小檗堿對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的激活及改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性機(jī)制探究一、引言1.1研究背景動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）作為一種慢性炎癥性心血管疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。其病理特征表現(xiàn)為動(dòng)脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小，是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。全球范圍內(nèi)，動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率居高不下，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脆弱性是引發(fā)急性心血管事件的關(guān)鍵因素。不穩(wěn)定的斑塊容易破裂，暴露其內(nèi)部的促凝物質(zhì)，導(dǎo)致血栓形成，進(jìn)而引發(fā)心肌梗死、腦卒中等嚴(yán)重后果。研究表明，斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)核心大小、纖維帽厚度以及平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的含量等因素，均與斑塊的脆弱性密切相關(guān)。其中，巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，其功能狀態(tài)的改變對(duì)斑塊的穩(wěn)定性有著深遠(yuǎn)影響。巨噬細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的自我降解過(guò)程，通過(guò)清除受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)聚集體和病原體等，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在動(dòng)脈粥樣硬化中，巨噬細(xì)胞自噬可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝、減輕炎癥反應(yīng)，從而對(duì)斑塊的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。當(dāng)巨噬細(xì)胞自噬功能受損時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累增加，炎癥因子釋放增多，導(dǎo)致斑塊的脆弱性增加；而激活巨噬細(xì)胞自噬則有助于改善脂質(zhì)代謝、抑制炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性。小檗堿（Berberine，BBR）是一種從黃連、黃柏等中藥中提取的異喹啉類生物堿，具有廣泛的藥理活性，如抗炎、抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂和血糖等。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，小檗堿在心血管疾病的防治中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在動(dòng)脈粥樣硬化方面，小檗堿能夠通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，如抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等。然而，小檗堿對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響及其在改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性中的作用機(jī)制尚不完全清楚。因此，深入研究小檗堿激活巨噬細(xì)胞自噬并改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性的作用機(jī)制，對(duì)于揭示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)以及開(kāi)發(fā)有效的治療藥物具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究小檗堿激活巨噬細(xì)胞自噬并改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性的作用機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究目的如下：明確小檗堿對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性的影響：通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，觀察小檗堿對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、發(fā)展及脆弱性相關(guān)指標(biāo)的影響，如斑塊面積、脂質(zhì)核心大小、纖維帽厚度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，明確小檗堿在改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性方面的作用效果。揭示小檗堿激活巨噬細(xì)胞自噬的分子機(jī)制：運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，研究小檗堿對(duì)巨噬細(xì)胞自噬相關(guān)信號(hào)通路（如AMPK/mTOR信號(hào)通路等）及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，揭示小檗堿激活巨噬細(xì)胞自噬的具體分子機(jī)制。探討小檗堿通過(guò)激活巨噬細(xì)胞自噬改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性的內(nèi)在聯(lián)系：通過(guò)干預(yù)巨噬細(xì)胞自噬水平，觀察小檗堿對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性的影響是否發(fā)生改變，進(jìn)一步明確小檗堿激活巨噬細(xì)胞自噬與改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性之間的因果關(guān)系和內(nèi)在聯(lián)系。本研究的意義在于：理論意義：有助于深化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的理解，豐富巨噬細(xì)胞自噬在心血管疾病中的作用理論，為進(jìn)一步研究動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過(guò)程提供新的視角和思路。臨床意義：為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和藥物研發(fā)方向。小檗堿作為一種天然的生物堿，具有來(lái)源廣泛、安全性較高等優(yōu)點(diǎn)。如果能夠明確其在激活巨噬細(xì)胞自噬并改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性方面的作用機(jī)制，有望開(kāi)發(fā)成為一種新型的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物，或?yàn)楝F(xiàn)有治療方案提供補(bǔ)充和優(yōu)化，從而提高動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的治療效果，降低心血管事件的發(fā)生率和死亡率，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。二、小檗堿、巨噬細(xì)胞自噬與動(dòng)脈粥樣硬化概述2.1小檗堿簡(jiǎn)介小檗堿（Berberine，BBR），又稱黃連素，是一種主要從黃連、黃柏、三顆針等多種中藥材中提取分離得到的異喹啉類生物堿。這些植物在傳統(tǒng)中醫(yī)領(lǐng)域應(yīng)用歷史悠久，常被用于治療各類炎癥、感染以及消化相關(guān)疾病。小檗堿最早于1934年被我國(guó)科學(xué)家從小檗屬植物中成功分離，并鑒定出其化學(xué)結(jié)構(gòu)。從理化性質(zhì)來(lái)看，小檗堿呈黃色或淡黃色結(jié)晶性粉末狀，味道極苦，屬于季銨堿類化合物，分子中含有多個(gè)羥基取代基，并且氮原子處于季銨的位置，賦予了它一定的堿性，這使得小檗堿能夠與蛋白質(zhì)、核酸等多種生物大分子發(fā)生相互作用，從而展現(xiàn)出廣泛的藥理活性。在植物體內(nèi)，小檗堿主要富集于根莖部位，如今，其提取和純化技術(shù)已相對(duì)成熟。在多種生物體內(nèi)，包括人體，小檗堿均能夠被吸收和利用，這為其在醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在傳統(tǒng)藥用價(jià)值方面，小檗堿及相關(guān)中藥一直以來(lái)被視為具有顯著抗炎、抗菌、抗病毒作用的良藥。中醫(yī)古籍《傷寒論》中就有“傷寒胸中有熱，胃中有邪氣，腹中痛，欲嘔吐者，黃連湯主之”以及“熱利下重者，白頭翁湯主之”的記載，生動(dòng)體現(xiàn)了小檗堿在治療細(xì)菌引發(fā)的消化系統(tǒng)疾病方面的重要價(jià)值，長(zhǎng)期以來(lái)在臨床實(shí)踐中被廣泛應(yīng)用。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，小檗堿在心血管疾病、代謝性疾病等領(lǐng)域的潛在藥用價(jià)值逐漸被揭示。在心血管疾病方面，小檗堿展現(xiàn)出了抗氧化、抗血小板聚集、保護(hù)心肌細(xì)胞、改善血管內(nèi)皮功能等多種作用，對(duì)多種心臟疾病具有一定的預(yù)防和治療功效。有研究表明，小檗堿能夠通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激損傷以及調(diào)節(jié)能量代謝等途徑，有效發(fā)揮心血管保護(hù)作用。在代謝性疾病方面，小檗堿能夠調(diào)節(jié)血糖和血脂水平，改善胰島素抵抗，為糖尿病、高血脂等疾病的治療提供了新的思路和方法。小檗堿還被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等作用，其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景愈發(fā)廣闊。2.2巨噬細(xì)胞自噬機(jī)制2.2.1自噬的基本過(guò)程自噬是細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的自我降解過(guò)程，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激以及參與發(fā)育和衰老等生理病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其基本過(guò)程主要包括自噬體形成、與溶酶體融合及降解三個(gè)階段。當(dāng)細(xì)胞受到如營(yíng)養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激、病原體入侵等刺激時(shí)，自噬被激活。首先是自噬體前體（phagophore）的形成，這一過(guò)程涉及一系列自噬相關(guān)蛋白（Atg）的參與。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，ULK1（Unc-51-likekinase1）復(fù)合物在自噬起始階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏時(shí)，AMPK（5'-adenosinemonophosphate-activatedproteinkinase）被激活，它可以磷酸化并激活ULK1，同時(shí)抑制mTORC1（mammaliantargetofrapamycincomplex1）的活性。mTORC1是自噬的負(fù)調(diào)控因子，其活性被抑制后，ULK1復(fù)合物得以激活下游的自噬相關(guān)蛋白，啟動(dòng)自噬體前體的組裝。自噬體前體通常被認(rèn)為起源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)，它逐漸延伸并彎曲，開(kāi)始包裹細(xì)胞內(nèi)需要降解的物質(zhì)，如受損的細(xì)胞器（如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等）、錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)以及入侵的病原體等。隨著自噬體前體的不斷延伸，它最終閉合形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體（autophagosome）。在這個(gè)過(guò)程中，Atg5-Atg12-Atg16L1復(fù)合物和LC3（微管相關(guān)蛋白1輕鏈3，Microtubule-associatedprotein1lightchain3）-II發(fā)揮著重要作用。Atg5與Atg12通過(guò)共價(jià)連接形成Atg5-Atg12復(fù)合物，該復(fù)合物再與Atg16L1結(jié)合，形成Atg5-Atg12-Atg16L1復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物能夠定位到自噬體前體膜上，促進(jìn)膜的延伸和閉合。LC3最初以LC3-I的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，在自噬體形成過(guò)程中，LC3-I會(huì)被Atg4切割，暴露出C端的甘氨酸殘基，然后在Atg7和Atg3的作用下，與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，形成LC3-II，并定位于自噬體膜上。LC3-II不僅參與自噬體膜的延伸和成熟，還可以作為自噬體的標(biāo)志性蛋白，用于檢測(cè)自噬的發(fā)生。自噬體形成后，會(huì)通過(guò)細(xì)胞骨架（微管和肌動(dòng)蛋白絲）的運(yùn)輸，與溶酶體（lysosome）發(fā)生融合。這一融合過(guò)程涉及多種蛋白和分子的參與，其中SNARE（SolubleN-ethylmaleimide-sensitivefactorattachmentproteinreceptor）蛋白家族起著關(guān)鍵作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Syntaxin17（一種SNARE蛋白）定位于自噬體膜上，它與溶酶體膜上的SNARE蛋白（如SNAP29和VAMP8）相互作用，形成SNARE復(fù)合物，促進(jìn)自噬體與溶酶體的緊密結(jié)合和膜融合。Rab7（一種小GTP酶）也參與了這一過(guò)程，它可以與自噬體膜上的特定蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)自噬體的運(yùn)輸和與溶酶體的融合。此外，HOPS（Homotypicfusionandproteinsorting）復(fù)合物等也在自噬體與溶酶體的融合中發(fā)揮重要作用。融合后形成的自噬溶酶體（autolysosome）內(nèi)含有豐富的酸性水解酶，在酸性環(huán)境下，這些水解酶被激活，對(duì)自噬體內(nèi)包裹的物質(zhì)進(jìn)行降解。降解產(chǎn)物如氨基酸、脂肪酸、核苷酸等小分子物質(zhì)會(huì)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，重新被細(xì)胞利用，用于合成新的生物大分子或提供能量，從而維持細(xì)胞的正常代謝和功能。如果自噬過(guò)程出現(xiàn)異常，如自噬體的形成受阻、與溶酶體融合障礙或降解過(guò)程異常等，都可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的積累和代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)多種疾病，如神經(jīng)退行性疾?。ò柎暮Ｄ?、帕金森病等）、腫瘤、心血管疾病等。因此，自噬的正常進(jìn)行對(duì)于維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和健康至關(guān)重要。2.2.2巨噬細(xì)胞自噬的特點(diǎn)及在免疫調(diào)節(jié)中的作用巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)中的重要細(xì)胞，其自噬過(guò)程具有一些獨(dú)特之處。與其他細(xì)胞類型相比，巨噬細(xì)胞的自噬活性通常較高，這與其在免疫防御和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的重要功能密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的吞噬能力，能夠攝取和清除病原體、凋亡細(xì)胞、細(xì)胞碎片等多種物質(zhì)。在這個(gè)過(guò)程中，自噬發(fā)揮著重要的輔助作用，它可以幫助巨噬細(xì)胞更有效地處理和降解吞噬物，增強(qiáng)免疫防御功能。巨噬細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)機(jī)制也具有其特殊性。除了受到一般細(xì)胞自噬誘導(dǎo)因素（如營(yíng)養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激等）的影響外，巨噬細(xì)胞還可以通過(guò)模式識(shí)別受體（PatternRecognitionReceptors，PRRs）識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-AssociatedMolecularPatterns，PAMPs）或損傷相關(guān)分子模式（Damage-AssociatedMolecularPatterns，DAMPs）來(lái)激活自噬。Toll樣受體（Toll-likeReceptors，TLRs）是一類重要的PRRs，當(dāng)TLRs識(shí)別到相應(yīng)的配體（如細(xì)菌的脂多糖、病毒的雙鏈RNA等）后，會(huì)通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活自噬相關(guān)蛋白，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。巨噬細(xì)胞還可以通過(guò)細(xì)胞因子（如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α等）的作用來(lái)調(diào)節(jié)自噬水平，這些細(xì)胞因子可以與巨噬細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，從而影響自噬的啟動(dòng)和進(jìn)程。在免疫調(diào)節(jié)方面，巨噬細(xì)胞自噬發(fā)揮著關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞自噬在抗菌免疫中起著重要作用。當(dāng)巨噬細(xì)胞吞噬病原體后，自噬體可以包裹病原體，形成自噬溶酶體，通過(guò)溶酶體內(nèi)的水解酶和活性氧等物質(zhì)將病原體降解，從而清除入侵的病原體。自噬還可以通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的抗菌肽表達(dá)、代謝重編程等方式來(lái)增強(qiáng)抗菌能力。研究發(fā)現(xiàn)，自噬缺陷的巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌、李斯特菌等病原體的清除能力明顯下降，導(dǎo)致感染的擴(kuò)散和加重。巨噬細(xì)胞自噬在炎癥調(diào)節(jié)中也具有重要意義。自噬可以通過(guò)降解炎癥相關(guān)信號(hào)分子和炎癥小體等方式來(lái)抑制炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活。炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到病原體感染或損傷刺激時(shí)，炎癥小體會(huì)被激活，導(dǎo)致炎癥因子（如白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-18等）的釋放。自噬可以識(shí)別并降解炎癥小體，從而抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。自噬還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，巨噬細(xì)胞在不同的微環(huán)境刺激下可以極化為M1型（促炎型）和M2型（抗炎型）。自噬能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，從而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)和免疫耐受。巨噬細(xì)胞自噬在抗原呈遞過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用?？乖蔬f是免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除病原體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，巨噬細(xì)胞可以通過(guò)自噬途徑將吞噬的病原體或內(nèi)源性抗原進(jìn)行降解，并將抗原肽提呈給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。研究表明，自噬缺陷的巨噬細(xì)胞在抗原呈遞過(guò)程中存在障礙，導(dǎo)致T細(xì)胞的激活受到抑制，從而影響免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和效果。巨噬細(xì)胞自噬在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，其異常可能導(dǎo)致免疫功能紊亂，引發(fā)多種免疫相關(guān)疾病。2.3動(dòng)脈粥樣硬化的病理進(jìn)程及斑塊脆弱性2.3.1動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展階段動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性、進(jìn)行性的血管疾病，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜且多階段的過(guò)程，涉及多種細(xì)胞和分子機(jī)制。目前認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展主要經(jīng)歷以下幾個(gè)階段：內(nèi)皮損傷與功能障礙階段：血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血液與血管壁之間的屏障，在維持血管穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)血管內(nèi)皮受到多種危險(xiǎn)因素（如高血壓、高血脂、高血糖、吸煙、氧化應(yīng)激、炎癥因子等）的刺激時(shí)，會(huì)發(fā)生損傷并出現(xiàn)功能障礙。這些危險(xiǎn)因素可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，使得血液中的脂質(zhì)（主要是低密度脂蛋白，LDL）更容易進(jìn)入內(nèi)皮下間隙。內(nèi)皮細(xì)胞還會(huì)分泌多種細(xì)胞因子和黏附分子，如血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，這些分子能夠吸引血液中的單核細(xì)胞和低密度脂蛋白（LDL）進(jìn)入血管內(nèi)膜下，從而啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。脂質(zhì)條紋形成階段：進(jìn)入內(nèi)皮下的LDL會(huì)被氧化修飾，形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。ox-LDL具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，它可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放趨化因子，吸引血液中的單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下間隙。單核細(xì)胞在內(nèi)皮下分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過(guò)其表面的清道夫受體大量攝取ox-LDL，逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。隨著泡沫細(xì)胞的不斷聚集，在內(nèi)膜下形成黃色的、平坦或稍微隆起的脂質(zhì)條紋，這是動(dòng)脈粥樣硬化的早期病變。脂質(zhì)條紋中的泡沫細(xì)胞除了來(lái)源于單核-巨噬細(xì)胞外，還可以由血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）轉(zhuǎn)化而來(lái)。VSMCs在受到生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的刺激后，會(huì)從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停w移到內(nèi)膜下并攝取ox-LDL，也形成泡沫細(xì)胞。脂質(zhì)條紋通常在兒童時(shí)期就可以出現(xiàn)，并且可以長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，部分也可能進(jìn)一步發(fā)展為更嚴(yán)重的病變。纖維斑塊形成階段：隨著病變的進(jìn)展，脂質(zhì)條紋中的泡沫細(xì)胞會(huì)釋放多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等，這些因子會(huì)刺激血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）從中膜向內(nèi)膜遷移、增殖，并合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖等。VSMCs逐漸在脂質(zhì)條紋表面形成一層纖維帽，將脂質(zhì)核心與血液隔開(kāi)，從而形成纖維斑塊。纖維斑塊呈灰白色，質(zhì)地較硬，突出于血管內(nèi)膜表面，可導(dǎo)致血管管腔不同程度的狹窄。此時(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)入了相對(duì)穩(wěn)定的階段，但仍存在進(jìn)一步發(fā)展和惡化的可能。粥樣斑塊形成階段：在纖維斑塊的基礎(chǔ)上，由于脂質(zhì)不斷積累、細(xì)胞外基質(zhì)降解以及炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在，纖維帽下的脂質(zhì)核心逐漸增大，纖維帽逐漸變薄。脂質(zhì)核心中的壞死物質(zhì)、膽固醇結(jié)晶、鈣鹽沉積等增多，使得斑塊的質(zhì)地變得松軟，形成典型的粥樣斑塊。粥樣斑塊的表面為一層纖維帽，深部為黃色或黃白色質(zhì)軟的粥樣物質(zhì)。此時(shí)，動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)一步加重，血管壁的彈性明顯下降，管腔狹窄更加嚴(yán)重，可引起相應(yīng)器官的缺血癥狀。復(fù)雜斑塊與斑塊破裂階段：粥樣斑塊在多種因素（如血流動(dòng)力學(xué)變化、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)增加等）的作用下，變得不穩(wěn)定，形成復(fù)雜斑塊。復(fù)雜斑塊的纖維帽變薄、破裂，暴露其內(nèi)部的促凝物質(zhì)，如組織因子等，可導(dǎo)致血小板聚集、血栓形成。血栓可進(jìn)一步阻塞血管，引發(fā)急性心血管事件，如心肌梗死、腦卒中等。斑塊破裂還可導(dǎo)致斑塊內(nèi)出血，使斑塊體積迅速增大，進(jìn)一步加重血管狹窄。此外，部分血栓可能會(huì)脫落，隨血流運(yùn)行到遠(yuǎn)端血管，引起栓塞。在動(dòng)脈粥樣硬化的晚期，病變部位還可能發(fā)生鈣化，進(jìn)一步降低血管壁的彈性，增加心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。2.3.2斑塊脆弱性的定義、評(píng)估指標(biāo)及臨床意義動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脆弱性，也稱為易損性，是指斑塊易于發(fā)生破裂、侵蝕或血栓形成，從而引發(fā)急性心血管事件的特性。脆弱性斑塊通常具有以下特點(diǎn)：較大的脂質(zhì)核心（占斑塊體積的40%以上）、較薄的纖維帽（厚度小于65μm）、大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（尤其是巨噬細(xì)胞）、豐富的新生血管以及較少的平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)。這些特征使得斑塊的力學(xué)穩(wěn)定性降低，對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的變化和外部刺激更加敏感，容易發(fā)生破裂和血栓形成。臨床上，評(píng)估斑塊脆弱性的指標(biāo)主要包括以下幾個(gè)方面：影像學(xué)指標(biāo)：血管內(nèi)超聲（IVUS）：能夠精確測(cè)量血管的管腔、截面積，發(fā)現(xiàn)管腔向心性、偏心性或橢圓形狹窄，分辨斑塊的大小、分布及斑塊處血管的重構(gòu)情況，并能了解斑塊內(nèi)膜下的解剖形態(tài)，辨別脂質(zhì)斑塊、纖維化斑塊、鈣化斑塊及混合性斑塊。通過(guò)IVUS可以測(cè)量纖維帽厚度、脂質(zhì)核心大小等參數(shù)，評(píng)估斑塊的穩(wěn)定性。研究表明，纖維帽厚度小于65μm的斑塊更容易發(fā)生破裂。IVUS還可以檢測(cè)斑塊內(nèi)的新生血管，新生血管的存在與斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)，因?yàn)樾律艿墓鼙诒?、通透性高，容易破裂出血，?dǎo)致斑塊內(nèi)出血和血栓形成。光學(xué)相干斷層掃描（OCT）：具有極高的分辨率（可達(dá)10-20μm），能夠清晰地顯示血管內(nèi)膜、中膜和斑塊的微觀結(jié)構(gòu)，如纖維帽厚度、脂質(zhì)核心、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等。OCT可以準(zhǔn)確地識(shí)別易損斑塊的特征，如薄纖維帽粥樣硬化斑塊（TCFA），對(duì)于預(yù)測(cè)急性心血管事件具有重要價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，OCT檢測(cè)出的TCFA與急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)生密切相關(guān)。磁共振成像（MRI）：可檢測(cè)斑塊的鈣化、脂質(zhì)核、纖維組織，但對(duì)血栓的敏感性較低。臨床可同時(shí)采用T1、T2、質(zhì)子密度加權(quán)和時(shí)間飛躍（TOF）等模式觀察頸部血管分叉處。MRI結(jié)合有限元分析技術(shù)可用于頸動(dòng)脈斑塊表面切應(yīng)力的分析，評(píng)估斑塊的穩(wěn)定性。MRI還可以檢測(cè)斑塊內(nèi)出血（IPH），IPH是斑塊不穩(wěn)定的重要標(biāo)志之一，它會(huì)導(dǎo)致斑塊體積迅速增大，纖維帽受力不均，增加斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)。正電子發(fā)射斷層掃描（PET）：可以檢測(cè)斑塊內(nèi)的炎癥活動(dòng)，通過(guò)標(biāo)記炎癥細(xì)胞表面的特定受體，如巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體等，來(lái)顯示斑塊內(nèi)炎癥細(xì)胞的分布和活性。PET-CT或PET-MRI融合技術(shù)能夠?qū)⒐δ苄畔⑴c解剖結(jié)構(gòu)信息相結(jié)合，更全面地評(píng)估斑塊的脆弱性。研究表明，斑塊內(nèi)炎癥活性高的患者發(fā)生急性心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。血清學(xué)指標(biāo)：C反應(yīng)蛋白（CRP）：是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在炎癥反應(yīng)中顯著升高。CRP可以反映全身炎癥狀態(tài)，與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)。高水平的CRP提示斑塊處于不穩(wěn)定狀態(tài)，炎癥反應(yīng)活躍，容易發(fā)生破裂。研究發(fā)現(xiàn)，CRP水平升高的患者發(fā)生急性心肌梗死、腦卒中等心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。髓過(guò)氧化物酶（MPO）：主要由活化的中性粒細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞釋放，參與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。MPO可以氧化修飾LDL，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成，還可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，削弱纖維帽的強(qiáng)度，從而增加斑塊的脆弱性。血清MPO水平升高與急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)生密切相關(guān)，可作為評(píng)估斑塊脆弱性的重要指標(biāo)之一。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）：是一組鋅離子依賴的蛋白水解酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白等。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，MMPs的表達(dá)和活性增加，可導(dǎo)致纖維帽變薄、破裂，增加斑塊的脆弱性。研究表明，MMP-2、MMP-9等在不穩(wěn)定斑塊中的表達(dá)明顯高于穩(wěn)定斑塊，其血清水平與急性心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。評(píng)估斑塊脆弱性具有重要的臨床意義。急性心血管事件（如心肌梗死、腦卒中等）往往是由于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂和血栓形成所導(dǎo)致，而這些事件具有發(fā)病急、病情重、死亡率高的特點(diǎn)。通過(guò)評(píng)估斑塊脆弱性，能夠在急性心血管事件發(fā)生前識(shí)別出高風(fēng)險(xiǎn)患者，采取積極有效的干預(yù)措施，如強(qiáng)化降脂、抗血小板治療、控制血壓血糖等，以穩(wěn)定斑塊、降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于已發(fā)生急性心血管事件的患者，評(píng)估斑塊脆弱性有助于判斷病情的嚴(yán)重程度和預(yù)后，指導(dǎo)后續(xù)的治療方案選擇。精準(zhǔn)評(píng)估斑塊脆弱性對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的防治具有重要的指導(dǎo)意義，能夠提高患者的生存率和生活質(zhì)量。三、小檗堿激活巨噬細(xì)胞自噬的作用機(jī)制3.1小檗堿對(duì)自噬相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控3.1.1AMPK/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞的自噬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，AMPK/mTOR信號(hào)通路扮演著關(guān)鍵角色，而小檗堿對(duì)這一通路的調(diào)節(jié)作用備受關(guān)注。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)發(fā)生變化時(shí)，AMPK作為一種重要的能量感受器，會(huì)被激活。正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ATP含量豐富，AMPK處于相對(duì)抑制狀態(tài)。然而，當(dāng)細(xì)胞面臨能量匱乏，如在營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺氧或氧化應(yīng)激等條件下，細(xì)胞內(nèi)ATP迅速分解，AMP/ATP比值升高，此時(shí)AMPK被激活。激活后的AMPK會(huì)發(fā)生磷酸化修飾，從而獲得活性。小檗堿能夠通過(guò)多種途徑促進(jìn)AMPK的激活。在氧化應(yīng)激模型中，小檗堿可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)AMPK的磷酸化水平，使其活性增強(qiáng)。這可能是由于小檗堿能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的能量代謝平衡，減少ATP的消耗，或者促進(jìn)ATP的生成，從而改變細(xì)胞內(nèi)的AMP/ATP比值，激活A(yù)MPK。有研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以通過(guò)抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I的活性，減少ATP的合成，同時(shí)激活A(yù)MPK，啟動(dòng)細(xì)胞的能量補(bǔ)償機(jī)制，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)能量匱乏的適應(yīng)能力。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為自噬的負(fù)調(diào)控因子，在自噬過(guò)程中起著關(guān)鍵的抑制作用。mTOR主要存在于兩種不同的復(fù)合物中，即mTORC1和mTORC2，其中mTORC1對(duì)自噬的調(diào)控作用更為關(guān)鍵。在正常情況下，mTORC1處于激活狀態(tài)，它可以通過(guò)磷酸化下游的自噬相關(guān)蛋白，如ULK1、Atg13等，抑制自噬體的形成，從而阻礙自噬的啟動(dòng)。小檗堿能夠顯著抑制mTOR的磷酸化，從而抑制mTORC1的活性。研究表明，小檗堿可以通過(guò)激活A(yù)MPK，間接抑制mTOR的活性。激活的AMPK可以磷酸化TSC2（TuberousSclerosisComplex2），使其活性增強(qiáng)。TSC2是一種GTP酶激活蛋白，它可以與TSC1形成復(fù)合物，抑制Rheb（Ras-homologenrichedinbrain）的活性。Rheb是一種小GTP酶，它可以激活mTORC1。當(dāng)TSC2被激活后，Rheb的活性受到抑制，從而導(dǎo)致mTORC1的活性降低，解除對(duì)自噬的抑制作用，促進(jìn)自噬體的形成。在高脂誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞模型中，小檗堿能夠通過(guò)激活A(yù)MPK，使TSC2磷酸化水平升高，進(jìn)而抑制Rheb的活性，降低mTOR的磷酸化水平，最終促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬的發(fā)生。小檗堿還可能直接作用于mTOR，影響其磷酸化狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以與mTOR的特定結(jié)構(gòu)域結(jié)合，干擾mTOR與底物的相互作用，抑制mTOR的磷酸化，從而促進(jìn)自噬的啟動(dòng)。小檗堿通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK的激活和mTOR的磷酸化，實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬體形成的調(diào)控。激活的AMPK一方面通過(guò)抑制mTOR的活性間接促進(jìn)自噬，另一方面還可以直接磷酸化ULK1等自噬相關(guān)蛋白，促進(jìn)自噬體前體的組裝。抑制mTOR的磷酸化則解除了mTOR對(duì)自噬的抑制作用，使得自噬相關(guān)蛋白能夠正常發(fā)揮作用，促進(jìn)自噬體的形成和成熟。在小檗堿處理的巨噬細(xì)胞中，通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AMPK的磷酸化水平升高，mTOR的磷酸化水平降低，同時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)水平顯著升高，這表明自噬體的形成增加，自噬活性增強(qiáng)。小檗堿對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的調(diào)控在激活巨噬細(xì)胞自噬過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，為深入理解小檗堿的藥理作用機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。3.1.2其他可能涉及的信號(hào)通路除了AMPK/mTOR信號(hào)通路外，PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用，并且小檗堿對(duì)該信號(hào)通路的影響可能與巨噬細(xì)胞自噬的激活密切相關(guān)。PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，它可以催化磷脂酰肌醇（PI）的磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為一種重要的第二信使，能夠招募并激活下游的Akt蛋白。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在自噬調(diào)節(jié)方面，激活的Akt可以通過(guò)多種途徑抑制自噬的發(fā)生。Akt可以磷酸化并激活mTORC1，從而抑制自噬體的形成；Akt還可以磷酸化并抑制自噬相關(guān)蛋白，如Beclin1等，干擾自噬起始復(fù)合物的組裝，進(jìn)而抑制自噬的啟動(dòng)。小檗堿能夠調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，從而影響巨噬細(xì)胞自噬。研究表明，小檗堿可以抑制PI3K的活性，減少PIP3的生成，進(jìn)而抑制Akt的激活。在脂多糖（LPS）刺激的巨噬細(xì)胞炎癥模型中，小檗堿可以顯著降低PI3K的活性，抑制Akt的磷酸化水平，同時(shí)促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的自噬活性。這表明小檗堿通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，解除了對(duì)自噬的抑制作用，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬的發(fā)生。小檗堿還可能通過(guò)其他機(jī)制間接調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路。小檗堿具有抗氧化和抗炎作用，它可以減輕細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，而氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)與PI3K/Akt信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。在氧化應(yīng)激條件下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），ROS可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路，導(dǎo)致Akt的過(guò)度激活，進(jìn)而抑制自噬。小檗堿可以通過(guò)清除ROS，降低氧化應(yīng)激水平，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生。JNK信號(hào)通路也與細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)有關(guān)，小檗堿可能通過(guò)影響JNK信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬。JNK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員之一，它可以被多種細(xì)胞外刺激激活，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激信號(hào)等。激活的JNK可以磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和自噬等過(guò)程。在自噬調(diào)節(jié)方面，JNK信號(hào)通路的作用較為復(fù)雜，它既可以促進(jìn)自噬，也可以抑制自噬，具體取決于細(xì)胞類型、刺激因素和實(shí)驗(yàn)條件等。在某些情況下，激活的JNK可以磷酸化Beclin1，增強(qiáng)其與Vps34的相互作用，促進(jìn)自噬起始復(fù)合物的形成，從而促進(jìn)自噬的發(fā)生；而在另一些情況下，JNK可以通過(guò)磷酸化Bcl-2等抗凋亡蛋白，抑制自噬的啟動(dòng)。小檗堿對(duì)JNK信號(hào)通路的影響可能因?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ秃蜅l件的不同而有所差異。有研究表明，在缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞模型中，小檗堿可以抑制JNK的磷酸化，減少其活性，從而減輕細(xì)胞的凋亡和自噬水平。然而，在某些炎癥模型中，小檗堿可能激活JNK信號(hào)通路，促進(jìn)自噬的發(fā)生。在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型中，小檗堿可以增加JNK的磷酸化水平，激活JNK信號(hào)通路，同時(shí)促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的自噬活性。這可能是因?yàn)樾￠迚A通過(guò)激活JNK信號(hào)通路，調(diào)節(jié)了相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)了巨噬細(xì)胞自噬的發(fā)生，以應(yīng)對(duì)炎癥刺激。小檗堿對(duì)PI3K/Akt和JNK等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用在其激活巨噬細(xì)胞自噬的過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。這些信號(hào)通路之間相互交織、相互影響，形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。深入研究小檗堿對(duì)這些信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，有助于全面揭示小檗堿激活巨噬細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用小檗堿治療相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。3.2小檗堿對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響3.2.1LC3、P62等蛋白LC3和P62作為自噬過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，在小檗堿調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬中發(fā)揮著重要作用。LC3是微管相關(guān)蛋白1輕鏈3的簡(jiǎn)稱，在自噬過(guò)程中，LC3-I會(huì)被加工修飾，與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，形成LC3-II，并定位于自噬體膜上。LC3-II/LC3-I的表達(dá)比例常被用作衡量自噬活性的重要指標(biāo)，該比例升高表明自噬體的形成增加，自噬活性增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞中LC3-II/LC3-I表達(dá)比例的升高。在體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中，給予不同濃度的小檗堿處理后，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著小檗堿濃度的增加，LC3-II的表達(dá)水平逐漸升高，而LC3-I的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，從而導(dǎo)致LC3-II/LC3-I的表達(dá)比例顯著升高。這表明小檗堿能夠促進(jìn)自噬體的形成，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的自噬活性。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠給予小檗堿灌胃處理后，取其主動(dòng)脈組織進(jìn)行檢測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)LC3-II/LC3-I的表達(dá)比例明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)了小檗堿在體內(nèi)也能促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬體的形成。P62，又稱SQSTM1（sequestosome1），是一種多功能的銜接蛋白，在自噬過(guò)程中扮演著重要角色。P62能夠特異性地結(jié)合泛素化的蛋白質(zhì)和LC3，將需要降解的物質(zhì)招募到自噬體中，從而促進(jìn)自噬體與溶酶體的融合，實(shí)現(xiàn)對(duì)這些物質(zhì)的降解。同時(shí)，P62自身也會(huì)被自噬溶酶體降解，因此其表達(dá)水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)自噬活性增強(qiáng)時(shí)，P62被降解的速度加快，其表達(dá)水平降低；反之，當(dāng)自噬活性受到抑制時(shí)，P62的降解減少，表達(dá)水平升高。小檗堿能夠有效降低巨噬細(xì)胞中P62的表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中，用小檗堿處理巨噬細(xì)胞后，通過(guò)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，P62的蛋白表達(dá)水平顯著下降。這說(shuō)明小檗堿能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞自噬，使得P62被自噬溶酶體有效降解，從而降低其表達(dá)水平。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，小檗堿處理后的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠主動(dòng)脈組織中，P62的表達(dá)水平也明顯降低，這進(jìn)一步驗(yàn)證了小檗堿在體內(nèi)能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞自噬，促進(jìn)P62的降解。小檗堿使LC3-II/LC3-I表達(dá)比例升高、P62表達(dá)降低，這兩個(gè)現(xiàn)象相互關(guān)聯(lián)，共同促進(jìn)了自噬流的正常進(jìn)行。LC3-II/LC3-I表達(dá)比例的升高表明自噬體的形成增加，而P62表達(dá)的降低則意味著自噬體與溶酶體的融合及降解過(guò)程更加順暢，自噬流得以增強(qiáng)。自噬流的正常進(jìn)行對(duì)于維持巨噬細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要，它可以及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)，如受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和病原體等，從而減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬流受阻會(huì)導(dǎo)致有害物質(zhì)積累，引發(fā)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加重斑塊的脆弱性。而小檗堿通過(guò)促進(jìn)自噬流，能夠有效改善巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)，減少炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有重要意義。3.2.2Beclin1等關(guān)鍵蛋白Beclin1是自噬起始階段的關(guān)鍵蛋白，它與酵母自噬基因Atg6/Vps30同源，在自噬起始過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Beclin1與Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K-Ⅲ）、酵母同源Vps34、Vps15以及ATG14等相結(jié)合，形成Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物能夠催化磷脂酰肌醇（PI）磷酸化，生成磷脂酰肌醇3-磷酸鹽（PI3P），PI3P作為一種重要的信號(hào)分子，能夠招募其他自噬相關(guān)蛋白到自噬體前體膜上，從而啟動(dòng)自噬體的形成。因此，Beclin1的表達(dá)水平和功能狀態(tài)直接影響著自噬的起始和進(jìn)程。研究表明，小檗堿能夠顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度的小檗堿作用于巨噬細(xì)胞后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Beclin1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均隨著小檗堿濃度的增加而升高。這表明小檗堿能夠促進(jìn)Beclin1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而增加Beclin1蛋白的表達(dá)量。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠給予小檗堿灌胃處理后，取其主動(dòng)脈組織中的巨噬細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，同樣發(fā)現(xiàn)Beclin1的表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)了小檗堿在體內(nèi)也能上調(diào)巨噬細(xì)胞中Beclin1的表達(dá)。小檗堿上調(diào)Beclin1表達(dá)在自噬體起始階段具有重要作用。增加的Beclin1能夠促進(jìn)Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物的形成，從而提高PI3P的生成量。更多的PI3P可以招募更多的自噬相關(guān)蛋白到自噬體前體膜上，加速自噬體前體的組裝和延伸，促進(jìn)自噬體的形成。在高脂誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化模型中，巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬起始過(guò)程受到抑制，Beclin1表達(dá)水平降低，導(dǎo)致自噬體形成減少，自噬活性下降。而小檗堿通過(guò)上調(diào)Beclin1表達(dá)，能夠有效恢復(fù)自噬起始過(guò)程，促進(jìn)自噬體的形成，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的自噬活性。這有助于巨噬細(xì)胞及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)積累和炎癥物質(zhì)，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性產(chǎn)生積極影響。除了Beclin1，還有其他一些自噬相關(guān)蛋白在小檗堿激活巨噬細(xì)胞自噬的過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。Atg5、Atg7等蛋白參與了自噬體形成過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)。Atg5與Atg12通過(guò)共價(jià)連接形成Atg5-Atg12復(fù)合物，該復(fù)合物再與Atg16L1結(jié)合，形成Atg5-Atg12-Atg16L1復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物在自噬體前體膜的延伸和閉合過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Atg7則是一種泛素樣結(jié)合酶，它參與了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化過(guò)程，對(duì)自噬體膜的形成至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿處理巨噬細(xì)胞后，Atg5、Atg7等蛋白的表達(dá)水平也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，這些變化進(jìn)一步促進(jìn)了自噬體的形成和自噬活性的增強(qiáng)。這些自噬相關(guān)蛋白之間相互協(xié)作，共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，小檗堿通過(guò)調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)和功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的激活，從而發(fā)揮其改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性的作用。四、巨噬細(xì)胞自噬改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性的機(jī)制4.1對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)4.1.1膽固醇流出巨噬細(xì)胞自噬增強(qiáng)能夠有效促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，減少脂質(zhì)積累，這一過(guò)程在改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。自噬與膽固醇流出的關(guān)系緊密，主要通過(guò)一系列復(fù)雜的分子機(jī)制實(shí)現(xiàn)。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)膽固醇的平衡受到嚴(yán)格調(diào)控，自噬作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制，參與了膽固醇的代謝過(guò)程。當(dāng)巨噬細(xì)胞攝取大量膽固醇后，會(huì)形成富含膽固醇酯的脂滴，這些脂滴的過(guò)度積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。而自噬的激活可以及時(shí)清除這些多余的脂滴，維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的正常水平。ABCA1（ATP-bindingcassettetransporterA1）和ABCG1（ATP-bindingcassettetransporterG1）是介導(dǎo)膽固醇流出的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，自噬對(duì)它們的表達(dá)和功能有著重要影響。研究表明，自噬激活后，細(xì)胞內(nèi)的一些信號(hào)通路被調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)ABCA1和ABCG1的表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中，用自噬誘導(dǎo)劑處理巨噬細(xì)胞后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ABCA1和ABCG1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高。這是因?yàn)樽允煽梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，如肝臟X受體（LXR）等，來(lái)促進(jìn)ABCA1和ABCG1基因的轉(zhuǎn)錄。LXR是一種核受體，它可以與膽固醇代謝相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。自噬激活后，細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的變化會(huì)影響LXR的活性，使其與ABCA1和ABCG1基因的啟動(dòng)子結(jié)合增強(qiáng)，從而促進(jìn)這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。自噬還可以通過(guò)調(diào)節(jié)ABCA1和ABCG1的穩(wěn)定性和功能來(lái)促進(jìn)膽固醇流出。ABCA1和ABCG1在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性受到多種因素的影響，包括泛素化修飾等。自噬可以通過(guò)降解一些對(duì)ABCA1和ABCG1具有負(fù)調(diào)控作用的蛋白，減少ABCA1和ABCG1的泛素化修飾，從而提高它們?cè)诩?xì)胞表面的表達(dá)水平，增強(qiáng)膽固醇流出能力。自噬還可以調(diào)節(jié)ABCA1和ABCG1與其他蛋白的相互作用，影響它們的功能。ABCA1和ABCG1在介導(dǎo)膽固醇流出時(shí)，需要與載脂蛋白A-I（ApoA-I）等結(jié)合形成復(fù)合物。自噬可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)ABCA1、ABCG1與ApoA-I的結(jié)合，提高膽固醇流出效率。自噬還可以通過(guò)其他途徑促進(jìn)膽固醇流出。自噬可以降解細(xì)胞內(nèi)的一些膽固醇酯水解酶，如中性膽固醇酯水解酶（NCEH）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的水解平衡，使更多的膽固醇以游離形式存在，便于流出細(xì)胞。自噬還可以影響細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑，如脂肪酸的β-氧化等，間接調(diào)節(jié)膽固醇的代謝和流出。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，巨噬細(xì)胞自噬增強(qiáng)通過(guò)促進(jìn)膽固醇流出，減少脂質(zhì)積累，從而降低斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心的大小，增加纖維帽的厚度，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性，降低斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)。4.1.2脂質(zhì)過(guò)氧化抑制脂質(zhì)過(guò)氧化是指多不飽和脂肪酸在自由基的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生一系列氧化產(chǎn)物，如丙二醛（MDA）、4-羥基壬烯醛（4-HNE）等。在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)會(huì)顯著增強(qiáng)，這主要是由于斑塊內(nèi)存在大量的炎癥細(xì)胞和氧化應(yīng)激環(huán)境。巨噬細(xì)胞在吞噬ox-LDL等物質(zhì)后，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子（O2-）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥自由基（?OH）等，這些ROS能夠引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜和脂蛋白中的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化損傷。自噬能夠通過(guò)多種機(jī)制抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，從而降低氧化應(yīng)激對(duì)斑塊穩(wěn)定性的損害。自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)的受損線粒體，減少ROS的產(chǎn)生。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是ROS的主要來(lái)源之一。在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，由于炎癥和氧化應(yīng)激等因素的影響，線粒體功能受損，產(chǎn)生大量的ROS，進(jìn)一步加劇脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激。自噬可以識(shí)別并包裹受損的線粒體，形成自噬體，然后與溶酶體融合，將線粒體降解，從而減少ROS的產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。研究發(fā)現(xiàn)，在自噬缺陷的巨噬細(xì)胞中，線粒體損傷明顯加重，ROS產(chǎn)生增多，脂質(zhì)過(guò)氧化水平顯著升高；而激活自噬后，線粒體損傷得到改善，ROS產(chǎn)生減少，脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低。自噬還可以降解細(xì)胞內(nèi)的氧化產(chǎn)物，減少其對(duì)細(xì)胞的損傷。自噬體能夠包裹脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物，如MDA、4-HNE等，將其運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中進(jìn)行降解，從而降低這些氧化產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的濃度，減輕它們對(duì)細(xì)胞的毒性作用。這些氧化產(chǎn)物具有很強(qiáng)的反應(yīng)活性，能夠與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常和凋亡。自噬通過(guò)及時(shí)清除這些氧化產(chǎn)物，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，維持細(xì)胞的正常功能。自噬還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。自噬可以促進(jìn)抗氧化酶基因的表達(dá)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）等。這些抗氧化酶能夠催化ROS的分解，將其轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，從而減少脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生。研究表明，在自噬激活的巨噬細(xì)胞中，SOD、CAT和GPx等抗氧化酶的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力增強(qiáng)，脂質(zhì)過(guò)氧化水平降低。自噬還可以調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，通過(guò)降解一些對(duì)抗氧化酶具有抑制作用的蛋白，提高抗氧化酶的活性，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)導(dǎo)致斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)加劇、細(xì)胞凋亡增加以及纖維帽的降解，從而增加斑塊的脆弱性。而自噬通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，能夠有效減輕氧化應(yīng)激對(duì)斑塊的損害，減少炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定纖維帽，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性，降低急性心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。4.2對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制4.2.1炎癥因子表達(dá)調(diào)控自噬在抑制NLRP3炎性體活化及IL-1β等炎癥因子釋放方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其機(jī)制涉及多個(gè)層面。NLRP3炎性體是一種多蛋白復(fù)合物，主要由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1（caspase-1）組成。在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到多種刺激，如ox-LDL、ROS、尿酸結(jié)晶等時(shí)，NLRP3炎性體被激活。激活后的NLRP3炎性體促使caspase-1活化，活化的caspase-1能夠?qū)o(wú)活性的前體形式的IL-1β和IL-18切割成具有生物活性的成熟形式，進(jìn)而釋放到細(xì)胞外，引發(fā)炎癥反應(yīng)。過(guò)多的IL-1β和IL-18會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的募集和活化，加重動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)斑塊的進(jìn)展和脆弱性增加。自噬可以通過(guò)多種機(jī)制抑制NLRP3炎性體的活化。自噬能夠清除細(xì)胞內(nèi)的損傷線粒體，從而減少ROS的產(chǎn)生。線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源之一，在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，損傷的線粒體產(chǎn)生大量的ROS，ROS可以作為信號(hào)分子激活NLRP3炎性體。自噬可以識(shí)別并包裹損傷的線粒體，形成自噬體，然后與溶酶體融合，將線粒體降解，從而減少ROS的產(chǎn)生，抑制NLRP3炎性體的活化。研究表明，在自噬缺陷的巨噬細(xì)胞中，線粒體損傷加重，ROS產(chǎn)生增多，NLRP3炎性體的活化顯著增強(qiáng)，IL-1β和IL-18的釋放增加；而激活自噬后，線粒體損傷得到改善，ROS產(chǎn)生減少，NLRP3炎性體的活化受到抑制，IL-1β和IL-18的釋放減少。自噬還可以直接吞噬和降解NLRP3炎性體的主要成分，如泛素化的NLRP3和ASC等，從而抑制NLRP3炎性體的組裝和活化。自噬體能夠識(shí)別并包裹泛素化的NLRP3和ASC，將其運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中進(jìn)行降解，阻止NLRP3炎性體的形成，減少I(mǎi)L-1β和IL-18的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，在自噬激活的巨噬細(xì)胞中，NLRP3和ASC的蛋白水平明顯降低，NLRP3炎性體的活化受到抑制，IL-1β和IL-18的釋放減少。自噬還可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路來(lái)抑制NLRP3炎性體的活化。自噬可以抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)節(jié)NLRP3、IL-1β等炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，多種刺激可以激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)NLRP3炎性體的活化和炎癥因子的表達(dá)。自噬可以通過(guò)降解NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，從而減少NLRP3和IL-1β等炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，抑制NLRP3炎性體的活化和炎癥因子的釋放。研究表明，在自噬激活的巨噬細(xì)胞中，NF-κB的核轉(zhuǎn)位受到抑制，NLRP3和IL-1β等炎癥相關(guān)基因的表達(dá)減少，NLRP3炎性體的活化受到抑制，IL-1β的釋放減少。4.2.2炎癥細(xì)胞募集減少自噬減少炎癥細(xì)胞向斑塊部位募集，從而減輕炎癥反應(yīng)，這一過(guò)程對(duì)改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性具有重要意義。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，炎癥細(xì)胞的募集是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)血管內(nèi)皮受到損傷后，會(huì)釋放多種趨化因子和黏附分子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等。這些趨化因子和黏附分子能夠吸引血液中的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向斑塊部位遷移和聚集。炎癥細(xì)胞在斑塊部位的聚集會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇，促進(jìn)斑塊的進(jìn)展和脆弱性增加。自噬可以通過(guò)多種機(jī)制減少炎癥細(xì)胞向斑塊部位的募集。自噬可以調(diào)節(jié)趨化因子和黏附分子的表達(dá)。自噬能夠抑制巨噬細(xì)胞中MCP-1、VCAM-1和ICAM-1等趨化因子和黏附分子的表達(dá)。在動(dòng)脈粥樣硬化模型中，激活巨噬細(xì)胞自噬后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MCP-1、VCAM-1和ICAM-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。這是因?yàn)樽允煽梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，抑制NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而減少趨化因子和黏附分子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。研究表明，自噬可以通過(guò)降解NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性，從而減少M(fèi)CP-1、VCAM-1和ICAM-1等趨化因子和黏附分子的表達(dá)，降低炎癥細(xì)胞的募集。自噬還可以影響炎癥細(xì)胞的趨化和黏附能力。自噬可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞表面的受體和信號(hào)通路，影響其對(duì)趨化因子和黏附分子的響應(yīng)。自噬可以通過(guò)降解炎癥細(xì)胞表面的某些受體，減少炎癥細(xì)胞對(duì)趨化因子的識(shí)別和結(jié)合，從而降低炎癥細(xì)胞的趨化能力。自噬還可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，影響其細(xì)胞骨架的重組和黏附分子的表達(dá)，從而降低炎癥細(xì)胞的黏附能力。研究發(fā)現(xiàn)，在自噬激活的巨噬細(xì)胞中，炎癥細(xì)胞對(duì)MCP-1的趨化能力明顯降低，對(duì)VCAM-1和ICAM-1的黏附能力也顯著下降。自噬還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑來(lái)影響炎癥細(xì)胞的募集。在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，炎癥細(xì)胞的募集需要穿過(guò)血管內(nèi)皮和細(xì)胞外基質(zhì)。自噬可以調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等酶的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑。自噬可以抑制MMPs的表達(dá)和活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而阻礙炎癥細(xì)胞的遷移和募集。研究表明，在自噬激活的巨噬細(xì)胞中，MMP-2、MMP-9等MMPs的表達(dá)和活性明顯降低，細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少，炎癥細(xì)胞的遷移和募集受到抑制。自噬通過(guò)減少炎癥細(xì)胞向斑塊部位的募集，有效減輕了斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)，降低了斑塊的脆弱性，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有重要作用。4.3對(duì)斑塊內(nèi)細(xì)胞功能的影響4.3.1巨噬細(xì)胞存活與功能維持巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的存活和功能維持對(duì)于斑塊的穩(wěn)定性至關(guān)重要，而自噬在這一過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞面臨著多種應(yīng)激因素，如氧化應(yīng)激、炎癥刺激、脂質(zhì)過(guò)載等，這些因素會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的損傷和功能障礙，甚至引發(fā)細(xì)胞死亡。而自噬作為細(xì)胞內(nèi)的一種重要自我保護(hù)機(jī)制，能夠通過(guò)清除受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)聚集體和病原體等，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的存活和正常功能的發(fā)揮。自噬可以清除巨噬細(xì)胞內(nèi)受損的線粒體，減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生，從而減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是ROS的主要來(lái)源之一。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)，由于炎癥和氧化應(yīng)激等因素的影響，巨噬細(xì)胞內(nèi)的線粒體容易受損，導(dǎo)致ROS的大量產(chǎn)生。過(guò)多的ROS會(huì)氧化細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和凋亡。自噬可以識(shí)別并包裹受損的線粒體，形成自噬體，然后與溶酶體融合，將線粒體降解，從而減少ROS的產(chǎn)生，保護(hù)巨噬細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。研究表明，在自噬缺陷的巨噬細(xì)胞中，線粒體損傷明顯加重，ROS產(chǎn)生增多，細(xì)胞凋亡率顯著升高；而激活自噬后，線粒體損傷得到改善，ROS產(chǎn)生減少，細(xì)胞凋亡率降低，表明自噬能夠通過(guò)保護(hù)線粒體功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的存活。自噬還可以降解巨噬細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)，由于炎癥和氧化應(yīng)激等因素的影響，巨噬細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成和折疊過(guò)程容易受到干擾，導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)增多。這些異常蛋白質(zhì)會(huì)形成聚集體，對(duì)細(xì)胞造成毒性作用，影響細(xì)胞的正常功能。自噬可以通過(guò)識(shí)別并包裹這些錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，將其運(yùn)輸?shù)饺苊阁w中進(jìn)行降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能。研究發(fā)現(xiàn)，在自噬缺陷的巨噬細(xì)胞中，錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)明顯增多，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙；而激活自噬后，錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)被有效清除，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)得到恢復(fù)，巨噬細(xì)胞的功能得以維持。自噬還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫功能，增強(qiáng)其對(duì)病原體的清除能力。巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要細(xì)胞，具有吞噬和清除病原體的功能。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)，巨噬細(xì)胞容易受到病原體的感染，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇。自噬可以通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫功能，增強(qiáng)其對(duì)病原體的識(shí)別、吞噬和降解能力，從而有效清除病原體，減輕炎癥反應(yīng)。自噬可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞表面模式識(shí)別受體（PRRs）的表達(dá)和活化，增強(qiáng)其對(duì)病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）的識(shí)別能力；自噬還可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)溶酶體的成熟和功能增強(qiáng)，提高其對(duì)病原體的降解能力。研究表明，在自噬缺陷的巨噬細(xì)胞中，對(duì)病原體的清除能力明顯下降，炎癥反應(yīng)加?。欢せ钭允珊?，巨噬細(xì)胞對(duì)病原體的清除能力增強(qiáng)，炎癥反應(yīng)減輕，表明自噬能夠通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫功能，維持其正常的抗感染能力。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)，巨噬細(xì)胞的死亡會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇和斑塊的不穩(wěn)定。而自噬通過(guò)維持巨噬細(xì)胞的存活和正常功能，能夠減少炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)斑塊的穩(wěn)定性。自噬缺陷會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能障礙和死亡增加，炎癥反應(yīng)加劇，斑塊的脆弱性增加；而激活自噬則可以改善巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)，減少炎癥反應(yīng)，降低斑塊的脆弱性，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治具有重要意義。4.3.2平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞功能調(diào)節(jié)自噬對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)在穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的增殖和遷移異常會(huì)導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，而內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙則會(huì)破壞血管內(nèi)皮的完整性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和脂質(zhì)的沉積，進(jìn)而影響斑塊的穩(wěn)定性。自噬作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持機(jī)制，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)VSMCs和內(nèi)皮細(xì)胞的功能，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性產(chǎn)生積極影響。自噬可以抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，多種因素（如血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等）會(huì)刺激VSMCs的增殖和遷移，導(dǎo)致血管壁增厚和斑塊的形成。自噬可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，抑制VSMCs的增殖和遷移。研究表明，自噬可以通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，抑制mTOR的活性，從而抑制VSMCs的增殖。自噬還可以通過(guò)降解一些與細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)，如細(xì)胞周期蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等，抑制VSMCs的增殖和遷移。在體外實(shí)驗(yàn)中，用自噬誘導(dǎo)劑處理VSMCs后，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VSMCs的增殖和遷移能力明顯降低。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠給予自噬激活劑處理后，通過(guò)免疫組化和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VSMCs的增殖和遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯降低，血管壁增厚和斑塊形成得到改善。自噬對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能也具有重要的調(diào)節(jié)作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管壁的最內(nèi)層細(xì)胞，在維持血管穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。內(nèi)皮細(xì)胞可以分泌多種生物活性物質(zhì)，如一氧化氮（NO）、前列環(huán)素等，這些物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮，抑制血小板的聚集和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。自噬可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的代謝、抗氧化能力和炎癥反應(yīng)等，維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能。自噬可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，增強(qiáng)其抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。自噬還可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放，從而維持血管內(nèi)皮的完整性。在體外實(shí)驗(yàn)中，用自噬誘導(dǎo)劑處理內(nèi)皮細(xì)胞后，通過(guò)檢測(cè)NO的釋放和炎癥因子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞的功能得到改善，NO的釋放增加，炎癥因子的表達(dá)減少。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠給予自噬激活劑處理后，通過(guò)檢測(cè)血管內(nèi)皮的完整性和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮的損傷得到減輕，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)減少，斑塊的穩(wěn)定性增強(qiáng)。自噬還可以通過(guò)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊結(jié)構(gòu)。平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間存在著密切的相互作用，它們通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，相互影響對(duì)方的功能。自噬可以調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)，維持它們之間的正常相互作用。自噬可以抑制平滑肌細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，減少它們對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的刺激，從而維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能。自噬還可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而穩(wěn)定血管壁的結(jié)構(gòu)。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，自噬通過(guò)調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的功能，維持它們之間的正常相互作用，減少血管壁的損傷和炎癥反應(yīng)，從而穩(wěn)定斑塊結(jié)構(gòu)，降低斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)。五、小檗堿激活巨噬細(xì)胞自噬改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脆弱性的實(shí)驗(yàn)研究5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法5.1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用6周齡雄性載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠，購(gòu)自[具體動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，飼養(yǎng)于[動(dòng)物房環(huán)境條件說(shuō)明，如溫度、濕度、光照周期等]的動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由進(jìn)食和飲水。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組、小檗堿高劑量組以及陽(yáng)性對(duì)照組（如阿托伐他汀組），每組[X]只。采用高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠建立動(dòng)脈粥樣硬化模型。對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組給予高脂飼料（包含[高脂飼料具體成分及比例]）喂養(yǎng)，持續(xù)[造模時(shí)間]。造模成功的判斷依據(jù)為小鼠血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平顯著升高，且主動(dòng)脈根部出現(xiàn)明顯的粥樣硬化斑塊。造模開(kāi)始后，小檗堿低、中、高劑量組分別給予小檗堿灌胃，劑量分別為[低劑量數(shù)值]mg/(kg?d)、[中劑量數(shù)值]mg/(kg?d)、[高劑量數(shù)值]mg/(kg?d)；陽(yáng)性對(duì)照組給予阿托伐他汀灌胃，劑量為[阿托伐他汀劑量數(shù)值]mg/(kg?d)；對(duì)照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。每天灌胃1次，持續(xù)[給藥時(shí)間]。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠禁食12h后，用[麻醉方式，如戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉]麻醉，然后通過(guò)[采血方式，如眼球取血或心臟采血]采集血液，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清TC、TG、LDL-C和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。將小鼠處死，迅速取出主動(dòng)脈，用生理鹽水沖洗干凈，一部分主動(dòng)脈用于油紅O染色，觀察主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積和分布情況；另一部分主動(dòng)脈根部進(jìn)行冰凍切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，采用Masson染色檢測(cè)斑塊內(nèi)膠原纖維含量，采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞（CD68標(biāo)記）、平滑肌細(xì)胞（α-SMA標(biāo)記）的含量，計(jì)算斑塊的脆弱性指數(shù)（VI），公式為：VI=巨噬細(xì)胞面積/（平滑肌細(xì)胞面積+膠原纖維面積）。5.1.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)人單核細(xì)胞系Thp1購(gòu)自[細(xì)胞庫(kù)名稱]，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用佛波酯（PMA，100ng/mL）誘導(dǎo)Thp1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)時(shí)間為48h。將分化后的巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組、小檗堿高劑量組。模型組加入氧化低密度脂蛋白（ox-LDL，80mg/L）處理24h，誘導(dǎo)細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，模擬動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程；小檗堿低、中、高劑量組在加入ox-LDL的同時(shí)，分別加入小檗堿，使其終濃度為[低劑量數(shù)值]μM、[中劑量數(shù)值]μM、[高劑量數(shù)值]μM；對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白（如LC3-II/LC3-I、P62、Beclin1）、炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白（如NLRP3、IL-1β、IL-6）以及AMPK/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白（如p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR）的表達(dá)水平。用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的含量。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。利用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬體的形成，通過(guò)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，使細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記的LC3，在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光點(diǎn)的數(shù)量和分布情況，綠色熒光點(diǎn)代表自噬體。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.2.1小檗堿對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)主動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色，直觀地觀察到不同處理組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積和分布情況存在顯著差異。對(duì)照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜表面光滑，幾乎未見(jiàn)明顯的粥樣硬化斑塊；而模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜上可見(jiàn)大量紅色的粥樣硬化斑塊，斑塊面積較大，且分布廣泛，主要集中在主動(dòng)脈根部和弓部等部位。小檗堿各劑量組小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積均明顯小于模型組，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。小檗堿高劑量組的斑塊面積減小最為顯著，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)主動(dòng)脈根部進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)可見(jiàn)大量的脂質(zhì)沉積，形成明顯的脂質(zhì)核心，纖維帽較薄，且炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；而小檗堿處理組小鼠斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心面積減小，纖維帽厚度增加，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。Masson染色結(jié)果顯示，模型組小鼠斑塊內(nèi)膠原纖維含量較少，而小檗堿各劑量組小鼠斑塊內(nèi)膠原纖維含量明顯增加，提示小檗堿能夠促進(jìn)斑塊內(nèi)膠原纖維的合成，增強(qiáng)纖維帽的強(qiáng)度。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞（CD68標(biāo)記）和平滑肌細(xì)胞（α-SMA標(biāo)記）的含量，計(jì)算斑塊的脆弱性指數(shù)（VI）。結(jié)果表明，模型組小鼠斑塊的VI顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明模型組小鼠斑塊的脆弱性增加；而小檗堿各劑量組小鼠斑塊的VI均顯著低于模型組，且小檗堿高劑量組的VI最低，表明小檗堿能夠有效降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脆弱性，且高劑量的效果更為顯著。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)小滴的形成情況，結(jié)果顯示，模型組（ox-LDL處理）巨噬細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量紅色的脂質(zhì)小滴，表明細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累明顯；而小檗堿各劑量組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)小滴數(shù)量明顯減少，說(shuō)明小檗堿能夠抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積累。小檗堿能夠顯著減小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積，降低斑塊內(nèi)脂質(zhì)核心的大小，增加纖維帽厚度和膠原纖維含量，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，降低斑塊的脆弱性指數(shù)，從而有效改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理狀態(tài)。5.2.2小檗堿對(duì)巨噬細(xì)胞自噬和炎性反應(yīng)的影響在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，采用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組（ox-LDL處理）巨噬細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的表達(dá)比例顯著降低，P62的表達(dá)水平顯著升高，Beclin1的表達(dá)水平顯著降低，表明模型組巨噬細(xì)胞自噬活性受到抑制。而小檗堿各劑量組巨噬細(xì)胞中LC3-II/LC3-I的表達(dá)比例顯著升高，P62的表達(dá)水平顯著降低，Beclin1的表達(dá)水平顯著升高，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。小檗堿高劑量組對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響最為明顯，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明小檗堿能夠有效激活巨噬細(xì)胞自噬，促進(jìn)自噬體的形成和自噬流的增強(qiáng)。利用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬體的形成，通過(guò)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，使細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記的LC3，在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光點(diǎn)的數(shù)量和分布情況。結(jié)果顯示，模型組巨噬細(xì)胞中綠色熒光點(diǎn)數(shù)量較少，而小檗堿各劑量組巨噬細(xì)胞中綠色熒光點(diǎn)數(shù)量明顯增多，且分布更為廣泛，進(jìn)一步證實(shí)了小檗堿