(19)國家知識產(chǎn)權(quán)局(10)申請公布號CN115160135A(21)申請?zhí)?02210953121.2(22)申請日2022.08.10(71)申請人鄭州左安檢測科技有限公司地址450001河南省鄭州市高新區(qū)碧桃路產(chǎn)業(yè)園D7-6號樓(72)發(fā)明人賈嘉紀(jì)元孟二娟趙琳石小青陳麗麗崔浩哲夏靜雪呂小翠袁利杰(74)專利代理機(jī)構(gòu)鄭州中民專利代理有限公司專利代理師黃宇亭(54)發(fā)明名稱一種大麻二酚半抗原與完全抗原的制備方法及應(yīng)用(57)摘要一種大麻二酚半抗原與完全抗原的制備方法及應(yīng)用，大麻二酚半抗原是由3,5-二甲氧基苯甲醛與三乙基-4-磷化物反應(yīng)生成(2E,4E)-5-(3,5-二甲氧基苯基)-2,4-戊二烯酸乙酯，隨后經(jīng)PdC/H?還原，HBr/HoAc脫甲基和皂化反應(yīng)得到5-(3,5-二羥苯基)戊酸，最后再與(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇反應(yīng)得到大麻二酚半抗原；大麻二酚完全抗原由大麻二酚半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到。本發(fā)明制備的抗原呈現(xiàn)出特異性的大麻二酚抗原決定簇，使得篩選出高特異性的大麻二酚單克隆抗體成為可能。產(chǎn)生的抗體特異性高、靈敏度高，對大麻及其衍生物均無明顯的交叉反應(yīng)，可用于建立酶聯(lián)免疫分21.一種大麻二酚半抗原的制備方法，其特征在于：是由3,5-二甲氧基苯甲醛與三乙基-4-磷化物反應(yīng)生成(2E,4E)-5-(3,5-二甲氧基苯基)-2,4-戊二烯酸乙酯，隨后經(jīng)PdC/H2還原，HBr/HoAc脫甲基和皂化反應(yīng)得到5-(3,5-二羥苯基)戊酸，最后再與(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇反應(yīng)得到，其分子結(jié)構(gòu)式為：具體反應(yīng)過程如下：中間體1中間體2中間體3大麻二酚半抗原2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大麻二酚半抗原的制備方法，其特征在于：該制備方法的具體S1.制備大麻二酚中間體1取氫化鈉0.87g,加20ml干燥無水的四氫呋喃攪拌形成懸浮液，冰浴下逐滴加入含有5g三乙基-4-磷化物的無水的四氫呋喃50ml,攪拌反應(yīng)30min;隨后逐滴加入含有2.77g3,5-二甲氧基苯甲醛的無水的四氫呋喃50ml,移除冰浴，并在室溫下攪拌反應(yīng)1h,然后加熱到60℃反應(yīng)1h;TLC確定反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，并用120ml水淬滅反應(yīng)，用120ml乙酸乙酯萃取水相3次，合并有機(jī)相，飽和食鹽水反萃有機(jī)S2.制備大麻二酚中間體2將3.6g中間體1和0.74g10%Pd-C加入至75ml甲醇中，在室溫下加氫氣攪拌反應(yīng)2h,過濾Pd-C,將濾液濃縮，得到3.5g淡黃色油狀液體即中間體2;3S3.制備大麻二酚中間體3在中間體2中加入50ml40%氫溴酸，50ml冰醋酸，60℃回流反應(yīng)4h;TLC確定反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并添加冰水150ml;反應(yīng)混合物用150ml乙酸乙酯萃取3次，飽和食鹽水反萃有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜，濃縮有機(jī)相得到黑色油狀粗產(chǎn)物；粗產(chǎn)物通過柱層析純化，得到2.50g中間體3;S4.制備大麻二酚半抗原取1g中間體3,0.18gp-TsOH加入至50mlTHF:DCM混合液中，攪拌混勻，逐滴加入1.08g(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇，室溫下攪拌反應(yīng)30min,TLC確定反應(yīng)的進(jìn)程，最后加入50ml乙酸乙酯來終止反應(yīng)，并用NaHCO?溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至3-4,分離有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌兩次，干燥濃縮得到油狀粗產(chǎn)物2.3g,經(jīng)柱層析簡單純化后再制3.一種利用權(quán)利要求1或2所述方法制備的大麻二酚半抗原的應(yīng)用，其特征在于：大麻二酚半抗原可用于制作動物免疫的抗原體系原料。4.一種大麻二酚完全抗原的制備方法，其特征在于：是由權(quán)利要求1制備的大麻二酚半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大麻二酚完全抗原的制備方法，其特征在于所述載體蛋白為6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的大麻二酚完全抗原的制備方法，其特征在于：具體步驟如4h;取50mg牛血清白蛋白用5ml10mMPBS攪拌溶解完全得到B液；將A液逐滴加入至B液中，酚-牛血清白蛋白偶聯(lián)物即大麻二酚完全抗原。7.如權(quán)利要求4或5所述的大麻二酚完全抗原的制備方法，其特征在于：具體步驟如下：白偶聯(lián)物即大麻二酚完全抗原。8.一種利用權(quán)利要求4或5所述方法制備的大麻二酚完全抗原的應(yīng)用，其特征在于：采用大麻二酚完全抗原免疫動物所得的單克隆抗體，特異性高、靈敏度高，對大麻及其衍生物均無明顯的交叉反應(yīng)，可用于建立酶聯(lián)免疫分析方法和膠體金、熒光快速檢測試紙法，從而實(shí)現(xiàn)化妝品及工業(yè)大麻中大麻二酚快速檢測。4一種大麻二酚半抗原與完全抗原的制備方法及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及一種大麻二酚半抗原與完全抗原的制備方法及應(yīng)用。屬于生物技術(shù)領(lǐng)背景技術(shù)[0002]大麻二酚即CBD,是一種從大麻中提取的植物大麻素，炎、抗腫瘤和化學(xué)預(yù)防活性。大麻二酚具有阻斷某些多酚對人體神經(jīng)系統(tǒng)的不利影響，并且具有阻斷乳腺癌轉(zhuǎn)移、治療癲癇、抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抗失眠等一系列生理活性功能，對治療多發(fā)性硬化癥具有良好的效果。[0003]工業(yè)大麻是指四氫大麻酚(THC)含量低于0.3%的大麻，是大麻科(Cannabaceae)大麻屬(Cannabis)一年生草本植物。工業(yè)大麻花葉提取物大麻二酚(CBD)具有廣闊的市場前景，工業(yè)大麻中大麻二酚含量的測定則有助于對工業(yè)大麻種植過程中CBD含量的監(jiān)控以及工業(yè)大麻品種的優(yōu)化。[0004]目前常用的大麻二酚檢測方法主要是儀器方法，如高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，采用這些分析方法不僅需要昂貴的儀器和專業(yè)的技術(shù)人員，樣品前處理過程復(fù)雜、周期長、成本高，難以滿足大量樣品和現(xiàn)場樣品快速檢測的需要?；诳乖贵w特異性識別的免疫分析方法可以定性定量檢測樣品中的大麻二酚含量。[0005]免疫分析是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，然而得到高親和力和高特異性的單克隆抗體是免疫學(xué)檢測的前提，人工抗原的合成則是其中重要的一步。[0006]與現(xiàn)有的檢測方法相比，基于抗原-抗體特異性分子識別的免疫檢測方法，在現(xiàn)場求較低。然而，免疫分析方法研發(fā)的關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)出合適的大麻二酚半抗原，制備出靈敏度高、特異性強(qiáng)的抗體，但是現(xiàn)有技術(shù)中未見有關(guān)于大麻二酚半抗原與完全抗原的相關(guān)報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中大麻二酚檢測方法的缺陷和不足，提供一種大麻二酚半抗原與完全抗原的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明制備的大麻二酚半抗原不僅最大程度上保留了大麻二酚的特征結(jié)構(gòu)，而且與載體蛋白偶聯(lián)存在合適結(jié)構(gòu)的連接臂，盡可能讓大麻二酚特征結(jié)構(gòu)充分暴露于機(jī)體，增強(qiáng)免疫效果，提高抗體的特異性，降低與其他大麻二酚類似物的交叉反應(yīng)；本發(fā)明制備的大麻二酚半抗原在原有結(jié)構(gòu)上引入羧基，有利于制備大麻二酚人工抗原；本發(fā)明提供的大麻二酚人工抗原具有強(qiáng)的免疫原性，有利于刺激機(jī)體完成免疫應(yīng)答，從而獲得高質(zhì)量的單克隆抗體，為大麻二酚免疫分析方法的建立提供核心試劑。[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種大麻二酚半抗原的制備方法，是由3,5-二甲氧基苯甲醛與三乙基-4-磷化物反應(yīng)生成(2E,4E)-5-(3,5-二甲氧基苯基)-2,4-戊二烯酸乙酯，隨后經(jīng)PdC/H2還原，HBr/5HoAc脫甲基和皂化反應(yīng)得到5-(3,5-二羥苯基)戊酸，最后再與(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇反應(yīng)得到，其分子結(jié)構(gòu)式為：具體反應(yīng)路線見圖1。[0009]該制備方法的具體步驟如下：1)取氫化鈉0.87g(22mmol),加20ml干燥無水的四氫呋喃攪拌形成懸浮液，冰浴下逐滴加入含有5g三乙基-4-磷化物(20mmol)的無水的四氫呋喃50ml,攪拌反應(yīng)30min。隨后逐滴加入含有2.77g3,5-二甲氧基苯甲醛的無水的四氫呋喃50ml,移除冰浴，并在室溫下攪拌反應(yīng)1h,然后加熱到60℃反應(yīng)1h。TLC確定反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，并用水硫酸鈉干燥過夜，旋蒸得到4.0g中間體1。[0010]2)將3.6g中間體1和10%Pd-C(0.74g)加入至75ml甲醇中，在室溫下加氫氣攪拌反應(yīng)2h,過濾Pd-C,將濾液濃縮，得到3.5g淡黃色油狀液體(中間體2)。[0011]3)在中間體2中加入50ml40%氫溴酸，50ml冰醋酸，6結(jié)束后，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并添加冰水150ml。反應(yīng)混合物用150ml乙酸乙酯萃取3次，飽和食鹽水反萃有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜，濃縮有機(jī)相得到黑色油狀粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物通過柱層析(乙酸乙酯/己烷1:2)純化，得到2.50g中間體3。[0012]4)取1g中間體3(4.75mmol),0.18gp-TsOH0.95mmol)加入50mlTHF:DCM(1:4)混合液中，攪拌混勻，逐滴加入1.08g(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇，室溫下攪拌反應(yīng)30min,TLC確定反應(yīng)的進(jìn)程，最后加入50ml乙酸乙酯來終止反應(yīng)，并用NaHCO3溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至3-4,分離有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌兩次，干燥濃縮得到油狀粗產(chǎn)物2.3g,經(jīng)柱層析簡單純化后再制備HPLC進(jìn)一步純化，得到大麻二酚半抗原220mg。[0013]所述大麻二酚半抗原可用于制作動物免疫的抗原體系原料。[0014]一種大麻二酚完全抗原的制備方法，是由按上述制備方法得到的大麻二酚半抗原甲狀腺蛋白。[0015]該制備方法的具體步驟如下：免疫抗原的制備：取20mg半抗原，EDC23mg,得到A液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h。取50mg牛血清白蛋白用5ml10mMPBS攪拌溶解完全得到B液。將A液逐滴加入至B液中，4℃攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后將蛋白溶液用10mMPBS透析3天，每6h換液一次，得到大麻二酚-牛血清白蛋白偶聯(lián)物即得免疫抗原CBD-BSA。滴加入至B液中，4℃攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后將蛋白溶液用10mMPBS透析3天，每6h換液6(1)本發(fā)明提供了一種大麻二酚的半抗原，應(yīng)用半抗原偶聯(lián)載體蛋白制備得到的人工抗原作為免疫原，進(jìn)而制備得到大麻二酚抗體。本發(fā)明半抗原與待測物大麻二酚的骨架結(jié)構(gòu)重疊度高，有效的提高了大麻二酚人工抗原的免疫原性。半抗原與載體蛋白偶聯(lián)存在合適結(jié)構(gòu)的連接臂，降低了空間位阻，盡可能讓大麻二酚特征結(jié)構(gòu)充分暴露于機(jī)體，增強(qiáng)明的大麻二酚人工抗原、抗體可實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的檢測大麻二酚的目的。附圖說明[0019]圖1:大麻二酚半抗原的合成路線圖；圖2:中間體1核磁共振氫譜；圖3:中間體1核磁共振碳譜；圖4:中間體2核磁共振氫譜；圖5:中間體2核磁共振碳譜；圖6:中間體3核磁共振氫譜；圖7:中間體3核磁共振碳譜；圖8:大麻二酚半抗原核磁共振氫譜；圖9:大麻二酚半抗原核磁共振碳譜；圖10:大麻二酚完全抗原紫外吸收光譜。具體實(shí)施方式[0020]下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)可能會對本發(fā)明進(jìn)行各種改動或修飾，這些改動或修飾同樣應(yīng)落入發(fā)明的保護(hù)范圍。[0021]實(shí)施例1大麻二酚半抗原的制備1)取氫化鈉0.87g(22mmol),加20ml干燥無水的四氫呋喃攪拌形成懸浮液，冰浴下逐滴加入含有5g三乙基-4-磷化物(20mmol)的無水的四氫呋喃50ml,攪拌反應(yīng)30min。隨后逐滴加入含有2.77g3,5-二甲氧基苯甲醛的無水的四氫呋喃50ml,移除冰浴，并在室溫下攪拌反應(yīng)1h,然后加熱到60℃反應(yīng)1h。TLC確定反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，并用水硫酸鈉干燥過夜，旋蒸得到4.0g中間體1。[0022]2)將3.6g中間體1和10%Pd-C(0.74g)加入至75ml甲醇中，在室溫下加氫氣攪拌反應(yīng)2h,過濾Pd-C,將濾液濃縮，得到3.5g淡黃色油狀液體(中間體2)。[0023]3)在中間體2中加入50ml40%氫溴酸結(jié)束后，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫并添加冰水150ml。反應(yīng)混合物用150ml乙酸乙酯萃取3次，飽和食鹽水反萃有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥過夜，濃縮有機(jī)相得到黑色油狀粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)7物通過柱層析(乙酸乙酯/己烷1:2)純化，得到2.50g中間體3。[0024]4)取1g中間體3(4.75mmol),0.18gp-TsOH0.95mmol)加入50mlTHF:DCM(1:4)混合液中，攪拌混勻，逐滴加入1.08g(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇，室溫下攪拌反應(yīng)30min,TLC確定反應(yīng)的進(jìn)程，最后加入50ml乙酸乙酯來終止反應(yīng)，并用NaHCO3溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至3-4,分離有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌兩次，干燥濃縮得到油狀粗產(chǎn)物2.3g,經(jīng)柱層析簡單純化后再制備HPLC進(jìn)一步純化，得到大麻二酚半抗原220mg。中間體及大麻二酚半抗原的HNMR,3CNMR如圖2-9所示。[0026]實(shí)施例2大麻二酚完全抗原的制備大麻二酚半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)得到免疫抗原。反應(yīng)4h。取50mg牛血清白蛋白用5ml10mMPBS攪拌溶解完全得到B液。將A液逐滴加入至B大麻二酚-牛血清白蛋白偶聯(lián)物即得免疫抗原CBD-BSA。大麻二酚半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)得到包被抗原?！鏀嚢璺磻?yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后將蛋白溶液用10mMPBS透析3天，每6h換液一次，得到大麻二酚-卵清蛋白偶聯(lián)物即得包被抗原CBD-0VA。完全抗原采用紫外光譜法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果，利用偶聯(lián)物中小分子與蛋白的濃度，計(jì)算其偶聯(lián)比。大麻二酚半抗原-載體蛋白的最大吸收峰與大麻二酚半抗原、載體蛋白的最大吸收峰相比發(fā)生了明顯的變化，表明大麻二酚-載體蛋白的制備是成功的(參見圖10)。經(jīng)計(jì)算，半抗原與BSA的偶聯(lián)比為25:1,與OVA的偶聯(lián)比為16:1。[0031]實(shí)施例3大麻二酚單克隆抗體的制備選用6-8周齡的Balb/c雌鼠，將免疫抗原與弗氏佐劑混合乳化，按照100ug/只的免取免疫成功的Balb/c小鼠脾細(xì)胞，將骨髓瘤細(xì)胞SP2/0和免疫鼠脾細(xì)胞比例調(diào)至1:5~1:10的融合，采用競爭ELISA法測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液，篩選出合適的陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。[0033]3、單克隆抗體的制備與純化腹水制備：選用10~11周齡的Balb/c雌鼠，將佐劑注射Balb/c小鼠腹腔，每只0.3~0.5ml處理腹腔7~15天左右，將篩選出來的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后接種到Balb/c小鼠腹[0034]單克隆抗體的純化：腹水先用硫酸銨沉淀法初純后，再用ProteinG柱純化得到最8終的單克隆抗體。Elisa法測定抗體的效價為1:600000。[0036]競爭Elisa:大麻二酚-OVA包被酶標(biāo)板，加入大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)品、大麻二酚