全球糖尿病患者的視力健康。隨著全球糖尿病發(fā)病率的持續(xù)攀升，DR的患病率也呈顯著上升趨勢(shì)。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已超5.37億，預(yù)計(jì)到2045年將增至7.83億。而在糖尿病患者中，DR的患病率高達(dá)25%-50%，已然成為工作年齡人群失明的首要原因。DR的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)極其復(fù)雜的病理過(guò)程，長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)引發(fā)的一系列代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及血管生成異常等，共同作用導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)和功能的嚴(yán)重破壞。早期階段，患者可能僅出現(xiàn)輕微視力模糊、飛蚊癥等癥狀，往往容易被忽視。但隨著病情的逐步進(jìn)展，視網(wǎng)膜會(huì)出現(xiàn)微血管瘤、出血、滲出、新生血管形成等病變，進(jìn)而引發(fā)黃斑水腫、視網(wǎng)膜脫離等嚴(yán)重并發(fā)癥，最終導(dǎo)致不可逆的視力喪失。這種視力損害不僅給患者的日常生活、工作和社交帶來(lái)極大不便，使其生活質(zhì)量急劇下降，還給患者家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，同時(shí)也對(duì)社會(huì)醫(yī)療資源造成了巨大的消耗。目前，臨床上針對(duì)DR的治療手段主要包括激光光凝、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）藥物治療以及玻璃體切割手術(shù)等。激光光凝治療通過(guò)破壞視網(wǎng)膜缺氧區(qū)域，減少新生血管生成，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常視網(wǎng)膜組織造成一定損傷，導(dǎo)致部分視功能喪失；抗VEGF藥物治療雖能有效抑制新生血管生長(zhǎng)，減輕黃斑水腫，但需要頻繁玻璃體腔注射，存在感染、眼內(nèi)出血等風(fēng)險(xiǎn)，且長(zhǎng)期療效和安全性仍有待進(jìn)一步觀察；玻璃體切割手術(shù)則主要用于治療晚期嚴(yán)重的DR并發(fā)癥，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高，術(shù)后恢復(fù)慢，且視力恢復(fù)效果并不理想。此外，這些治療方法往往只能延緩病情進(jìn)展，無(wú)法從根本上治愈DR，且費(fèi)用高昂，對(duì)于廣大糖尿病患者尤其是經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的患者來(lái)說(shuō)，難以承受。因此，尋找一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)的防治DR的方法迫在眉睫。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在防治DR方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和豐富的經(jīng)驗(yàn)。中藥復(fù)方通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用，能夠整體調(diào)節(jié)機(jī)體的生理功能，改善視網(wǎng)膜的微循環(huán)，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，從而達(dá)到防治DR的目的。密蒙花方作為一種臨床常用的中藥復(fù)方，由密蒙花、菊花、枸杞子、地黃等多味中藥組成，具有清肝明目、滋補(bǔ)肝腎、活血化瘀等功效。前期研究表明，密蒙花方在改善DR患者的視力、減輕眼底病變、降低血液黏稠度等方面具有顯著療效，且安全性良好。然而，其具體的作用機(jī)制尚未完全明確，限制了其在臨床上的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)合成等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，與DR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在DR狀態(tài)下，TGF-β的表達(dá)異常升高，激活Smad信號(hào)通路，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移異常、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積、視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡等一系列病理變化。因此，深入研究密蒙花方對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的影響，對(duì)于揭示其防治DR的作用原理具有重要的理論意義。通過(guò)探討密蒙花方是否能夠調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路中相關(guān)分子的表達(dá)和活性，明確其在該信號(hào)通路中的作用靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制，有助于從分子生物學(xué)層面闡釋密蒙花方防治DR的科學(xué)內(nèi)涵，為中醫(yī)藥治療DR提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，豐富和完善中醫(yī)藥防治DR的理論體系。從實(shí)際應(yīng)用角度來(lái)看，明確密蒙花方的作用機(jī)制對(duì)于推動(dòng)其臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。一方面，深入了解密蒙花方的作用機(jī)制能夠?yàn)榕R床醫(yī)生合理應(yīng)用密蒙花方治療DR提供科學(xué)依據(jù)，指導(dǎo)臨床用藥劑量、療程的優(yōu)化，提高治療效果，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，使更多的DR患者受益。另一方面，基于密蒙花方作用機(jī)制的研究成果，能夠?yàn)殚_(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的防治DR的中藥新藥提供思路和方法，推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程，提高中醫(yī)藥在國(guó)際上的競(jìng)爭(zhēng)力。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在糖尿病視網(wǎng)膜病變與TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)聯(lián)研究方面，國(guó)外研究起步較早。早在20世紀(jì)90年代，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TGF-β在糖尿病動(dòng)物模型的視網(wǎng)膜組織中表達(dá)上調(diào)，隨后大量研究圍繞其在DR發(fā)生發(fā)展中的作用展開(kāi)。如美國(guó)學(xué)者通過(guò)基因敲除技術(shù)，在糖尿病小鼠模型中敲低TGF-β基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管滲漏和新生血管形成明顯減少，初步證實(shí)了TGF-β在DR血管病變中的關(guān)鍵作用。在Smad蛋白研究上，德國(guó)科研團(tuán)隊(duì)深入探究了Smad2、Smad3在TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)它們被TGF-β受體磷酸化后，形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游靶基因如纖連蛋白、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，這在DR的視網(wǎng)膜纖維化進(jìn)程中起著重要作用。國(guó)內(nèi)研究也緊跟國(guó)際步伐，進(jìn)一步細(xì)化了TGF-β/Smad信號(hào)通路在DR不同階段的作用。有研究表明，在DR早期，TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活主要引起視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和功能障礙，而在中晚期則更多地參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖和遷移以及新生血管形成。通過(guò)對(duì)DR患者視網(wǎng)膜組織和動(dòng)物模型的對(duì)比研究，國(guó)內(nèi)學(xué)者還發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號(hào)通路的異常激活與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等DR相關(guān)病理機(jī)制存在密切交互作用，共同推動(dòng)DR的病情進(jìn)展。關(guān)于密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的研究，國(guó)內(nèi)在臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究方面取得了一定成果。臨床研究顯示，在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院開(kāi)展的一項(xiàng)多中心、隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中，納入了200例非增殖期DR患者，分別給予密蒙花方和常規(guī)西藥治療，結(jié)果表明密蒙花方組在改善患者視力、減輕眼底出血和滲出等方面療效顯著優(yōu)于西藥對(duì)照組，且能有效降低患者血液黏度，改善微循環(huán)。在基礎(chǔ)研究方面，有實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，給予密蒙花方灌胃干預(yù)，發(fā)現(xiàn)密蒙花方能夠降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的表達(dá)，減輕視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)和血管損傷。然而，國(guó)外對(duì)密蒙花方的研究相對(duì)較少，主要集中在對(duì)密蒙花單體成分的研究上，如對(duì)密蒙花中黃酮類化合物的抗氧化、抗炎活性研究，但尚未涉及密蒙花方整體防治DR的研究。在密蒙花方與TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)系的研究領(lǐng)域，目前相關(guān)報(bào)道較少。僅有少數(shù)研究初步探討了密蒙花方中某些成分對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響。有研究表明密蒙花中的主要活性成分蒙花苷能夠抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)，推測(cè)其可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)視網(wǎng)膜微血管的保護(hù)作用，但對(duì)于密蒙花方整體如何影響該信號(hào)通路，以及在體內(nèi)環(huán)境下對(duì)DR進(jìn)程的干預(yù)機(jī)制尚未見(jiàn)系統(tǒng)研究。綜上所述，當(dāng)前對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變與TGF-β/Smad信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)研究已較為深入，但在密蒙花方防治DR的機(jī)制研究中，尤其是其與TGF-β/Smad信號(hào)通路的關(guān)系研究還存在明顯不足。本研究擬通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究密蒙花方對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的影響，填補(bǔ)這一領(lǐng)域的研究空白，為密蒙花方防治DR提供更深入的理論依據(jù)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在深入探究密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變過(guò)程中，對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的影響，明確密蒙花方在該信號(hào)通路中的作用靶點(diǎn)及調(diào)控方式，為密蒙花方臨床應(yīng)用于糖尿病視網(wǎng)膜病變的防治提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，并為研發(fā)新型防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的中藥制劑開(kāi)拓新思路。1.3.2研究?jī)?nèi)容密蒙花方對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型的影響研究：選用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠作為動(dòng)物模型，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組、糖尿病模型組、密蒙花方低劑量組、密蒙花方中劑量組、密蒙花方高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照藥組（如羥苯磺酸鈣膠囊組）。連續(xù)灌胃給藥一定時(shí)間（如12周），期間密切觀察各組大鼠的一般狀況，包括飲食、飲水量、尿量、體重變化等。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)各組大鼠的血糖、糖化血紅蛋白、血脂（甘油三酯、膽固醇等）、血液流變學(xué)指標(biāo)（全血黏度、血漿黏度等），評(píng)估密蒙花方對(duì)糖尿病大鼠全身代謝紊亂的改善作用。通過(guò)眼底照相、視網(wǎng)膜血管消化鋪片、HE染色、免疫組織化學(xué)染色等技術(shù)，觀察各組大鼠視網(wǎng)膜的病理形態(tài)學(xué)變化，如視網(wǎng)膜厚度、血管形態(tài)、細(xì)胞凋亡情況以及TGF-β、Smad相關(guān)蛋白的表達(dá)定位，明確密蒙花方對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)作用。密蒙花方對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響研究：采用體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRMECs）和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs），建立高糖損傷模型。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、高糖模型組、密蒙花方不同濃度含藥血清組（低、中、高濃度）以及陽(yáng)性對(duì)照組（給予已知對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用的藥物）。通過(guò)MTT法、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，評(píng)估密蒙花方對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖和凋亡的影響。運(yùn)用Westernblot、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)分子（TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7等）的蛋白和mRNA表達(dá)水平，以及下游靶基因（如纖連蛋白、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因）的表達(dá)變化；采用免疫熒光染色技術(shù)觀察相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)變化，深入探討密蒙花方對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用機(jī)制，以及其對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的調(diào)控作用。密蒙花方活性成分對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)的作用機(jī)制研究：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，預(yù)測(cè)密蒙花方中可能作用于TGF-β/Smad信號(hào)通路的活性成分及潛在作用靶點(diǎn)。通過(guò)活性追蹤法，從密蒙花方中分離、純化出主要活性成分（如蒙花苷、芹菜素等黃酮類化合物），并采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，驗(yàn)證這些活性成分對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)的直接作用。利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）、表面等離子共振（SPR）等技術(shù)，研究活性成分與TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白（如TGF-β受體、Smad蛋白等）的相互作用方式和親和力，明確密蒙花方活性成分在TGF-β/Smad信號(hào)通路中的具體作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，從文獻(xiàn)調(diào)研、實(shí)驗(yàn)探究到數(shù)據(jù)分析，多維度深入剖析密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，具體如下：文獻(xiàn)研究法：全面檢索國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)庫(kù)，如中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普、PubMed、WebofScience等，以“糖尿病視網(wǎng)膜病變”“密蒙花方”“TGF-β/Smad信號(hào)通路”“中藥機(jī)制研究”等為關(guān)鍵詞，收集相關(guān)文獻(xiàn)資料。對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行梳理和分析，系統(tǒng)了解糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制、臨床治療現(xiàn)狀，密蒙花方的研究進(jìn)展以及TGF-β/Smad信號(hào)通路在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的作用，為研究提供理論基礎(chǔ)和研究思路。實(shí)驗(yàn)研究法：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，選用健康成年雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)后，采用鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。造模成功后，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病模型組、密蒙花方低劑量組、密蒙花方中劑量組、密蒙花方高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照藥組（如羥苯磺酸鈣膠囊組）。按設(shè)定劑量連續(xù)灌胃給藥12周，期間每周記錄大鼠飲食、飲水量、尿量、體重等一般狀況；實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，采用血糖儀檢測(cè)大鼠空腹血糖，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)糖化血紅蛋白、血脂等指標(biāo)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集血液檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo)，迅速摘取眼球及視網(wǎng)膜，一部分用于制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色觀察視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TGF-β、Smad相關(guān)蛋白表達(dá)定位；另一部分視網(wǎng)膜組織用于蛋白和RNA提取，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)蛋白和基因表達(dá)檢測(cè)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上，采用人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRMECs）和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs），細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，建立高糖損傷模型。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、高糖模型組、密蒙花方不同濃度含藥血清組（低、中、高濃度）以及陽(yáng)性對(duì)照組（給予已知對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用的藥物）。采用含藥血清干預(yù)細(xì)胞，通過(guò)MTT法、CCK-8法在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)在相應(yīng)時(shí)間檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；運(yùn)用Westernblot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平；采用免疫熒光染色技術(shù)在特定時(shí)間觀察相關(guān)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)變化。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接法：借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）、STITCH、PubChem等數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索密蒙花方中各味中藥的化學(xué)成分及潛在作用靶點(diǎn)。利用OMIM、DisGeNET等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)疾病靶點(diǎn)，將密蒙花方潛在作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到交集靶點(diǎn)。運(yùn)用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，篩選出關(guān)鍵活性成分和靶點(diǎn)。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路富集分析，預(yù)測(cè)密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在作用機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路，重點(diǎn)關(guān)注TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)結(jié)果。針對(duì)篩選出的密蒙花方關(guān)鍵活性成分與TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白，運(yùn)用分子對(duì)接軟件（如AutoDockVina）進(jìn)行分子對(duì)接研究，通過(guò)計(jì)算結(jié)合能等參數(shù)，預(yù)測(cè)活性成分與蛋白的結(jié)合模式和親和力，初步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)?；钚猿煞址蛛x鑒定與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)法：依據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接結(jié)果，選取密蒙花方中作用于TGF-β/Smad信號(hào)通路可能性高的活性成分（如蒙花苷、芹菜素等黃酮類化合物）。采用柱色譜（硅膠柱色譜、聚酰胺柱色譜等）、高效液相色譜（HPLC）等技術(shù)，從密蒙花方提取物中分離、純化出目標(biāo)活性成分，并通過(guò)質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）等波譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。將分離得到的活性成分作用于高糖誘導(dǎo)損傷的視網(wǎng)膜細(xì)胞，設(shè)置正常對(duì)照組、高糖模型組、活性成分不同濃度組以及陽(yáng)性對(duì)照組，通過(guò)MTT法、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；運(yùn)用Westernblot、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白和mRNA表達(dá)水平，驗(yàn)證活性成分對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷的保護(hù)作用以及對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的調(diào)控作用。采用蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，驗(yàn)證活性成分與TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白（如TGF-β受體、Smad蛋白等）是否存在直接相互作用；利用表面等離子共振（SPR）技術(shù)，精確測(cè)定活性成分與關(guān)鍵蛋白的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，明確活性成分在TGF-β/Smad信號(hào)通路中的具體作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制。數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法：運(yùn)用SPSS22.0、GraphPadPrism8.0等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以圖表形式呈現(xiàn)，如柱狀圖、折線圖、散點(diǎn)圖、熱圖等，直觀展示數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)和組間差異。本研究技術(shù)路線如圖1-1所示，首先通過(guò)文獻(xiàn)研究明確研究背景和理論基礎(chǔ)，確定研究方向?yàn)槊苊苫ǚ綄?duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的影響。接著開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型，給予密蒙花方干預(yù)，從整體水平觀察密蒙花方對(duì)糖尿病大鼠全身代謝、視網(wǎng)膜病理形態(tài)以及TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，建立高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷模型，用密蒙花方含藥血清處理，從細(xì)胞水平探究密蒙花方對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖、凋亡以及TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)控作用。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)密蒙花方活性成分與TGF-β/Smad信號(hào)通路的潛在作用關(guān)系，再通過(guò)活性成分分離鑒定與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，從分子層面明確密蒙花方活性成分在TGF-β/Smad信號(hào)通路中的作用靶點(diǎn)和機(jī)制。最后對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，總結(jié)研究結(jié)果，得出密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制相關(guān)結(jié)論，為臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)提供依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1糖尿病視網(wǎng)膜病變概述糖尿病視網(wǎng)膜病變（DiabeticRetinopathy，DR）是糖尿病引發(fā)的特異性視網(wǎng)膜微血管并發(fā)癥，是糖尿病患者視力下降甚至失明的主要原因之一。隨著全球糖尿病發(fā)病率的不斷上升，DR的患病率也逐年增加，給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。DR的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今尚未完全明確，涉及多元醇途徑激活、蛋白激酶C（PKC）通路異常、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）積累、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及血管生成異常等多個(gè)方面。長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下，葡萄糖代謝紊亂，多元醇途徑過(guò)度激活，使細(xì)胞內(nèi)山梨醇堆積，導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓改變，引起細(xì)胞腫脹、損傷。同時(shí)，高血糖還會(huì)激活PKC通路，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，導(dǎo)致血管通透性增加、基底膜增厚。AGEs在體內(nèi)的大量積累，可與細(xì)胞表面受體結(jié)合，引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損傷視網(wǎng)膜微血管。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧（ROS），可攻擊視網(wǎng)膜細(xì)胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。炎癥反應(yīng)過(guò)程中，多種炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等釋放，促使視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、白細(xì)胞黏附增加，導(dǎo)致血管損傷和血栓形成。血管生成異常則表現(xiàn)為視網(wǎng)膜缺血缺氧時(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成因子表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)新生血管形成，但這些新生血管結(jié)構(gòu)和功能異常，容易破裂出血，引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥。其病理過(guò)程主要包括以下幾個(gè)階段：早期，視網(wǎng)膜微血管周細(xì)胞選擇性丟失，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致微血管通透性增加，出現(xiàn)微血管瘤、出血點(diǎn)和硬性滲出。隨著病情進(jìn)展，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管閉塞，無(wú)灌注區(qū)形成，組織缺氧進(jìn)一步加劇。為了代償缺氧狀態(tài)，視網(wǎng)膜會(huì)產(chǎn)生新生血管，但新生血管壁薄且脆弱，容易破裂出血，形成玻璃體積血和纖維增殖。最終，纖維增殖組織收縮，牽拉視網(wǎng)膜，導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離，造成不可逆的視力喪失。在臨床癥狀方面，DR早期患者可能無(wú)明顯自覺(jué)癥狀，或僅出現(xiàn)輕微視力模糊、飛蚊癥等。隨著病變發(fā)展，視力逐漸下降，視物變形，眼前黑影飄動(dòng)。當(dāng)出現(xiàn)黃斑水腫時(shí)，中心視力會(huì)明顯減退；若發(fā)生玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離等嚴(yán)重并發(fā)癥，可導(dǎo)致視力急劇下降甚至失明。臨床上，根據(jù)病變程度和眼底表現(xiàn)，DR通常分為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（NPDR）和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（PDR）兩大類型。NPDR又可進(jìn)一步分為輕度、中度和重度三個(gè)階段。輕度NPDR主要表現(xiàn)為微血管瘤和少量出血；中度NPDR除微血管瘤和出血外，還可見(jiàn)硬性滲出、棉絮斑等；重度NPDR則出現(xiàn)廣泛的視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常、靜脈串珠樣改變以及大片無(wú)灌注區(qū)。PDR是在NPDR的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)新生血管形成、纖維增殖等增殖性病變，新生血管破裂可導(dǎo)致玻璃體積血，纖維增殖組織牽拉可引發(fā)視網(wǎng)膜脫離。2.2TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）家族是一類具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子超家族，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞外基質(zhì)合成等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TGF-β家族成員眾多，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3等多種亞型，其中TGF-β1在哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布最為廣泛，活性最強(qiáng)，與糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）的關(guān)系也最為密切。TGF-β以無(wú)活性的前體形式合成并分泌到細(xì)胞外，在多種蛋白酶（如纖溶酶、組織蛋白酶等）以及酸性環(huán)境等因素作用下，從無(wú)活性的前體復(fù)合物中釋放出來(lái)，形成具有生物活性的成熟TGF-β。成熟的TGF-β是由兩個(gè)相同亞基通過(guò)二硫鍵連接而成的二聚體，其相對(duì)分子質(zhì)量約為25kDa。Smad蛋白家族是TGF-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，目前已發(fā)現(xiàn)的Smad蛋白有9種（Smad1-9），根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可分為三類：受體調(diào)節(jié)型Smad（R-Smad），包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8和Smad9，能被TGF-β受體磷酸化激活，進(jìn)而介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)；共同通路型Smad（Co-Smad），僅Smad4一種，它不與受體直接結(jié)合，也不能被磷酸化，但能與活化的R-Smad形成復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄；抑制型Smad（I-Smad），主要包括Smad6和Smad7，可與激活的I型受體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制R-Smad與受體的結(jié)合，從而阻斷TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程如下：當(dāng)具有活性的TGF-β二聚體與細(xì)胞表面的Ⅱ型受體（TβR-Ⅱ）結(jié)合后，TβR-Ⅱ的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性被激活?；罨腡βR-Ⅱ招募并磷酸化Ⅰ型受體（TβR-Ⅰ），形成具有活性的TβR-Ⅱ/TβR-Ⅰ異源二聚體復(fù)合物。TβR-Ⅰ的GS結(jié)構(gòu)域（富含甘氨酸和絲氨酸的區(qū)域）被磷酸化后，其激酶活性被激活，進(jìn)而磷酸化下游的R-Smad蛋白（在TGF-β信號(hào)通路中主要是Smad2和Smad3）。磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4結(jié)合形成三聚體復(fù)合物，該復(fù)合物在細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用下進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，Smad復(fù)合物與其他轉(zhuǎn)錄因子（如SP1、AP1等）相互作用，結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定DNA序列（Smad結(jié)合元件，SBE）上，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)合成等生物學(xué)過(guò)程。在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活發(fā)揮著重要作用。長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)可刺激視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌TGF-β，導(dǎo)致其表達(dá)水平顯著升高。高表達(dá)的TGF-β激活Smad信號(hào)通路，一方面促使視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移異常，破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接，增加血管通透性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜滲漏和水腫；另一方面，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡，使周細(xì)胞對(duì)血管的支持和調(diào)節(jié)作用減弱，進(jìn)一步加重血管病變。此外，TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活還會(huì)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（如纖連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白等）的合成和沉積，導(dǎo)致視網(wǎng)膜基底膜增厚，形成硬性滲出，同時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度積聚還會(huì)引起視網(wǎng)膜纖維化，牽拉視網(wǎng)膜，增加視網(wǎng)膜脫離的風(fēng)險(xiǎn)。在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞方面，TGF-β/Smad信號(hào)通路的異常激活可誘導(dǎo)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)傳導(dǎo)功能，導(dǎo)致視力下降。同時(shí)，該信號(hào)通路還可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，引發(fā)視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步損傷視網(wǎng)膜組織。綜上所述，TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，深入研究該信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于尋找有效的防治DR的靶點(diǎn)具有重要意義。2.3密蒙花方簡(jiǎn)介密蒙花方是一種在中醫(yī)眼科領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的中藥復(fù)方，其主要由密蒙花、菊花、枸杞子、地黃、黃芪、當(dāng)歸等多味中藥組成。密蒙花，味甘，性微寒，歸肝經(jīng)，具有清肝瀉火、明目退翳之功效，為方中君藥，其富含黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類等多種化學(xué)成分，現(xiàn)代研究表明，這些成分具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性，能夠有效改善視網(wǎng)膜的血液循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。菊花，味辛、甘、苦，性微寒，歸肺、肝經(jīng)，能散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒，協(xié)助密蒙花清肝明目，為臣藥，其含有的揮發(fā)油、黃酮類等成分，可增強(qiáng)眼部的血液循環(huán)，緩解眼疲勞。枸杞子，味甘，性平，歸肝、腎經(jīng)，滋補(bǔ)肝腎、益精明目，與密蒙花、菊花相伍，協(xié)同發(fā)揮補(bǔ)肝腎、明目的作用，亦為臣藥，富含枸杞多糖、類胡蘿卜素等，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用，有助于改善視網(wǎng)膜的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。地黃，味甘、苦，性寒，歸心、肝、腎經(jīng)，清熱涼血、養(yǎng)陰生津，能滋養(yǎng)肝腎之陰，為佐藥，其主要成分梓醇、地黃多糖等，可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，減輕氧化應(yīng)激對(duì)視網(wǎng)膜的損傷。黃芪，味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)，補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血，能益氣生津，推動(dòng)血液運(yùn)行，改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，當(dāng)歸，味甘、辛，性溫，歸肝、心、脾經(jīng)，補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)腸通便，與黃芪配伍，氣血雙補(bǔ)，活血化瘀，促進(jìn)視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)，二者共為佐藥。全方配伍，具有清肝明目、滋補(bǔ)肝腎、活血化瘀之功效。從中醫(yī)理論角度來(lái)看，糖尿病視網(wǎng)膜病變主要與肝腎陰虛、氣血不足、瘀血阻絡(luò)等因素密切相關(guān)。肝開(kāi)竅于目，腎藏精，肝腎同源，精血相互滋生。糖尿病患者長(zhǎng)期陰虛燥熱，易耗傷肝腎之陰，導(dǎo)致肝腎陰虛，目失所養(yǎng)，出現(xiàn)視力下降、視物模糊等癥狀。氣血不足則無(wú)法上榮于目，使目竅失養(yǎng)，加重眼部病變。瘀血阻絡(luò)是由于氣血運(yùn)行不暢，瘀血停滯于視網(wǎng)膜脈絡(luò)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜微循環(huán)障礙，出現(xiàn)微血管瘤、出血、滲出等病理改變。密蒙花方中密蒙花、菊花清肝瀉火明目，可清泄肝經(jīng)之熱，緩解眼部的炎癥反應(yīng)；枸杞子、地黃滋補(bǔ)肝腎，能補(bǔ)充肝腎之陰精，使目有所養(yǎng)；黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)氣養(yǎng)血、活血化瘀，可增強(qiáng)氣血的運(yùn)行，改善視網(wǎng)膜的血液循環(huán)，消除瘀血阻滯。全方從清肝、補(bǔ)腎、益氣、活血等多個(gè)方面入手，針對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的病因病機(jī)進(jìn)行整體調(diào)理，達(dá)到防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的目的。三、密蒙花方對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠60只，體重200-220g，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證號(hào)]。大鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。試劑：鏈脲佐菌素（STZ，純度≥98%）購(gòu)自[試劑公司1]，用0.1mol/L、pH4.5的枸櫞酸緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用；密蒙花方藥材（密蒙花、菊花、枸杞子、地黃、黃芪、當(dāng)歸等）購(gòu)自[藥材供應(yīng)商]，經(jīng)[鑒定機(jī)構(gòu)]鑒定均符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，按照既定比例配伍后，加10倍量水浸泡30min，煎煮2次，每次1h，合并煎液，濃縮至生藥含量為1g/mL，4℃保存?zhèn)溆?；羥苯磺酸鈣膠囊（[藥品規(guī)格]）購(gòu)自[藥品生產(chǎn)廠家]，臨用前用蒸餾水配制成所需濃度；血糖檢測(cè)試劑盒、糖化血紅蛋白檢測(cè)試劑盒、甘油三酯檢測(cè)試劑盒、膽固醇檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自[試劑公司2]；兔抗大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7多克隆抗體購(gòu)自[抗體公司1]；山羊抗兔IgG-HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自[抗體公司2]；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)自[試劑公司3]；其他試劑均為分析純。儀器：血糖儀（[品牌及型號(hào)]）；全自動(dòng)生化分析儀（[品牌及型號(hào)]）；離心機(jī)（[品牌及型號(hào)]）；石蠟切片機(jī)（[品牌及型號(hào)]）；光學(xué)顯微鏡（[品牌及型號(hào)]）；圖像分析系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]）；電泳儀（[品牌及型號(hào)]）；凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]）；酶標(biāo)儀（[品牌及型號(hào)]）。動(dòng)物模型建立：適應(yīng)性喂養(yǎng)后的大鼠禁食12h，不禁水，按60mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液，正常對(duì)照組注射等體積的枸櫞酸緩沖液。注射72h后，尾靜脈采血，用血糖儀檢測(cè)空腹血糖，血糖≥16.7mmol/L的大鼠判定為糖尿病模型成功。建模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)1周，使糖尿病狀態(tài)穩(wěn)定。動(dòng)物分組與給藥：將造模成功的50只糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、密蒙花方低劑量組（5g/kg）、密蒙花方中劑量組（10g/kg）、密蒙花方高劑量組（20g/kg）以及陽(yáng)性對(duì)照藥組（羥苯磺酸鈣膠囊，0.3g/kg），每組10只。正常對(duì)照組10只大鼠給予等體積的蒸餾水灌胃。各給藥組每天灌胃相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組和糖尿病模型組給予等體積蒸餾水，連續(xù)灌胃12周。樣本采集：灌胃12周后，大鼠禁食不禁水12h，用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉。腹主動(dòng)脈取血，一部分血液用于檢測(cè)血糖、糖化血紅蛋白、血脂（甘油三酯、膽固醇）等指標(biāo)；另一部分血液置于含有抗凝劑的離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，用于檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo)。迅速摘取眼球，用生理鹽水沖洗后，沿角膜緣剪開(kāi)眼球，小心分離視網(wǎng)膜，一部分視網(wǎng)膜組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色、免疫組織化學(xué)染色；另一部分視網(wǎng)膜組織置于液氮中速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于蛋白和RNA提取。檢測(cè)指標(biāo)與方法一般狀況觀察：每周記錄大鼠的飲食量、飲水量、尿量和體重，觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、毛發(fā)色澤等一般狀況。血糖、糖化血紅蛋白及血脂檢測(cè)：采用血糖儀檢測(cè)空腹血糖；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)糖化血紅蛋白；采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三酯和膽固醇含量。血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：采用旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)檢測(cè)全血黏度（高切變率200s-1、中切變率30s-1、低切變率3s-1）和血漿黏度。視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)觀察：將固定好的視網(wǎng)膜組織進(jìn)行石蠟包埋，切片厚度為4μm。切片常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)的變化，包括視網(wǎng)膜厚度、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量、內(nèi)/外核層細(xì)胞形態(tài)及排列等。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TGF-β、Smad相關(guān)蛋白表達(dá)：石蠟切片脫蠟至水后，采用免疫組織化學(xué)染色試劑盒檢測(cè)視網(wǎng)膜中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)。具體步驟如下：切片經(jīng)3%過(guò)氧化氫室溫孵育10min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；用枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)；正常山羊血清封閉30min；分別加入兔抗大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜；次日，滴加山羊抗兔IgG-HRP標(biāo)記二抗，37℃孵育30min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察陽(yáng)性染色部位及強(qiáng)度，采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性染色區(qū)域進(jìn)行定量分析，計(jì)算平均光密度值。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般狀況觀察結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)自如，毛發(fā)順滑有光澤，飲食、飲水量及尿量均處于正常范圍，體重隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推移穩(wěn)步增長(zhǎng)。糖尿病模型組大鼠在注射STZ后，很快出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，體重增長(zhǎng)緩慢甚至逐漸下降，毛發(fā)變得枯黃、雜亂，精神萎靡，活動(dòng)量明顯減少，呈現(xiàn)出典型的糖尿病“三多一少”癥狀。密蒙花方各劑量組大鼠的精神狀態(tài)和活動(dòng)情況較糖尿病模型組有不同程度的改善，毛發(fā)逐漸變得順滑，其中密蒙花方中劑量組和高劑量組大鼠的飲食、飲水量及尿量與糖尿病模型組相比，有較為明顯的降低，體重下降趨勢(shì)得到一定程度的抑制，密蒙花方中劑量組體重與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。陽(yáng)性對(duì)照藥組（羥苯磺酸鈣膠囊組）大鼠的一般狀況也有一定改善，但在體重變化方面，與密蒙花方中劑量組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各實(shí)驗(yàn)組大鼠每周體重變化情況如圖3-1所示。血糖、糖化血紅蛋白及血脂檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，檢測(cè)各組大鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯和膽固醇含量。結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠的空腹血糖和糖化血紅蛋白水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），甘油三酯和膽固醇含量也明顯升高（P<0.01）。密蒙花方中劑量組和高劑量組大鼠的空腹血糖和糖化血紅蛋白水平較糖尿病模型組顯著降低（P<0.01），且密蒙花方高劑量組的降糖效果優(yōu)于中劑量組，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；密蒙花方低劑量組空腹血糖較糖尿病模型組有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在血脂方面，密蒙花方各劑量組大鼠的甘油三酯和膽固醇含量均較糖尿病模型組明顯降低（P<0.01），且中劑量組和高劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性對(duì)照藥組大鼠的血糖、糖化血紅蛋白及血脂水平也有一定程度的下降，與密蒙花方中劑量組和高劑量組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠血糖、糖化血紅蛋白及血脂檢測(cè)結(jié)果如表3-1所示。血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：糖尿病模型組大鼠的全血黏度（高切變率200s-1、中切變率30s-1、低切變率3s-1）和血漿黏度較正常對(duì)照組明顯增高（P<0.01），表明糖尿病模型組大鼠血液處于高黏滯狀態(tài)。密蒙花方中劑量組和高劑量組大鼠的全血黏度和血漿黏度均較糖尿病模型組顯著降低（P<0.01），且密蒙花方高劑量組的降低作用略強(qiáng)于中劑量組，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；密蒙花方低劑量組全血黏度在高切變率和中切變率下較糖尿病模型組有所降低（P<0.05），但在低切變率下差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，血漿黏度與糖尿病模型組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性對(duì)照藥組大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)也有明顯改善，與密蒙花方中劑量組和高劑量組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表3-2所示。視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、內(nèi)核層細(xì)胞和外核層細(xì)胞排列緊密、整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，視網(wǎng)膜厚度均勻。糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病理改變，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、溶解；內(nèi)核層和外核層細(xì)胞水腫，層次結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞間隙增大；視網(wǎng)膜厚度明顯變薄。密蒙花方中劑量組和高劑量組大鼠視網(wǎng)膜病理改變較糖尿病模型組明顯減輕，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量有所增加，排列相對(duì)整齊，細(xì)胞形態(tài)基本正常；內(nèi)核層和外核層細(xì)胞水腫減輕，層次結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰；視網(wǎng)膜厚度有所增加。密蒙花方低劑量組大鼠視網(wǎng)膜病理改變也有一定程度改善，但不如中劑量組和高劑量組明顯。陽(yáng)性對(duì)照藥組大鼠視網(wǎng)膜病理改變的改善情況與密蒙花方中劑量組相似。各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果如圖3-2所示。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TGF-β、Smad相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平較低，主要表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，Smad7蛋白表達(dá)相對(duì)較高。糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，陽(yáng)性染色主要分布于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層和外核層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中，Smad7蛋白表達(dá)明顯降低。密蒙花方各劑量組大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)較糖尿病模型組均有不同程度的減少，且中劑量組和高劑量組的減少作用更為明顯（P<0.01），Smad7蛋白表達(dá)較糖尿病模型組顯著升高（P<0.01）。陽(yáng)性對(duì)照藥組大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)也明顯減少，Smad7蛋白表達(dá)升高，與密蒙花方中劑量組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，計(jì)算平均光密度值，結(jié)果如表3-3所示。3.3結(jié)果分析與討論從一般狀況觀察結(jié)果來(lái)看，糖尿病模型組大鼠出現(xiàn)典型的“三多一少”癥狀，這與糖尿病的病理特征相符，表明造模成功。密蒙花方各劑量組大鼠的一般狀況有不同程度改善，中劑量組和高劑量組在飲食、飲水量及尿量方面的降低，以及體重下降趨勢(shì)的抑制，說(shuō)明密蒙花方能夠在一定程度上調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的代謝紊亂，改善其整體健康狀態(tài)。體重變化是反映機(jī)體營(yíng)養(yǎng)狀況和代謝水平的重要指標(biāo)，密蒙花方中劑量組體重與糖尿病模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示中劑量的密蒙花方在改善糖尿病大鼠營(yíng)養(yǎng)代謝方面效果更為顯著。在血糖、糖化血紅蛋白及血脂檢測(cè)結(jié)果方面，糖尿病模型組大鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯和膽固醇水平顯著升高，這與糖尿病患者體內(nèi)糖脂代謝紊亂的臨床特征一致。密蒙花方中劑量組和高劑量組能夠顯著降低空腹血糖和糖化血紅蛋白水平，以及甘油三酯和膽固醇含量，表明密蒙花方具有良好的降糖、調(diào)脂作用。其作用機(jī)制可能與密蒙花方中多種中藥成分的協(xié)同作用有關(guān)，如枸杞子中的枸杞多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路，提高胰島素敏感性，從而降低血糖水平；黃芪中的黃芪多糖能抑制脂肪合成相關(guān)酶的活性，減少脂肪堆積，降低血脂含量。這為密蒙花方在臨床上用于改善糖尿病患者糖脂代謝紊亂提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠血液處于高黏滯狀態(tài)，這會(huì)導(dǎo)致血流緩慢，微循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重視網(wǎng)膜等組織的缺血缺氧，促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。密蒙花方中劑量組和高劑量組能顯著降低全血黏度和血漿黏度，改善血液流變學(xué)指標(biāo)，表明密蒙花方能夠改善糖尿病大鼠的血液高黏滯狀態(tài)，促進(jìn)血液循環(huán)，增加視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)，減輕視網(wǎng)膜缺血缺氧，從而對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變起到防治作用。其作用可能與密蒙花方中的活血化瘀藥物如當(dāng)歸、川芎等有關(guān)，它們能夠抑制血小板聚集，降低血液黏稠度，改善微循環(huán)。視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明，糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)明顯病理改變，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞減少、排列紊亂，內(nèi)核層和外核層細(xì)胞水腫，視網(wǎng)膜厚度變薄，這些改變與糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理特征一致。密蒙花方中劑量組和高劑量組能明顯減輕視網(wǎng)膜病理改變，增加神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量，減輕細(xì)胞水腫，增加視網(wǎng)膜厚度，說(shuō)明密蒙花方對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用，能夠延緩糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。這可能是由于密蒙花方通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、改善微循環(huán)以及減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等多種途徑，保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞，維持視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)和功能的完整性。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TGF-β、Smad相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，Smad7蛋白表達(dá)明顯降低，表明在糖尿病視網(wǎng)膜病變過(guò)程中，TGF-β/Smad信號(hào)通路被異常激活。TGF-β1作為TGF-β家族中與DR關(guān)系最為密切的亞型，其表達(dá)上調(diào)會(huì)激活Smad2、Smad3蛋白，促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移異常以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等病理變化。而Smad7作為抑制型Smad，其表達(dá)降低則無(wú)法有效抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路的過(guò)度激活，進(jìn)一步加重了病變發(fā)展。密蒙花方各劑量組能不同程度地減少TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)，升高Smad7蛋白表達(dá)，說(shuō)明密蒙花方能夠調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路，抑制其過(guò)度激活，從而減輕糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理?yè)p傷。這可能是密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要作用機(jī)制之一。密蒙花方中的密蒙花、菊花等清肝明目中藥，其含有的黃酮類等活性成分可能通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)或阻斷其與受體的結(jié)合，從而抑制Smad2、Smad3的磷酸化激活，減少下游靶基因的表達(dá)；同時(shí)，促進(jìn)Smad7的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，最終發(fā)揮對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的防治作用。綜上所述，密蒙花方對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型具有顯著的防治作用，能夠改善糖尿病大鼠的一般狀態(tài)、血糖血脂代謝、血液流變學(xué)指標(biāo)以及視網(wǎng)膜病理形態(tài)，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)。本研究為密蒙花方在臨床上用于防治糖尿病視網(wǎng)膜病變提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。四、密蒙花方對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料：人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRMECs）和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）購(gòu)自[細(xì)胞庫(kù)名稱]；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶購(gòu)自[試劑公司4]；鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自[試劑公司5]；密蒙花方藥材（密蒙花、菊花、枸杞子、地黃、黃芪、當(dāng)歸等）購(gòu)自[藥材供應(yīng)商]，經(jīng)[鑒定機(jī)構(gòu)]鑒定均符合《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，按照既定比例配伍后，加10倍量水浸泡30min，煎煮2次，每次1h，合并煎液，濃縮至生藥含量為1g/mL，4℃保存?zhèn)溆茫煌每谷薚GF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7多克隆抗體購(gòu)自[抗體公司3]；山羊抗兔IgG-HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自[抗體公司4]；CCK-8試劑盒、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自[試劑公司6]；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix購(gòu)自[試劑公司7]；其他試劑均為分析純。細(xì)胞培養(yǎng)：將HRMECs和RGCs復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組與給藥：將HRMECs和RGCs分別分為正常對(duì)照組、高糖模型組、密蒙花方低濃度含藥血清組（10%）、密蒙花方中濃度含藥血清組（20%）、密蒙花方高濃度含藥血清組（30%）以及陽(yáng)性對(duì)照組（給予已知對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用的藥物，如SB431542，濃度為10μmol/L）。除正常對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞均用30mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)建立高糖損傷模型。密蒙花方含藥血清的制備：選取健康成年SD大鼠，按密蒙花方低、中、高劑量（5g/kg、10g/kg、20g/kg）灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃7天。末次灌胃1h后，腹主動(dòng)脈取血，3000r/min離心15min，分離血清，56℃水浴30min滅活補(bǔ)體，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?。高糖模型建?4h后，各含藥血清組分別加入相應(yīng)濃度的密蒙花方含藥血清，陽(yáng)性對(duì)照組加入含SB431542的培養(yǎng)基，正常對(duì)照組和高糖模型組加入等量不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。將各組細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（正常對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。再加入400μLBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率（%）=早期凋亡細(xì)胞比例+晚期凋亡細(xì)胞比例。Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入兔抗人TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗滌3次，每次10min，加入山羊抗兔IgG-HRP標(biāo)記二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。TBST再次洗滌3次，每次10min，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)：采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：TGF-β1上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'；TGF-βRⅠ上游引物5'-[具體序列3]-3'，下游引物5'-[具體序列4]-3'；TGF-βRⅡ上游引物5'-[具體序列5]-3'，下游引物5'-[具體序列6]-3'；Smad2上游引物5'-[具體序列7]-3'，下游引物5'-[具體序列8]-3'；Smad3上游引物5'-[具體序列9]-3'，下游引物5'-[具體序列10]-3'；Smad7上游引物5'-[具體序列11]-3'，下游引物5'-[具體序列12]-3'；GAPDH上游引物5'-[具體序列13]-3'，下游引物5'-[具體序列14]-3'。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。免疫熒光染色檢測(cè)蛋白定位與表達(dá)：將各組細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，培養(yǎng)至合適密度。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次，每次5min。0.3%TritonX-100室溫通透10min，PBS再次洗滌3次，每次5min。用5%牛血清白蛋白封閉30min，分別加入兔抗人TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，PBS洗滌3次，每次5min，加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀釋），室溫避光孵育1h。PBS洗滌3次，每次5min，DAPI染核5min，PBS洗滌3次，每次5min。將蓋玻片用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)情況。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果：CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24h時(shí)，高糖模型組HRMECs和RGCs的細(xì)胞增殖率均顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），表明高糖環(huán)境可促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞的增殖。密蒙花方低、中、高濃度含藥血清組細(xì)胞增殖率較之于高糖模型組均有不同程度降低，其中密蒙花方中濃度組和高濃度組細(xì)胞增殖率與高糖模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且密蒙花方高濃度組降低作用更為明顯。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞增殖率也明顯低于高糖模型組，與密蒙花方高濃度組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)48h和72h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率變化趨勢(shì)與24h時(shí)基本一致，但密蒙花方各濃度含藥血清組對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用隨著時(shí)間延長(zhǎng)更為顯著。各組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖率如圖4-1所示。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，高糖模型組HRMECs和RGCs的細(xì)胞凋亡率顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），說(shuō)明高糖抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞存活增加。密蒙花方各濃度含藥血清組細(xì)胞凋亡率較之于高糖模型組均顯著升高（P<0.01），且呈濃度依賴性，即密蒙花方濃度越高，細(xì)胞凋亡率升高越明顯。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率也明顯高于高糖模型組，與密蒙花方高濃度組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明密蒙花方能夠促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞異常增殖。各組細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4-1所示。Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)結(jié)果：Westernblot檢測(cè)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，高糖模型組HRMECs和RGCs中TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），Smad7蛋白表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01）。密蒙花方各濃度含藥血清組細(xì)胞中TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平較之于高糖模型組均有不同程度降低，其中密蒙花方中濃度組和高濃度組降低作用顯著（P<0.01），且密蒙花方高濃度組降低效果更明顯；Smad7蛋白表達(dá)水平較之于高糖模型組顯著升高（P<0.01），同樣呈濃度依賴性。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平明顯降低，Smad7蛋白表達(dá)水平明顯升高，與密蒙花方高濃度組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖4-2所示。RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖模型組HRMECs和RGCs中TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3基因mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01），Smad7基因mRNA表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01）。密蒙花方各濃度含藥血清組細(xì)胞中TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3基因mRNA表達(dá)水平較之于高糖模型組均有不同程度降低，密蒙花方中濃度組和高濃度組降低作用顯著（P<0.01），密蒙花方高濃度組降低效果更顯著；Smad7基因mRNA表達(dá)水平較之于高糖模型組顯著升高（P<0.01），呈濃度依賴性。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3基因mRNA表達(dá)水平明顯降低，Smad7基因mRNA表達(dá)水平明顯升高，與密蒙花方高濃度組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如表4-2所示。免疫熒光染色檢測(cè)蛋白定位與表達(dá)結(jié)果：免疫熒光染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組HRMECs和RGCs中，TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，且表達(dá)量較低，Smad7蛋白表達(dá)相對(duì)較高。高糖模型組細(xì)胞中，TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，且部分蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，Smad7蛋白表達(dá)明顯減弱。密蒙花方各濃度含藥血清組細(xì)胞中，TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)較之于高糖模型組均有不同程度減少，且向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象減少，Smad7蛋白表達(dá)較之于高糖模型組顯著增強(qiáng)。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中，TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)明顯減少，Smad7蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，與密蒙花方高濃度組染色結(jié)果相似。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)情況，結(jié)果如圖4-3所示。4.3結(jié)果分析與討論在細(xì)胞增殖活性檢測(cè)中，高糖模型組視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖率顯著高于正常對(duì)照組，這與糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙谝暰W(wǎng)膜細(xì)胞的異常增殖現(xiàn)象相符。高糖環(huán)境可激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖加快。而密蒙花方各濃度含藥血清組能不同程度降低細(xì)胞增殖率，中濃度組和高濃度組作用顯著，高濃度組效果更優(yōu)，表明密蒙花方對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞異常增殖具有抑制作用。其機(jī)制可能是密蒙花方中的活性成分干擾了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，使細(xì)胞周期阻滯在特定階段，抑制細(xì)胞進(jìn)入增殖活躍期。比如密蒙花中的蒙花苷，研究表明其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的作用，可能通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白D1等的表達(dá)，使細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，從而抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞的異常增殖。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，高糖抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活增加，破壞視網(wǎng)膜細(xì)胞的正常代謝平衡，促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。而密蒙花方各濃度含藥血清組能顯著促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴性。這是因?yàn)槊苊苫ǚ娇赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)促凋亡蛋白（如Bax等）的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白（如Bcl-2等）的表達(dá)，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)密蒙花方作用于高糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜細(xì)胞時(shí)，可能促使Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C，激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡，恢復(fù)視網(wǎng)膜細(xì)胞的正常代謝和數(shù)量平衡。在TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白和基因表達(dá)檢測(cè)方面，高糖模型組TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白和基因表達(dá)顯著升高，Smad7蛋白和基因表達(dá)顯著降低，說(shuō)明高糖環(huán)境可激活TGF-β/Smad信號(hào)通路。高糖刺激視網(wǎng)膜細(xì)胞后，可誘導(dǎo)TGF-β1的合成和分泌增加，TGF-β1與細(xì)胞表面的TGF-βRⅡ結(jié)合，招募并激活TGF-βRⅠ，進(jìn)而磷酸化Smad2、Smad3，激活的Smad2、Smad3與Smad4形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。同時(shí)，高糖可能抑制Smad7的表達(dá)，使其對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用減弱，導(dǎo)致該信號(hào)通路過(guò)度激活。密蒙花方各濃度含藥血清組能不同程度降低TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白和基因表達(dá)，升高Smad7蛋白和基因表達(dá)，中濃度組和高濃度組作用顯著，高濃度組效果更明顯，且呈濃度依賴性。這表明密蒙花方能夠抑制高糖誘導(dǎo)的TGF-β/Smad信號(hào)通路的過(guò)度激活，其作用機(jī)制可能是密蒙花方中的活性成分抑制了TGF-β1的合成和分泌，或阻斷了TGF-β1與受體的結(jié)合，從而抑制了Smad2、Smad3的磷酸化激活；同時(shí)，促進(jìn)Smad7的表達(dá)，增強(qiáng)對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，密蒙花方中的黃酮類成分可能通過(guò)與TGF-β1的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻止其與受體的相互作用，從而抑制信號(hào)通路的激活。免疫熒光染色結(jié)果直觀地顯示了密蒙花方對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白定位和表達(dá)的影響。高糖模型組中相關(guān)蛋白表達(dá)增強(qiáng)且部分向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，而密蒙花方各濃度含藥血清組相關(guān)蛋白表達(dá)減少，向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象減少，Smad7蛋白表達(dá)增強(qiáng)。這進(jìn)一步證實(shí)了密蒙花方對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，通過(guò)抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位，減少下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而減輕高糖對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞的損傷。綜上所述，密蒙花方對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路，抑制細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變提供了細(xì)胞和分子水平的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，然而，密蒙花方是一個(gè)復(fù)雜的中藥復(fù)方，其具體的活性成分及作用靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步深入研究。五、研究結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，深入探討了密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，取得了以下主要研究結(jié)論：密蒙花方對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型具有顯著防治作用：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，成功建立了鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，給予密蒙花方灌胃干預(yù)12周后，密蒙花方各劑量組大鼠的一般狀況得到不同程度改善，其中密蒙花方中劑量組和高劑量組大鼠的飲食、飲水量及尿量明顯降低，體重下降趨勢(shì)得到抑制，密蒙花方中劑量組體重與糖尿病模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。密蒙花方中劑量組和高劑量組能顯著降低糖尿病大鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白水平，以及甘油三酯和膽固醇含量，改善糖脂代謝紊亂；同時(shí)，降低全血黏度和血漿黏度，改善血液流變學(xué)指標(biāo)，增加視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)。視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，密蒙花方中劑量組和高劑量組能明顯減輕視網(wǎng)膜病理改變，增加神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量，減輕細(xì)胞水腫，增加視網(wǎng)膜厚度。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，密蒙花方各劑量組能不同程度地減少視網(wǎng)膜中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)，升高Smad7蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路，抑制其過(guò)度激活。這些結(jié)果表明，密蒙花方對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型具有顯著的防治作用，能夠改善糖尿病大鼠的全身代謝紊亂和視網(wǎng)膜病理?yè)p傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)。密蒙花方對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用：在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，成功建立了高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRMECs）和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）損傷模型，用密蒙花方含藥血清處理后，密蒙花方各濃度含藥血清組能不同程度降低高糖誘導(dǎo)的HRMECs和RGCs的細(xì)胞增殖率，抑制細(xì)胞異常增殖，其中密蒙花方中濃度組和高濃度組作用顯著（P<0.05），高濃度組效果更明顯。同時(shí)，顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞凋亡率較之于高糖模型組顯著升高（P<0.01），且呈濃度依賴性。Westernblot和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，密蒙花方各濃度含藥血清組能不同程度降低TGF-β1、TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、Smad2、Smad3蛋白和基因表達(dá)，升高Smad7蛋白和基因表達(dá)，中濃度組和高濃度組作用顯著（P<0.01），高濃度組效果更顯著。免疫熒光染色結(jié)果直觀地證實(shí)了密蒙花方對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白定位和表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，減少相關(guān)蛋白向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果表明，密蒙花方對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路，抑制細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。5.2研究創(chuàng)新點(diǎn)研究視角創(chuàng)新：以往密蒙花方的研究多集中在臨床療效觀察及簡(jiǎn)單的藥理作用研究，對(duì)于其作用機(jī)制的探究相對(duì)較少，尤其是在分子信號(hào)通路層面。本研究首次聚焦于密蒙花方對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的影響，從細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵通路角度出發(fā)，深入剖析密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用原理，為密蒙花方的研究開(kāi)辟了新的視角，填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這一信號(hào)通路研究方面的空白。研究方法創(chuàng)新：綜合運(yùn)用多種先進(jìn)研究方法，將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)相結(jié)合。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)密蒙花方活性成分及潛在作用靶點(diǎn)，再通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)初步驗(yàn)證其與TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的結(jié)合可能性，這種多維度、多技術(shù)聯(lián)用的研究方法，能夠更全面、系統(tǒng)地揭示密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制，為中藥復(fù)方機(jī)制研究提供了新的思路和方法。中西醫(yī)結(jié)合理論創(chuàng)新：從中醫(yī)理論出發(fā)，密蒙花方針對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變肝腎陰虛、氣血不足、瘀血阻絡(luò)的病機(jī)進(jìn)行整體調(diào)理；從西醫(yī)理論角度，研究其對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路這一現(xiàn)代醫(yī)學(xué)明確的糖尿病視網(wǎng)膜病變關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制的影響。本研究將中醫(yī)整體觀念和西醫(yī)分子生物學(xué)研究有機(jī)結(jié)合，為中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病視網(wǎng)膜病變提供了新的理論依據(jù)，有助于推動(dòng)中西醫(yī)結(jié)合在眼科領(lǐng)域的深入發(fā)展。5.3研究不足與展望盡管本研究取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。在樣本數(shù)量方面，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中每組僅選用了10只大鼠，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中每組設(shè)置的復(fù)孔數(shù)量有限，樣本量相對(duì)較小，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的偶然性和偏差，影響研究結(jié)論的可靠性和普遍性。在研究深度上，雖然明確了密蒙花方對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)作用，但對(duì)于密蒙花方中具體是哪些活性成分發(fā)揮了關(guān)鍵作用，以及這些活性成分如何精準(zhǔn)地作用于信號(hào)通路中的靶點(diǎn)，尚未進(jìn)行深入探究。密蒙花方是一個(gè)復(fù)雜的中藥復(fù)方，含有多種化學(xué)成分，其作用機(jī)制可能涉及多個(gè)靶點(diǎn)和多條信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)節(jié)，本研究?jī)H聚焦于TGF-β/Smad信號(hào)通路，對(duì)其他相關(guān)信號(hào)通路的研究較少，無(wú)法全面揭示密蒙花方防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制。此外，本研究目前僅停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段，尚未開(kāi)展臨床研究，密蒙花方在人體中的安全性和有效性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，距離其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用仍有一定的距離。針對(duì)以上不足，未來(lái)研究可從以下幾個(gè)方面展開(kāi)：一是擴(kuò)大樣本量，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中增加每組大鼠的數(shù)量，并設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，以更全面地了解密蒙花方的作用效果和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系；在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中增加復(fù)孔數(shù)量，進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。二是深入研究密蒙花方的活性成分和作用靶點(diǎn)，采用先進(jìn)的分離、鑒定技術(shù)，如液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）、核磁共振（NMR）等，從密蒙花方中分離出更多的活性成分，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，逐一驗(yàn)證這些活性成分對(duì)TGF-β/Smad信號(hào)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)的作用機(jī)制，明確其作用的分子基礎(chǔ)。三是拓展研究范圍，綜合運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)，全面分析密蒙花方對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)的多條信號(hào)通路和代謝途徑的影響，深入探討其多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用機(jī)制，為密蒙花方的作用機(jī)制研究提供更全面的視角。四是積極開(kāi)展臨床研究，在前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床研究方案，進(jìn)行多中心、大樣本的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證密蒙花方在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中的安全性和有效性，為其臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的證據(jù)支持，推動(dòng)密蒙花方從實(shí)驗(yàn)室研究向臨床實(shí)踐的