附錄：常用試劑配制及應(yīng)用

一、常用緩沖液、試劑的配制

碳酸鹽緩沖液(Carbonate-BicarbonateBuffer)

由于碳酸鹽pH值偏堿，因此，常用于pH>9的緩沖液配制(附表1)。

附表L0.2mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.2-10.7)

0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L

pHNa2cO3NaHC03pHNa2C03NaHC03

(ml)(ml)(ml)(ml)

9.24.046.010.027.522.5

9.37.542.510.130.020.0

9.49.540.510.233.017.0

9.513.037.010.335.514.5

9.616.034.010.438.511.5

9.719.530.510.540.59.5

9.822.028.010.642.57.5

9.925.025.010.745.05.0

磷酸緩沖液(PhosphateBuffers,PB)

磷酸鹽是使用最廣泛的一種緩沖劑，由于它們是二級(jí)解離，有二個(gè)pKa值,

所以用它們配制的緩沖液，pH范圍最寬。NaH2P04：pKal=2.12,pKa2=7.21；

Na2HP04：pKal=7.21,pKa2=12.32。

另外，磷酸鹽還有鉀鹽分子形式，一般來說，低溫時(shí)鈉鹽難溶，鉀鹽易溶，

因此,配制細(xì)胞培養(yǎng)用試劑時(shí)常常添加鉀鹽試劑，但若配制十二烷基硫酸鈉(SDS)

-聚丙烯酰胺凝膠電泳的緩沖液時(shí)，只能用鈉鹽而不能用鉀鹽，因?yàn)镾DS會(huì)與磷

酸鉀生成難溶的十二烷基硫酸鉀。

磷酸緩沖液的優(yōu)點(diǎn)為：①可配制成不同離子強(qiáng)度的緩沖液；②適用pH緩沖

范圍較寬；③受溫度影響緩沖液pH值變化較?。虎茈x子強(qiáng)度對(duì)緩沖液pH影響較

小，如0.Imol/L緩沖液稀釋10倍其pH變化小于0.1。

磷酸緩沖液的缺點(diǎn)是：①磷酸鹽易與鈣離子(C/)、鎂離子(Mg”)及重金

屬離子結(jié)合生成不溶的沉淀物；②可能干擾某些生物化學(xué)反應(yīng)過程，如對(duì)某些酶

的催化活性具有一定程度的抑制作用。

NaH,PO,的pH值偏酸性，可用作pH<4的緩沖液。

Na,HPO,的pH值偏堿性，可用作pH>10的緩沖液。

而pH=6?8的中性緩沖液是更常用的緩沖液，需要N磯P0,與N&HPOi兩種磷

酸鹽混合配制(附表2)。

附表2.0.2mo表L磷酸鹽緩沖液(plI5.7-8.2)

0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L0.2mol/L

pHNaH2PO4Na2HP04pHNaH2PO,Na2HP04

(ml)(ml)(ml)(ml)

5.793.56.57.039.061.0

5.892.08.07.133.067.0

5.990.010.07.228.072.0

6.087.712.37.323.077.0

6.185.015.07.419.081.0

6.281.518.57.516.084.0

6.377.522.57.613.087.0

6.473.526.57.710.589.5

6.568.531.57.88.591.5

6.662.537.57.97.093.0

6.756.543.58.05.394.7

6.851.049.08.14.295.8

6.945.055.08.23.097.0

磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate-bufferedsaline,PBS)

磷酸鹽緩沖液是在磷酸緩沖液基礎(chǔ)上添加NaCl以維持溶液的滲透壓，因此,

PBS適用于做細(xì)胞緩沖液，常用PBS配制如下。

NaCl8g

KC10.2g

N^HPO.,1.44g

KH2Poi0.24g

在800ml蒸儲(chǔ)水中溶解，用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2?7.4加水定容至

IL,15psi(1.05kg/cm2)高壓滅菌20min,室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

Tris緩沖液(Tris-HClBuffer,TB)

Tris的pH值偏于堿性,因此，通過添加HC1調(diào)節(jié)pH至所需值，Tris-HCl

緩沖液的離子強(qiáng)度(mol/L)是專指Tris的濃度，如某一特定pH的0.05LDI/L

Tris緩沖液的配制是將50ml0.1mol/LTris堿溶液與附表3所示相應(yīng)體積hnl)

的0.1mol/LHC1混合,加水至將體積100mL即為0.05mol/LTris緩沖液。

另外，按附表3制備的緩沖液，由于試劑來源的不同，緩沖液pH可能與所

需略有差異，此時(shí)可通過稍許減少或增加HC1用量，精細(xì)調(diào)節(jié)pH至所需值。

附表4.0.05mol/LTris緩沖液

pH需0.1mol/LHC1(ml)pH需0.1mol/LHC1(ml)

7.145.78.126.2

7.244.78.222.9

7.343.48.319.1

7.442.08.417.2

7.540.38.514.7

7.638.58.612.4

7.736.68.710.3

7.834.58.88.5

7.932.08.97.0

8.029.2

Tris鹽緩沖液(TBS)：

Tris鹽緩沖液是在Tris緩沖液基礎(chǔ)上添加NaCl以維持溶液的滲透壓，因

此，TBS也適用于做細(xì)胞緩沖液，常用TBS配制如下。

8gNaCK0.2gKC1以及3gTris溶解于800ml蒸鐳水中,加入0.015g酚

紅并用HC1調(diào)pH至7.4用蒸儲(chǔ)水定容至1L,分裝后在15Psi(1.05kg/cm2)高

壓滅菌20min,室溫保存。

現(xiàn)在常用Tris鹽緩沖液通常不加pH指示劑，而且該溶液如果不用于細(xì)胞培

養(yǎng)，通常不加KC1及酚紅。

Hank,s液(Hank,sBalancedSaltSolution)

Hank's液是一種平衡鹽溶液，主要用于細(xì)胞培養(yǎng)取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)

胞的漂洗等。

貯存液A液：

(I)NaCl80g

KC14g

MgSO(-7H,0lg

MgCl2-6H201g

用雙蒸儲(chǔ)水定容至450mlo

(II)CaCl21.4gCaCl2?2H201.85g)

用雙蒸僧水定容至50ml。

將I和II液混合,即成A液。

貯存液B液：

Na2HP04?12H201.52g,

KILPO.0.6g,

酚紅0.2g,

葡萄糖10.0g,

酚紅應(yīng)先置研缽內(nèi)磨細(xì)，然后按配方順序一一溶解，用雙蒸儲(chǔ)水定容至

500mlo

(3)應(yīng)用液:A、B儲(chǔ)存液分別經(jīng)112.6℃濕熱滅菌20min,取A和B液各25ml,

加無菌雙蒸鐲水至450ml,使用前用無菌的3.5%或5.6%NaHCO?調(diào)至所需pE。

注意：藥品必須全部用A.R試劑，并按配方順序加入，用適量雙蒸水溶解，

待前一種藥品完全溶解后再加入后一種藥品，最后補(bǔ)足水到總量。

無Ca2\Mg"Hank's液(Hank'sSolutionwithoutcalcium,magnesium

sulfate)

NaCl80g,

KC14g,

Na2HPO4-12H,01.52g,

KIkPO.0.6g,

葡萄糖10g,

用雙蒸儲(chǔ)水溶解后，加入0.4%酚紅溶液50mL再加入雙蒸水至1000mL

112.6℃濕熱滅菌20min,4℃冰箱保存。臨用前將原液用無菌雙蒸水作1：10

倍稀釋，用無菌的用5%或5.6%NaHCQ,調(diào)至所需pH。

pH7.2檸檬酸鹽緩沖液(CitrateBuffer)

檸檬酸0.327g

檸檬酸鈉2.63g

磷酸氫鈉0.222

葡萄糖0.00255mg

蒸儲(chǔ)水加至100mlo

pH3.3枸檬酸-磷酸鹽緩沖液(Citricacid-PhosphateBuffer)

0.131mol/Lcitrateacid,0.066mol/LNa2HP01,等量混合，調(diào)節(jié)pH至3.3。

0.5mol/I,EDTA,pH8.0

EDTA?21I20186.1g

NaOH?20g

將EDTA-2H20加入800ml水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌。用NaOH調(diào)節(jié)pH

至8.0,EDTA直到接近pH8.0才完全溶解，定容至1L。分裝后高壓蒸汽滅菌。

0.4%酚紅溶液

取酚紅0.4g置于研缽中逐滴加入Imol/LNaOH溶液11.28ml,邊研磨邊使

酚紅轉(zhuǎn)變?yōu)殁c鹽溶于水中，加雙蒸水至100ml,過濾后，4℃冰箱保存。

醋酸鉀(PotassiumAcetate)

在60ml5mol/L醋酸鉀溶液中,加入11.5ml冰醋酸和28.5ml水。該溶液用

于堿性裂解。

3mol/L醋酸鈉(SodiumAcetate),pH5.2和pH7.0

在800ml水中溶解408.1g三水醋酸鈉，用冰乙酸調(diào)pH至5.2或用稀移乙酸

調(diào)pH至7.0,加雙蒸水至1L。分裝后高壓滅菌。

檸檬酸鈉緩沖液(SodiumCitrateBuffer)

檸檬酸鈉1.8g

HC1(Imol)4ml

無水乙醇95ml

先用100ml去離子水溶解檸檬酸鈉，然后加入HC1和無水乙醇，再補(bǔ)充去離

子水至總量200mlo

飽合硫酸鍍?nèi)芤?SaturatedAmmoniumSulfateSolution)

取500nli雙蒸馀水，加入約400克硫酸鉉，水浴加熱至70℃,磁力攪拌器

充分?jǐn)嚢?，直到加入的硫酸鏤不再溶解，以氨水(也可用NaOH)調(diào)pH7.2,室溫

保存。

二、酶免疫檢測(cè)常用試劑配制

包被液(CoatingBuffer)(pH9.5碳酸鹽緩沖液)

Na2C03-10H.08.58g

NaHCOj5.8g

溶于雙蒸水至1000ml?

封閉液(Confiningliquid)(5%脫脂乳-PBS溶液，pH7.4)

脫脂乳50g

加0.02mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)至1000ml溶解。

洗液(washingliquid)

氯化鈉8.0g

磷酸二氫鉀0.2g

磷酸氫二鈉(1250)2.9g

吐溫-200.5ml

加去離子水至1000ml溶解即可。

終止液(stopbuffer)(2mol/LH2soJ：

21.7mlH2sol加去離子水至200mL

緩沖甘油(glycerinebuffer)

甘油9份

PB(pII8.0)1份

將9份甘油與1份PB合并，充分混勻。

0.5%%02-甲醇液(HydrogenPeroxide-MethanolSolution)(總體積120ml)

3%H20220ml

甲醇100ml

DAB-H2O2底物緩沖液(DAB-H202SubstrateBuffer)

取61ng二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-DiaminobenzidineTetrahydrochlorideDAB)

溶解于10ml0.05molTris-HClpH7.6。使用前取0.3%H2020.1ml加入到DAB溶

液中(H。的終濃度為0.003%)。如有沉淀生成，則用濾紙過濾。

5-澳-4-氯-3咧噪磷酸/四哇氮藍(lán)底物顯色液(BCIP/NBTSubstrateSolution)

貯存液配制：

NBT：在10ml70%的乙醇中溶解0.5gNBT。

BCTP：在10ml100與二甲基甲酰胺中溶解0.5gBCIPo

貯存液4℃保存，可穩(wěn)定一年。

底物顯色液：

取66u1NRT貯液與33u1RCTP加入到10ml堿性磷酸酶緩沖液中,充分混

勻，底物顯色液應(yīng)在用前1小時(shí)內(nèi)配制。

三、細(xì)胞相關(guān)試劑配制

L-谷氨酰胺(L-G)溶液(L-glutaminSolution)(0.2mol/L)

稱2.9gL-谷氨酰胺(分子量為146.15)用去離子水溶解至100ml,過濾

除菌，分裝小瓶，4?5ml/瓶，-20℃凍存。

100x青-鏈霉素(雙抗)溶液(P/SPenicillin/StreptomycinSolution)

取青霉素G(鈉鹽)100萬單位和鏈霉素(硫酸鹽)1g,溶于100ml去離

子水中，分裝小瓶，4?5ml/瓶，-20℃凍存。

7.5%NaHC%溶液(NaHC03Solution)

稱分析純NaHCQ,7.5g,用去離子水溶解至100ml,過濾除菌，分裝小瓶，

4?5ml/瓶，蓋緊瓶塞，4℃保存。

HEPES溶液(HEPESSolution)(lmol/L)

稱23.83gHEPES(N-2-Hydroxyeth)rlpiperazine-N，-2-ethanesulfonic

acid,N-2-羥乙基呱嗪-N'-2-乙基磺酸，分子量為238.3),用去離子水溶解至

100ml,過濾除菌,分裝小瓶，4?5ml/瓶,4'C保存。

氨基喋吟(A)貯存液(AminopterinStockingSolution)(100X,4XIO-5mol/L)

稱1.76mg氨基喋吟(Aminoptorin,分子量440.4),溶于90nli去離子水

中，滴加11noi/LNaOHO.5ml,并不斷攪動(dòng),待氨基喋吟完全溶解后，加1mol/L

的HC10.5ml中和,再補(bǔ)加去離子水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶,2ml/瓶,

-20℃凍存。

次黃嚓吟和胸腺嘴咤核昔貯存液(HTStockingSolution)(100X,H:10-2mol/L;

T:1.6X10-3mol/L)

稱取136.1mg次黃噂吟(Hypoxanthine,分子量136.1)和38.8mg胸腺

喀咤核昔(Thymidine,分子量242.2),加去離子水至100ml,置45?50C水

浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶，2ml/瓶，-20℃凍存。用前可置37℃

加溫助溶。

HAT培養(yǎng)液

培養(yǎng)液98ml,A貯存液1ml,HT貯存液1ml。

秋水仙素溶液(colchicineSolution)

稱取10mg秋水仙素，溶于100ml生理鹽水中(即為100ng/ml),過濾

除菌后，分裝小瓶，一20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

Alsever"s血細(xì)胞保存液(Alsever'sSolution)

葡萄糖2.05g,

檸橡酸鈉0.8g,

NaCl0.42g,

蒸儲(chǔ)水100ml。

以上成分混勻后，微加溫使其溶解后，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH6.1,分裝于三角

瓶中(30?50ml/瓶)，113℃濕熱滅菌15min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞凍存液(FreezingMedium)

50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMS0(二甲基亞碉)。

0.025%胰蛋白酶0.2%EDTA細(xì)胞消化液(Trypsin-EDTASolution)

A:2.5%胰蛋白酶:

胰蛋白酶2.5g

磷酸緩沖鹽溶液100血

過濾除菌保存。

B:0.2%二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)

EDTA0.2g

雙蒸儲(chǔ)水100ml

高壓滅菌保存。

取A液1份，加B液99份，混勻，分裝-20C保存。

0.83%NH4cl溶液(AmmoniumChlorideSolution)

NHCI0.83g

KIIC030.1g

EDTA?2Na0.0037g

蒸儲(chǔ)水加至lOOmlo

Tris-NH4cl溶液(Tris-AmmoniumChlorideSolution)

NH.Cl3.735g/450nli雙蒸水+Tris1.3g/50血雙蒸水(pH7.65)。

細(xì)胞裂解液(CellLysisSolution)

20mmol/I.HEPRS(pH7.5)

150mmol/LNaCl

1nunol/LEDTA

lOpg/mlleupeptin

Immol/LPMSF

1%TritonX-100

0.5%dooxicholatc(sodiumsalt)

0.1%SDS

組織勻漿緩沖液(HistolysisBuffer)

50mmol/LTris-HCl(pH7.5)

150mmol/LNaCl

1%NP40

liimiol/LphenyImelhyIbulfuny1fluoride

4pg/mlleupeptin

l|ig/mlaprotinin

細(xì)胞核裂解液(NuclearLysisBuffer)

lOmmol/LTris-HCl(pH8.0)

150mmol/LNaCl

lOmmol/LEDTA

蛋白酶KlOOMg/ml

0.4%SDS(最后加)

lOmmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)

在異丙醇中溶解PMSF至L74mg/ml,BPlOmrool/L,分裝后保存于-20℃,如

果需要的話，可將儲(chǔ)存液制備至17.4mg/ml,即100mmol/L的高濃度。

閃爍液(ScintillationSolution)

PPO(2,5-二苯基)5.0g、POPOP(1,4-雙一5一苯基)0.5g溶于1000ml二

甲苯中。也可將POPOP加入二甲苯，在37℃水浴上溶解后，再加PPO,然后補(bǔ)足

二甲苯。

3H-TdR工作液(wokingSolution)

按1:20的比例將濃度為ImCi/ml的汨一丁而用無血清的RPMT培養(yǎng)液稀釋，

終濃度為50Ki/ml。

肝素溶液的配制：

含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度

為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí);可

將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為

4℃o使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml(精確可加入0.9ml)即可。

I型膠原酶：

0.1%1型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)镮型膠

原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入

10ml小瓶-20℃保存。用時(shí)提前?小時(shí)37c復(fù)溫即可.0.1%的I型膠原酶的配置，100mg

的粉末狀的I型膠原酶可以溶于100ml的DMEM/F12,0.22微米濾器過濾0.1%的I型膠原酶的

配置，100mg的粉木狀的I型膠原酶可以溶「100ml的DMEM/F12,0.22微米流器過濾.

四、染色液配制(PreprationofStainingSolution)

蘇木素液(HematoxylinSolution)：

蘇木素2.5g,乙醇25.0ml,鉀明磯2.5g,氧化汞1.25g,冰乙酸20.0ml,

蒸儲(chǔ)水500.0ml。配制方法是先將蘇木素溶于乙醇中(稍加熱)。將預(yù)先已溶解

明磯的蒸儲(chǔ)水加入蘇木素乙醇液中，使溶液盡快沸騰后，將火焰熄滅，慢慢加入

氧化汞，防止溶液油濺出，再煮沸2min0將燒瓶立即浸入冷水中，當(dāng)染液冷卻

后，加入醋酸，室溫保存，用前過濾。

伊紅Y染色液(EosinYSolution)

伊紅Y0.5?1.0g,蒸僧水75ml,95%乙醇25ml,冰乙酸1?2滴。先取少

許蒸鐳水加入伊紅，用玻棒將伊紅研碎，再加入全部蒸鐳水，溶解后加入乙醇。

甲基綠染色液(MethylGreeenSolution)

新購買的甲基綠需用氯仿處理去除甲基紫。方法是將2%甲基綠水溶液20ml

傾入潔凈分液漏斗，移去慢慢下沉帶紫紅色的氯仿，再加入新的氯仿10ml，如

此反復(fù)更換氯仿，到無紫紅色為止。該液作為貯存液，4℃保存。染色液：甲基

綠貯存液5ml,5%派諾寧水溶液1ml,蒸儲(chǔ)水12mL0.2mol/L乙酸鈉(pH4.8)18ml

(臨用前配制，濾紙過濾1

口丫咤橙貯存液(AcridineOrangeStockingSolution)

lOmgRY咤橙溶解于100mlPBS中,pH4.8?6.0濾過,4℃避光保存。

吉姆薩貯存液(GiemsaSolution)

吉姆薩染色粉1g先溶于少量甘油，在研缽內(nèi)研磨30min以上，至看不見顆

粒為止，再將全部(66nl)剩余甘油倒入，于56℃溫箱內(nèi)保溫2h。然后再加入甲

醇(66ml),攪勻后保存于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可長(zhǎng)期保存，一般剛配

制的母液染色效果欠佳，保存時(shí)間越長(zhǎng)越好。

臨用時(shí)用pH7.4磷酸緩沖液稀釋10倍，隨配隨用。

瑞氏染色液(Wright'sSolution)

瑞氏染色粉0.3g

甘油3ml

甲醇97ml

將瑞氏染色粉放干燥研缽內(nèi)磨細(xì)，加入甘油繼續(xù)研磨，不斷滴加甲醇并繼續(xù)

研磨，將上層溶解的染料倒入棕色瓶中，直至染料全溶后加甲醇至所需量?；靹?/p>

后置棕色瓶中保存，用前過濾。一般配制后置室溫一周便可使用，保存時(shí)間愈入,

則染色效果愈佳。

吉姆薩-瑞氏染色液(Giemsa-Wright'sStainingSolution)

瑞氏染色粉0.3g

吉姆薩染色粉0.03g

甲醇100m：

將二種粉末置于研缽中磨細(xì)，再逐滴加入甲醇混勻后倒入棕色瓶中，塞緊瓶

口并充分振蕩。置室溫溶解后使用。

嚷噗蘭(MTT)

稱取250mgMTT,加50mlPBS(0.01mol/L,pH7.4)在磁力攪拌器上攪拌

30min,用0.22囚n的微孔濾膜過濾除菌，分裝，4℃保存。兩周內(nèi)有效。

臺(tái)酚藍(lán)染色液(TrypanBlueSolution)

A：臺(tái)酚藍(lán)染料ig

蒸儲(chǔ)水100ml

將染料置于研缽中邊研磨邊加入蒸儲(chǔ)水溶解。

B：NaCl1.7g

蒸饋水100ml

臨用前A、B液1：1混合，離心沉淀，取上清供染色用?；旌虾蟮娜疽捍娣?/p>

過久，易形成沉淀，故應(yīng)新鮮配制。

染色時(shí)，取細(xì)胞懸液0.1ml加入新鮮配制的染色液一滴，室溫下染5?10分

鐘，取一滴懸液于載波片上，加蓋玻片，高倍鏡下檢查。死亡細(xì)胞膨大并染成淺

藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，大小正常。

五、固定劑(Fixatives)

大多數(shù)神經(jīng)激素、肽類物質(zhì)為水溶性，在用于免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，常需

固定。但肽類和蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)不同，因而對(duì)不同的固定方法或固定劑

的反應(yīng)也不同。某些固定劑甚至可同時(shí)破壞和/或保護(hù)同一抗原的不同抗原決定

簇。因此，在進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)研究之前，很有必要了解所要研究的物質(zhì)(蛋白

質(zhì)或肽類)的化學(xué)性質(zhì)，并根據(jù)需要來選擇適宜的固定劑(或固定方法)以及改

進(jìn)固定條件。目前，免疫細(xì)胞化學(xué)研究中常用的固定劑仍為醛類固定劑，其中以

甲醛類和戊二醛最為常用。

4%多聚甲醛-0.Imol/L磷酸緩沖液，pH7.3（formaldehyde-PhasphateBuffer）

多聚甲醛40g

0.Imol/L磷酸緩沖液至1000ml

配制方法:稱取40g多聚甲醛，置于三角燒瓶中，加入500?800ml0.Imol/L

磷酸緩沖液（PhosphateBuffer以下簡(jiǎn)稱PB）,加熱至60℃左右，持續(xù)攪拌（或

磁力攪拌）至完全溶解，通常需滴加少許INNaOH才能使溶液清亮，最后補(bǔ)足

Olmol/L的PB于1000ml,充分混勻。

該固定劑較適于光鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，最好是動(dòng)物經(jīng)灌注固定取材后，繼

續(xù)浸泡固定2?24h。另外，該固定劑較為溫和，適于組織標(biāo)本的較長(zhǎng)期保存。

4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉/氫氧化鈉（formaldehyde-SodiumPhosphate/Sodium

HydroxideBuffer)

A液：多聚日醛40g

蒸儲(chǔ)水400ml

B液：Na2HP0,?2H2016.88g

蒸儲(chǔ)水300加

C液：NaOH3.86g

蒸鐳水200nli

配制方法：A液最好在500nli的三角燒瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛

完全溶解后冷卻待用。注意，在溶解多聚甲醛時(shí)，要盡量避免吸入氣體或?yàn)R入眼

內(nèi)。B液和C液配制好后，將B液倒入C液中，混合后再加入A液，以INNaOH

或INHC1將pH調(diào)至7.2-7.4,最后，補(bǔ)充雙蒸水至1000ml充分混合，4c冰

箱保存?zhèn)溆谩?/p>

該固定劑適于光鏡和電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)研究，用于免疫電鏡時(shí)，最好加入少

量新鮮配制的戊二醛，使其終濃度為0.5%--l%o該固定劑較溫和，適丁組織的

長(zhǎng)期保存。組織標(biāo)本于該固定液中，4℃冰箱保存數(shù)月仍可獲得滿意的染色效果。

六、蛋白電泳相關(guān)試劑

30%丙烯酰胺（Acrylmide）

丙烯酰胺29g

N,N'-亞甲雙丙烯酰胺lg

溶于60nli水中，加熱至37℃溶解，補(bǔ)加水至終體積100ml。0.45兇濾器過

濾除雜質(zhì)，置深色瓶中室溫保存。

考馬斯亮藍(lán)R-250染色液(CoomassieStainingSolution)

1.稱取1g考馬斯亮藍(lán)卜250,置于1L燒杯中。

2.量取250nli的異丙醇加入上述燒杯中，攪拌溶解。

3.加入100ml的冰醋酸，攪拌均勻。

4.加入650血的去離子水，攪拌均勻。

5.用濾紙除去顆粒物質(zhì)后，室溫保存。

考馬斯亮藍(lán)脫色液(DestainingSolution)

量取下列溶液，置于1L燒杯中，充分混合后使用。

醋酸100ml

乙醇50ml

dll,0850ml

Imol/L二硫蘇糖醇貯存液(DTTStockingSolution)

用20ml0.01mol/L乙酸鈉溶液(pH5.2)溶解3.09gDTT,過濾除菌后分裝

成1ml小份貯存于一20℃保存。DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理。

0.Imol/LpH2.4甘氨酸-HC1緩沖液(Glycinc-HClBuffer)

稱取固體甘氨酸［MW75.07)15.01克,用蒸鐲水溶解后，加入O.2mol/LHC1

648ml,然后定容成2000ml。

2XSDS凝膠加樣緩沖液(2XLoadingBuffer)

100mmol/LTris.Cl(pH6.8)

200mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)

4%SDS(電泳級(jí))

0.2%浪酚藍(lán)

20%甘油

不含二硫蘇糖醉的2XSDS凝膠加樣緩沖液可以保存于室溫，臨用前須從

lniol/L二硫蘇糖醇(DTT)貯存液現(xiàn)用現(xiàn)加于上述緩沖液。

10%十二烷基硫酸鈉(SDS)

在900ml蒸儲(chǔ)水中溶解100g電泳級(jí)SDS,加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸

調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2,加水定容至1L,分裝備用。

SDS的微細(xì)晶粒易于擴(kuò)散，因此稱量時(shí)要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在

稱量工作區(qū)和天平上的SDS,10%SDS溶液無需滅菌。

電轉(zhuǎn)印緩沖液為(Semi-DryTransferBuffer)

Tris3g

Glycine14.4g

SDS0.185g

加入甲醇200口1,用去離子水調(diào)至1000ml。

Tris一乙酸50X(TAE)

Tris堿242g

冰乙酸57.1ml

0.5mol/LEDTA(pH8.0)100ml

蒸儲(chǔ)水定容至ILo

1115-硼酸5><(TBE)

Tris堿54g

硼酸27.5g

0.5mol/LEDTA(plI8.0)20ml

蒸餛水定容至ILo

TE緩沖液10X(pH7.4,7.6,8.0)

1.量取下列溶液，置于1L燒杯中。

lmol/LTris-HCl(pH7.4,7.6,8.0)100ml

500inniol/LEDTA(pH8.0)20ml

2.向燒杯中加入約800nli的去離子水，均勻混合。

3.將溶液定容至1L后，高溫高壓滅菌。

4.室溫保存。

Tris一甘氨酸緩沖液(Tris-GlycineBuffer5X)

Tris15.1g

甘氨酸（電泳級(jí)）94g

10%SDS（電泳級(jí)）50ml

蒸播水定容至ILo

七、淋巴細(xì)胞分離液

聚蔗糖一泛影葡胺分層液（Ficoll-paqueGradientMixer）

90g/L聚蔗糖15nl,加500g/L泛影葡胺10ml（比重1.14）。

90g/L聚蔗糖17.5mL加500g/L泛影葡胺10ml（比重1.13）。

90g/L聚蔗糖20mL加500g/L泛影葡胺10ml（比重1.12）。

90g/L聚蔗糖24nl,加500g/L泛影葡胺10ml（比重1.08）。

Percoll配制（PreprationofPercoll）

將一份10XPBS與9份Parcel1貯存液混合，制成等滲Parcel1懸液，此

懸液被認(rèn)為是100%Percoll,其密度為1.1294/mU利用1XPBS或細(xì)胞培養(yǎng)液稀

釋100%Percoll,可獲得適宜密度的細(xì)胞分層液，用于各種細(xì)胞的分離，其濃

度與密度的關(guān)系如下:

70%Percoll比重1.090g/ml

60%Pcrcoll比重1.077g/ml

50%Pcrcol1比重1.067g/ml

40%Percoll比重1.056g/ml

30%Percoll比重1.043g/ml

20%Percoll比重1.037g/ml

人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離Ficoll分層液配制

9%聚蔗糖（Ficoll）24份

34%泛影葡胺(UiogrdjTiu)10%

混合，測(cè)比重為1.077?1.078,G5玻璃濾器過濾除菌。4c冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

八、其它試劑

佐劑（Adjuvant）

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常用弗氏佐劑（Freundadjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、液

體石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例，視需要可調(diào)整為1：2?9(V/V),充分

混合后即是不完全福氏佐劑，如果在每毫升不完全佐劑加入1?20nig卡介苗就成

為完全弗氏佐劑。

配制方法：將羊毛脂與石蠟油按比例置于容器內(nèi)，超聲波混勻，高壓滅菌，

4c保存?zhèn)溆?。免疫前取等容積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器

混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加

入等容積抗原液(其中加卡介苗3?4mg/ml或不加)，加完后再繼續(xù)研磨成乳齊小

滴于冰水上5?lOmin內(nèi)完全不擴(kuò)散為止。為避免損失抗原，亦可用一注射器裝

抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復(fù)抽吸,

約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

清潔液(CleaningSolution)

配方1：重銘酸鉀100g

蒸僧水200ml

濃硫酸800ml

將重格酸鉀加入蒸儲(chǔ)水中，使之自然溶解或水浴溶解，亦可在大耳期中加熱

溶解，然后慢慢加入濃硫酸，邊加邊攪拌，見發(fā)熱過劇則稍停，冷卻后再繼續(xù)加。

此為強(qiáng)洗液。盛清潔液的容器要堅(jiān)固，上加厚玻璃蓋，操作時(shí)要穿橡皮圍裙、長(zhǎng)

統(tǒng)膠靴、戴上眼鏡和厚膠皮手套，以保安仝。洗液一旦變綠，表示銘酸已經(jīng)還原,

失去了氧化能力，不宜再用。如將這樣洗液加熱，再加適量重銘酸鉀，又可重新

使用。

配方2：重銘酸鉀60g

蒸儲(chǔ)水300ml

濃硫酸460ml

此為中等強(qiáng)度洗液。

配方3：重輅酸鉀100g

蒸儲(chǔ)水750ml

濃硫酸250ml

此液為弱洗液，為棕紅色。使用此液時(shí)，必須預(yù)先用熱肥皂水將玻璃器皿洗

凈，經(jīng)自來水沖洗，瀝干然后才能浸入，否則該洗液很快失效。

（崔雪玲）

氨苫青霉素（Ampicillin）

在9ml蒸儲(chǔ)水中溶解lgAmpicillin粉末并定容至10ml,然后用0.22um微孔濾膜過濾

除菌，分裝成小份存于?20C。

膏、鏈霉素溶液：

所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)

完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單

位/瓶，力口5ml滅菌雙蒸水，即每亳升各為20萬單位。分裝于一20℃保存。使用

時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。

3%酸性酒精溶液

濃鹽酸3ml95%酒精97ml

中性紅指示劑

中性紅0.04g

95%乙醇28ml

蒸儲(chǔ)水72ml

中性紅PH6.8—8,顏色由紅變黃，常用濃度為0.04%

淀粉水解試驗(yàn)用碘液（盧戈氏碘液）

碘片1g

碘化鉀2g

蒸鐳水300ml

先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全落后,

加足水分即成。

澳甲酚紫指示劑

澳甲酚紫0.04g0.01mol/LNaOH7.4ml

蒸儲(chǔ)水92.6m1

澳甲酚紫pH5.2—6.8,顏色由黃變紫，常用濃度為0.04%o

浪腐香草酚藍(lán)指示劑

澳麝香草酚藍(lán)0.04g

0.01mol/LNaOll6.4ml

蒸播水93.6m1

澳麝香草酚藍(lán)pH6.0-7.6,顏色由黃變藍(lán)，常用濃度為0.04%。

甲基紅試劑

甲基紅(Methylred)0.04g

95%酒精60ml

蒸馀水40ml

先將甲基紅溶于95%酒精中，然后加入蒸儲(chǔ)水即可。

V.P.試劑

1.5%a-茶酚無水酒精溶液

”蔡酚5g

無水乙醇100ml

2.40%K0H溶液

KOH40g

蒸儲(chǔ)水100ml

口引味試劑

對(duì)二甲基氨基苯甲醛2g

95%乙醇190ml

濃鹽酸401nl

格里斯氏氏riess)

試劑

A液:對(duì)氨基苯磺酸0.5g

10%稀醋酸150ml

B液：Q-蔡胺0.1g

蒸鐳水20ml

10%稀醋酸150ml

二苯胺試劑

二苯胺0.5g溶于100ml濃硫酸中，用20ml蒸儲(chǔ)水稀釋

十一、阿氏(Alscvcr)血液保存液

檸檬酸三鈉-2H208g

檸檬酸0.5g

無水葡萄糖18.7g

NaCl4.2g

蒸儲(chǔ)水1000ml

將各成分溶解于蒸儲(chǔ)水后，用濾紙過濾，分裝，0.56-0.70kg/cm2(8-10

磅/英寸2),滅菌20分鐘。冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

pH8.6離子強(qiáng)度0.075moi/L巴比妥緩沖液

巴比妥2.76g

巴比妥鈉15.45g

蒸儲(chǔ)水1000ml

1%離子瓊脂

瓊脂粉1g

巴比妥緩沖液501nl

蒸儲(chǔ)水50ml

設(shè)硫柳汞1滴

稱取瓊脂粉1g先加至50ml蒸儲(chǔ)水中，于沸水浴中加熱溶解，然后加入50ml

巴比妥緩沖液，再滴加1滴設(shè)硫柳汞溶液防腐，分裝試管內(nèi)，放冰箱中備月。

電泳緩沖液

50XTris-乙酸(TAE)緩沖液成分及終濃度

配制1L

溶液各成分的用量

2mol/LTris堿

lmol/L乙酸

100mmol/LEDTA水242g

57.1ml的冰乙酸(17.4mol/L)

200nli的0.5mol/LEDTA(pH8.0)

補(bǔ)足IL

1%澳酚藍(lán)

加1g水溶性鈉型溟酚藍(lán)于100ml水中，攪拌或渦旋混合直到完全溶解。

1%二甲苯青FF(xylenecyanoIeFF)

溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100電1。

lOmg/ml的淡化乙錠

小心稱取1g溪化乙錠，轉(zhuǎn)移到廣口瓶中，加100ml水，用磁力攪拌器攪拌

直到完全溶解。用鋁箔包裹裝液管，于4℃貯存。

四常用抗生素

氨茉青霉素(ampicillin)(100mg/ml)

溶解1g氨葦青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至10nl1。分裝成小份于

-20℃貯存。常以25ug/川l~50ug/i【il的終濃度添加了生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

段茉青霉素(carbenicillin)(50mg/ml)

溶解0.5g竣葦青霉素二鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份

于-20℃貯存。常以25ug/ml?50ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

甲氧西林(methici11in)(100mg/ml)

溶解lg甲氧西林鈉于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃

貯存。常以37.5ug/ml終濃度與100ug/ml氨節(jié)青霉素一-起添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

卡那霉素(kanamycin)(10mg/ml)

溶解lOOmg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10向。分裝成小份于-20℃

貯存。常以10ug/ml?50ug/n)l的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基

氯霉素(chloramphenicol)(25mg/ml)

溶解250mg氯霉素足量的無水乙醇中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃

貯存。常以12.5ug/ml?25ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

鏈霉素(streptomycin)(50mg/ml)

溶解0.5g鏈霉素硫酸鹽于足量的無水乙醇中，最后定容至lOmlc分裝成小

份于-20℃貯存。常以10ug/ml?50ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

蔡咤酮酸(nalidixicacid)(5mg/ml)

溶解50mg蔡咤酮酸鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml。分裝成小份于-20℃

貯存。常以15ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

四環(huán)素(tetracyyline)(10mg/ml)

溶解lOOmg四環(huán)素鹽酸鹽于足量的水中，或者洛無堿的四環(huán)素溶于無水乙醇，

定容至10ml。分裝成小份用鋁箔包裹裝液管以免溶液見光，于-20C貯存。常以

10ug/ml-50ug/ml的終濃度添加于生長(zhǎng)培養(yǎng)基

五、常用貯存液的配制

1.30%丙烯酰胺溶液

【配制方法】

將29g丙烯酰胺和lgN,N'-亞甲雙丙烯酰胺溶廣總體積為60ml的水中。加熱至37c溶解

之，補(bǔ)加水至終體積為100mL用Nalgene濾器(0.45叫1孔徑)過濾除菌，查證該溶液的

pH值應(yīng)不大于7.0,置棕色瓶中保存于室溫。

【注意】

丙烯酰胺具備很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，具作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲

雙丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)

含有少量未聚合材料。

?些價(jià)格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有?些金屬離子，在丙烯酰胺貯存液中加入大

約0.2體積的單床混合樹脂(MB-lMallinckrodt),攪拌過夜，然后用Whatman1號(hào)濾紙過

濾以純化之。

在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會(huì)緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯酸。

2.40%丙烯酰胺

【配制方法】

把380g丙烯酰胺(DNA則序級(jí))和20gN,N'■亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600ml的蒸

儲(chǔ)水中。繼續(xù)按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法處理，但加熱溶解后應(yīng)以蒸儲(chǔ)水補(bǔ)足至

終體積為1U

【注意】

見上述配制30%丙烯酰胺的說明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列測(cè)定。

3.放線菌素D溶液

【配制方法】

把20mg放線菌素D溶解于4ml100%乙醇中，1：10稀釋貯存液，用100%乙醇作空白對(duì)

照讀取OD440值。放線茵素D(分子量為1255)純品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為21,

900,故而lmg/ml的放線菌素D溶液在440nm處的吸光俏為0.182,放線菌素D的貯存

液應(yīng)放在包有箔片的試管中，保存于-20℃。

【注意】

放線菌素D是致畸劑和致癌劑，配制該溶液時(shí)必須戴手套并在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，而不能在開

放在實(shí)驗(yàn)桌面上進(jìn)行，謹(jǐn)防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。

藥廠提供的作治療用途的放線菌素D制品常含有糖或鹽等添加劑。只要通過測(cè)量貯存液在

440rlm波K處的九吸收確.定放線菌素D的濃度，這類制品便可用于抑制自身引導(dǎo)作用。

4.0.1mol/L腺昔三磷酸(ATP)溶液

【配制方法】

在0.8ml水中溶解60mgATR用0.1mol/LNaOH調(diào)至pH值至7.0,用蒸儲(chǔ)水定容1ml,分

裝成小份保存于?70℃

5.10mol/L乙酸酰溶液

【配制方法】

把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后過濾除菌。

6.10%過硫酸鏤溶液

【配制方法】

把1g過硫酸錢溶解于終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4℃保存數(shù)周。

7.BCIP溶液

【配制方法】

把0.5g的5-澳-4-氯-3/引味磷酸二鈉鹽(BCIP)溶解于10ml100%的二甲基甲酰胺中，保

存于4c

8.2xBES緩沖鹽溶液

【配制方法】

用總體積90ml的蒸窗水溶解1.07g鹽溶液BES.1.6gNaCI和0.027gNa2HPO4,室溫下用

HCI調(diào)節(jié)該溶液的pH俏至6.96、然后加入蒸飾水定容至100ml,用0.22pm濾器過濾除菌.

分裝成小份，保存于?20℃。

9.Imol/LCaCI2溶液

【配制方法】

在200ml蒸偏水中溶解54gCaCI2?6H2O,用0.22pm濾器過濾除菌，分裝成10ml小份貯

存于?20℃。

【注意】

制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，取出一小份解凍并用蒸儲(chǔ)水稀釋至100ml,用Nalgene濾器(0.45|jm

孔徑)過濾除菌，然后驟冷至0℃。

10.2.5mol/LCaCI2溶液

【配制方法】

在20m