第十三節(jié)基因工程藥物制造實例

干擾素是真核細(xì)胞對各種刺激作出反應(yīng)而自然形成的一組復(fù)雜的蛋白質(zhì)。干擾素除具有廣譜抗病毒活性，還具有抑制細(xì)胞分裂，特別是抑制腫瘤細(xì)胞生長和免疫調(diào)節(jié)等功能，作為一種生物活性蛋白有著良好的臨床應(yīng)用價值。

干擾素是人體防御系統(tǒng)的重要組成部分。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個類型。α型干擾素在分為α1b、α2a、α2b等亞型，其區(qū)別僅表現(xiàn)為個別氨基酸。是我國已經(jīng)批準(zhǔn)上市的基因工程藥物。早期獲得方法：用病毒誘導(dǎo)人白血球(白細(xì)胞)產(chǎn)生，產(chǎn)量低，價格貴。300L人血才提取1mg

。

2003年抗非典期間，江南大學(xué)與麗珠集團蘇州新寶制藥廠合作攻關(guān)，通過發(fā)酵工程和生物制藥工程研制成功了重組人α-2b干擾素口鼻腔噴霧劑，解決了干擾素常溫保存穩(wěn)定性問題。在疫區(qū)特殊人群捐贈使用，效果顯著。二、基因工程干擾素的制備啟開種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提精提半成品制備半成品檢定分裝凍干成品檢定成品包裝

α2b干擾素生產(chǎn)過程

1.發(fā)酵工程菌：SW-IFNα-2b/E.coliDH5α，質(zhì)粒用PL啟動子，含氨芐青霉素抗性基因。種子培養(yǎng)基含1%蛋白胨0.5%酵母提取物0.5%NaCl。制備種子液作為發(fā)酵罐種子使用。發(fā)酵培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0.05%NaCl，0.01%NH4Cl等。發(fā)酵培養(yǎng)基加入氨芐青霉素，防泡劑。30℃發(fā)酵8h，然后在42℃誘導(dǎo)2-3h可完成發(fā)酵。每隔不同的時間取發(fā)酵液，離心稱量濕菌體。

2.產(chǎn)品的提取與純化

a冷卻后離心，除上清液，得濕菌體懸浮于緩沖液中，冰浴條件下超聲破碎；

b離心，取沉淀部分；加尿素、緩沖液和二巰基蘇糖醇溶液溶解。攪拌抽提2h，離心取上清。

c加入復(fù)性緩沖液，離心，除去不溶物。

d超濾器濃縮后，經(jīng)SephadexG50分離。

e經(jīng)SDS檢查。

f再經(jīng)DE-52柱純化。三、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和要求⒈半成品檢定⑴干擾素效價測定⑵蛋白質(zhì)含量測定⑶比活性⑷純度測定⑸相對分子量測定⑹殘余外源性DNA含量測定⑺殘余血清IgG含量測定⑻殘余抗生素活性測定⑼紫外光譜掃描⑽肽圖測定⑾等電點測定⑿除菌半成品應(yīng)做干擾素效價測定、無菌試驗、熱原試驗。⒉成品檢定⑴物理性狀⑵鑒別試驗⑶水分測定⑷無菌試驗⑸熱原試驗⑹干擾素效價測定⑺安全試驗一章回顧基因工程技術(shù)：將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌(或細(xì)胞），實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。基因表達(dá)：結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。融合蛋白真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的一種形式，原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起。非融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。分泌型表達(dá)蛋白真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的一種形式，將外源基因融合到編碼原核蛋白信號肽序列的下游。質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定指工程菌分裂時出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象。質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。

包含體

是無定形的蛋白質(zhì)的聚集,不被任何膜所包圍，重組蛋白在大腸桿菌中的高表達(dá)水平經(jīng)常導(dǎo)致蛋白聚集而形成不溶、無活性的包含體。

如何獲得目的基因基因表達(dá)的宿主菌有哪些？真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的形式?酵母細(xì)胞作為宿主細(xì)胞相對大腸桿菌來說有那些優(yōu)點？制備基因工程藥物的宿主應(yīng)該滿足那些條件？制備基因工程藥物的基本過程質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因？酵母細(xì)胞作為宿主細(xì)胞相對大腸桿菌來說有那些優(yōu)點？表達(dá)體系產(chǎn)物產(chǎn)生部位培養(yǎng)方式提純產(chǎn)物活性潛在危性大腸桿菌多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易一般對原核好不大融合蛋白質(zhì)部分高產(chǎn)對真核差酵母多肽蛋白質(zhì)菌體內(nèi)容易菌體內(nèi)真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高產(chǎn)稍復(fù)雜天然產(chǎn)物

哺乳動物完整外分泌較難成本高簡單可達(dá)天然需注意糖基化蛋白可高產(chǎn)產(chǎn)物致癌基因工程菌應(yīng)該滿足那些條件？容易獲得較高濃度的細(xì)胞；能利用易得廉價原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；容易進(jìn)行代謝調(diào)控；容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作；產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高;產(chǎn)物容易提取純化。制備基因工程藥物的基本過程獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)建工程菌（或細(xì)胞）培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝質(zhì)粒不穩(wěn)定的原因？⑴含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率，質(zhì)粒丟失率與宿主菌、質(zhì)粒特征和培養(yǎng)條件有關(guān)。⑵這兩種菌比生長速率差異的大小。丟失質(zhì)粒的菌體在非選擇性培養(yǎng)基中一般具有生長優(yōu)勢，在培養(yǎng)中會逐漸取代質(zhì)粒菌而成為優(yōu)勢菌。提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素實現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法包含體形成的原因包含體的優(yōu)勢。簡述菌體生長與能量的關(guān)系基因工程藥物的質(zhì)量控制包括那幾個方面？基因工程藥物怎樣保存？提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法選擇合適的宿主菌選擇合適的載體選擇壓力分階段控制培養(yǎng)控制培養(yǎng)條件固定化影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素⑴外源基因的拷貝數(shù)⑵外源基因的表達(dá)效率①啟動子的強弱②核糖體接合位點的有效性③SD序列和起始密碼ATG的間距④密碼子組成⑶表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性⑷細(xì)胞代謝負(fù)荷⑸工程菌的培養(yǎng)條件實現(xiàn)高密度發(fā)酵的方法1發(fā)酵條件的改進(jìn)①培養(yǎng)基的選擇②建立流加式培養(yǎng)③提高供氧能力2構(gòu)建出乙酸化能力低的工程化宿主菌

3構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌包含體形成的原因主要是高水平表達(dá)的結(jié)果。在高水平表達(dá)時，新生肽鏈的聚集速率超過蛋白的正確折疊的速率就會導(dǎo)致包含體的形成。重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時，缺乏一些蛋白折疊過程中需要的酶和輔助因子，如折疊酶和分子伴侶等。1、富集目標(biāo)蛋白：包含體具有高密度，易于分離純化的優(yōu)勢；2、抗蛋白酶：重組蛋白以包含體的形式存在有效地抵御了大腸桿菌中的蛋白酶對目的蛋白的降解；3、對宿主毒性?。荷a(chǎn)那些處于天然構(gòu)象對宿主細(xì)胞有毒害的蛋白有優(yōu)勢。包含體的優(yōu)勢簡述菌體生長與能量的關(guān)系碳源通過有限的呼吸能力所提供的最大能量決定了菌體的最大比生長速率。當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時，由于呼吸鏈或三羧酸循環(huán)的供能不足，菌體會產(chǎn)生乙酸。必須控制菌體生長，從而控制乙酸的產(chǎn)生，減少它的抑制作用。怎樣保存基因工程藥物？⒈液態(tài)保存

（1）低溫保存：在-10到-20°C以下冰凍保存。（2）在穩(wěn)定pH條件下保存：調(diào)到穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)（3）高濃度保存：在高濃度時比較穩(wěn)定。（4）加保護劑保存：多元醇、有機溶劑、巰基乙醇2、固態(tài)保存含水量降到5%時，在室溫或冰箱中保存均比較穩(wěn)定。長期保存最好方法是制成干粉或結(jié)晶。放在干燥器中在4°C可保存相當(dāng)長的時間。1原材料的質(zhì)量控制2培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制3純化過程的質(zhì)量控制4目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制5產(chǎn)品的保存基因工程藥物的質(zhì)量控制包括那幾個方面？轉(zhuǎn)錄RNA為DNA的酶（）能降解單鏈DNA和RNA，打開cDNA雙鏈的發(fā)卡結(jié)構(gòu)（）連接3’羥基5’磷酸游離端（）催化一個單核苷酸轉(zhuǎn)移到一個DNA分子的3’羥基末端（