第二章發(fā)酵工業(yè)菌種

一、常用的工業(yè)微生物二、發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的原則與基本技術(shù)三、發(fā)酵工業(yè)菌種改良最常用的工業(yè)微生物細(xì)菌醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌最常用的工業(yè)微生物酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母、解脂假絲酵母、熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬最常用的工業(yè)微生物霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點(diǎn)青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉最常用的工業(yè)微生物放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動(dòng)放線菌

未培養(yǎng)微生物定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物，其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％。研究方法模擬自然培養(yǎng)法:

原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單細(xì)胞操作宏基因組分析法

2.菌種選擇的要求

能在廉價(jià)原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長(zhǎng)，且生成的目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易于回收；

生長(zhǎng)速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期較短；培養(yǎng)條件易于控制；抗噬菌體及雜菌污染的能力強(qiáng)；2.菌種選擇的要求（續(xù)）菌種不易變異退化；對(duì)放大設(shè)備的適應(yīng)性強(qiáng)；菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素。（二）分離篩選原理與技術(shù)1.篩選的指導(dǎo)思想2.分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個(gè)方面3.

新種分離篩選原理與技術(shù)1.篩選的兩種指導(dǎo)思想

先分離純化，再結(jié)合工藝要求進(jìn)行篩選。分離純化同時(shí)富于篩選條件，一步得出所需菌株。結(jié)果有兩種可能：獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株2.分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個(gè)方面從被污染的生產(chǎn)及科研用菌中分離目的菌；

生產(chǎn)中長(zhǎng)期使用的菌種的定期分離篩選；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株；從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。從保藏機(jī)構(gòu)獲取菌種進(jìn)行分離篩選有兩個(gè)好處：經(jīng)濟(jì)性指導(dǎo)性設(shè)計(jì)篩選方案時(shí)必須考慮兩個(gè)要點(diǎn)

選擇性靈敏度3.新種分離與篩選的步驟

菌種純化初步工藝條件摸索再?gòu)?fù)篩生產(chǎn)性能測(cè)試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)試驗(yàn)?zāi)承┍匾囼?yàn)和或作為育種的出發(fā)菌株毒性試驗(yàn)等

含微生物樣品的采集采樣時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度對(duì)于分離篩選新菌種，還存在另兩個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)：土壤來(lái)源廣泛在已適應(yīng)相當(dāng)苛刻環(huán)境壓力的微生物類群中尋找新菌種樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過(guò)濾法；離心法化學(xué)方法誘餌法分離方法的選擇

根據(jù)目的菌有無(wú)選擇性特征來(lái)選擇分離方法菌種的營(yíng)養(yǎng)特征獨(dú)特

生長(zhǎng)特征獨(dú)特

無(wú)選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進(jìn)行

隨機(jī)分離選擇性分離的關(guān)鍵：生長(zhǎng)培養(yǎng)條件的選擇與控制，從而實(shí)現(xiàn)定向富集篩選。選擇性分離

選擇性分離原理和技術(shù)生長(zhǎng)條件的選擇與控制原理控制營(yíng)養(yǎng)成分

控制培養(yǎng)基酸堿度

添加抑制劑

控制培養(yǎng)溫度

控制通氣條件

選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)施加選擇壓力，進(jìn)行定向篩選

A.富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長(zhǎng)或不利于目的菌以外的其他菌型生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長(zhǎng)速率（μmax）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時(shí)間和次數(shù)等問(wèn)題連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長(zhǎng)速率（μ）篩選

μ

ABS0基質(zhì)濃度對(duì)A、B兩種菌的比生長(zhǎng)速率（μ）的影響

當(dāng)S<S0時(shí)，富集什么菌株？當(dāng)S>S0時(shí)，富集什么菌株？連續(xù)富集培養(yǎng)技術(shù)分離菌株的優(yōu)點(diǎn)

分離的菌株特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程有利于分離具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物B.固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌

選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì)隨機(jī)分離原理與技術(shù)從產(chǎn)物入手，通過(guò)設(shè)計(jì)高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的篩選方法，從隨機(jī)分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術(shù)關(guān)鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應(yīng)篩選方法的確定。隨機(jī)分離技術(shù)舉例

抗生素產(chǎn)生菌的篩選藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的篩選多糖產(chǎn)生菌的篩選高產(chǎn)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的幾個(gè)原則

制備一系列的培養(yǎng)基，其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長(zhǎng)限制因素；使用一聚合或復(fù)合形式的生長(zhǎng)限制養(yǎng)分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代謝物阻遏；確定含有所需的輔因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH緩沖劑以減少pH變化；前體、促進(jìn)劑及抑制劑的采用?？股禺a(chǎn)生菌的篩選篩選模型：試驗(yàn)菌篩選方法：鋪菌法復(fù)印平板法液體培養(yǎng)篩選

抗藥性篩選篩選模型：氨芐青霉素和β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌（克雷白氏菌）協(xié)同

I II無(wú)試樣時(shí)（不含棒酸時(shí)），I對(duì)II菌作用不大有試樣時(shí)（含棒酸時(shí)），I對(duì)II菌恢復(fù)藥效，棒酸抑制水解酶活性

固體培養(yǎng)篩選藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選

藥理活性化合物是指能抑制人類代謝中某一個(gè)關(guān)鍵酶的微生物產(chǎn)物即酶抑制劑，從而達(dá)到治療的目的。篩選模型：目標(biāo)酶生長(zhǎng)因子產(chǎn)生菌的篩選

篩選模型：營(yíng)養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌

篩選方法：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌生長(zhǎng)氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預(yù)處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長(zhǎng)獲得多個(gè)單菌落復(fù)印平板（copy法） 平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對(duì)應(yīng)到copy前相應(yīng)

u.v線殺死長(zhǎng)好的菌落位置，找到目的菌落 再鋪上一層含營(yíng)養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌的瓊脂 培養(yǎng)后 產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長(zhǎng)圈

目的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定 篩選產(chǎn)物含量高的菌株

多糖產(chǎn)生菌的篩選取樣特點(diǎn)：碳水化合物工業(yè)的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據(jù)液體培養(yǎng)測(cè)定多糖含量來(lái)篩選高產(chǎn)菌。細(xì)菌分離：以乳酸菌為例

取未成熟的醬醪樣品1g至無(wú)菌磨口瓶中

加麥芽汁至瓶口處，封塞，25℃培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)基中長(zhǎng)出絹絲狀波動(dòng)物，鏡檢桿狀，陽(yáng)性染色初步斷定乳酸菌

用選擇性培養(yǎng)基分批富集培養(yǎng)2-3代稀釋分離法分離單菌落，培養(yǎng)基為含麥芽汁、CaCO3的瓊脂培養(yǎng)基

根據(jù)透明圈挑選菌落

性能測(cè)定（鏡檢桿狀，染色陽(yáng)性；乳酸紙層析鑒定）

Rf值定性（有機(jī)酸呈黃斑點(diǎn)）

乳酸生成量測(cè)定（滴定法）放線菌的分離：

以產(chǎn)鏈霉素菌種的分離為例（從退化菌種中篩選）

取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml無(wú)菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏高產(chǎn)菌恢復(fù)根據(jù)高產(chǎn)菌的特點(diǎn)，選擇目的菌落放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測(cè)試真菌的分離篩選：以啤酒酵母的分離為例

取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7

稀釋分離法取0.1ml加入固體培養(yǎng)基鋪平皿（×2）

在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48-72h

形態(tài)篩選根據(jù)正常株特點(diǎn)進(jìn)行挑選，接種斜面?zhèn)溆?/p>

純化，采用平板分離法進(jìn)一步純化，至少反復(fù)三次

①生成子囊孢子速度測(cè)定 ②發(fā)酵力測(cè)定性能測(cè)定③熱死溫度測(cè)定 ④凝集力測(cè)定 ⑤雙乙酰含量測(cè)定菌種選育改良的具體目標(biāo)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過(guò)程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品

發(fā)酵工業(yè)菌種改良方法常規(guī)育種(誘變育種)細(xì)胞工程育種基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)基因工程育種蛋白質(zhì)工程育種代謝工程育種賴氨酸生產(chǎn)菌種的選育改良思路出發(fā)菌株：黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌育種思路

1.優(yōu)先合成的轉(zhuǎn)換——滲漏缺陷型的選育

2.切斷支路代謝——營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育：高絲氨酸缺陷型

3.抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育：AEC4.解除代謝互鎖：Leu-、

抗Leu結(jié)構(gòu)類似物、喹啉s

、苯醌s5.增加前體物的合成和阻塞副產(chǎn)物的生成：

Ala-、抗Asp結(jié)構(gòu)類似物

選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株

6.改善細(xì)胞膜的透過(guò)機(jī)能

7.選育溫度敏感突變株

8.應(yīng)用細(xì)胞工程和基因工程育種選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株

代謝工程的定義利用多基因重組技術(shù)有目的地對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新的學(xué)科領(lǐng)域。又稱作途徑工程，是多基因的基因工程。

代謝工程發(fā)展基礎(chǔ)

代謝網(wǎng)絡(luò)理論：是把細(xì)胞的生化反應(yīng)以網(wǎng)絡(luò)整體，而不是孤立地來(lái)考慮。代謝網(wǎng)絡(luò)分流處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點(diǎn)，其中對(duì)終產(chǎn)物合成起決定作用的少數(shù)節(jié)點(diǎn)稱為主節(jié)點(diǎn)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)下游分支的可變程度，節(jié)點(diǎn)分為：柔性節(jié)點(diǎn)：解除一個(gè)分支的反饋抑制可提高該分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量。半柔性節(jié)點(diǎn)：須降低主分支的酶活并同時(shí)提高次分支的酶活或解除其反饋抑制，才可提高次分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量。剛性節(jié)點(diǎn)：其下游各分支的比例不易改變。

代謝工程發(fā)展基礎(chǔ)相依網(wǎng)絡(luò)：代謝網(wǎng)絡(luò)中各主節(jié)點(diǎn)集中于產(chǎn)物，為了避免中間物的過(guò)量積累，各分支的代謝流都必須保持平衡，各分支的分流相等，各節(jié)點(diǎn)的重要性相同。獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)：代謝網(wǎng)絡(luò)的主節(jié)點(diǎn)不集中，可以通過(guò)對(duì)代謝的修飾來(lái)影響產(chǎn)物的產(chǎn)量,其對(duì)代謝修飾的應(yīng)答能力，取決于各節(jié)點(diǎn)的剛?cè)嵝约捌湮恢谩?/p>

SIPSⅠⅡP

ⅡBB1B2相依網(wǎng)路獨(dú)立網(wǎng)路（三）代謝工程育種思路1.

改變代謝流：改變分支代謝途徑的流向，阻斷有害代謝產(chǎn)物的合成。（1）加速限速反應(yīng)（2）改變分支代謝途徑流向：提高代謝分支點(diǎn)的某一分支代謝途徑酶系的活力，在與另外的分支代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)中占有優(yōu)勢(shì)，可以提高目的代謝末端產(chǎn)物的產(chǎn)量。（3）構(gòu)建代謝旁路（4）改變能量代謝途徑

代謝工程育種思路2.擴(kuò)展代謝途徑

（1）在引入外源基因后，使原來(lái)的代謝途徑向后延伸，產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物。（