小鼠骨髓樹突狀細胞的制備及其對胃癌細胞殺傷作用的機制探究一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，給人類健康帶來了沉重的負擔。據(jù)統(tǒng)計，每年全球新增胃癌病例數(shù)量龐大，且其死亡率在各類癌癥中位居前列。在中國，胃癌同樣是高發(fā)疾病，發(fā)病率和死亡率均不容小覷。大多數(shù)中國患者在確診時已處于中晚期，這使得治療難度顯著增加，患者的5年生存率較低，轉(zhuǎn)移和復發(fā)是導致患者死亡的主要原因。盡管目前胃癌的治療手段包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療等多種方式，但仍難以實現(xiàn)完全治愈，因此，尋找新的、更有效的治療方法迫在眉睫。在腫瘤免疫領(lǐng)域，樹突狀細胞（DCs）作為功能最強的抗原提呈細胞，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。DCs能夠攝取、加工腫瘤抗原，并將其以抗原多肽的形式提呈給T淋巴細胞。同時，DCs高表達CD80、CD86、CD40等共刺激分子，這些分子能夠與T細胞表面的相應受體相互作用，使T細胞被充分激活并增殖為細胞毒性T淋巴細胞（CTL）。CTL具有特異性殺傷腫瘤細胞的能力，能夠直接識別并攻擊腫瘤細胞，在機體的抗腫瘤免疫反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用?？梢哉f，DCs在腫瘤細胞和T淋巴細胞的相互作用中充當著橋梁和樞紐的角色，是啟動和調(diào)控抗腫瘤免疫反應的核心環(huán)節(jié)。然而，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)的DCs存在數(shù)量減少和功能降低的現(xiàn)象。這使得DCs無法有效地誘導初次免疫應答，也難以激活特異性的CTL，從而導致腫瘤免疫逃逸，使得腫瘤細胞能夠逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，得以不斷生長和擴散。因此，如何恢復和增強腫瘤患者體內(nèi)DCs的數(shù)量及功能，成為了腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究重點。小鼠骨髓樹突狀細胞（BMDCs）因其來源豐富、獲取相對容易，且在體外能夠大量擴增和培養(yǎng)，成為了DCs研究中最常用的模型細胞。通過對小鼠BMDCs的深入研究，我們可以更好地了解DCs的生物學特性、功能機制以及其在抗腫瘤免疫中的作用。基于此，本研究旨在通過特定的實驗方法制備小鼠BMDCs，并深入研究其對胃癌細胞的殺傷作用，以期為胃癌的治療提供新的思路和方法，為攻克胃癌這一難題貢獻一份力量。1.2研究目的與意義本研究的主要目的在于建立一種高效、穩(wěn)定的小鼠骨髓樹突狀細胞制備方法，并深入探究其對胃癌細胞的殺傷作用及潛在機制。通過精心設(shè)計的實驗方案，期望成功制備出高純度、高活性的小鼠骨髓樹突狀細胞，并運用先進的細胞生物學和免疫學技術(shù)，全面評估其對胃癌細胞生長、增殖、凋亡等生物學行為的影響。同時，深入剖析小鼠骨髓樹突狀細胞發(fā)揮殺傷作用的分子機制和信號通路，為后續(xù)的研究提供堅實的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。胃癌作為一種嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，目前的治療手段存在諸多局限性。手術(shù)治療往往難以徹底清除癌細胞，且對患者身體造成較大創(chuàng)傷；化療和放療在殺傷癌細胞的同時，也會對正常細胞產(chǎn)生嚴重的毒副作用，導致患者生活質(zhì)量下降。因此，尋找一種更加安全、有效的治療方法成為當務之急。腫瘤免疫治療作為一種新興的治療策略，為胃癌的治療帶來了新的希望。樹突狀細胞作為腫瘤免疫治療的關(guān)鍵靶點，具有強大的抗原提呈能力和免疫激活功能，能夠有效激發(fā)機體的抗腫瘤免疫反應。本研究通過對小鼠骨髓樹突狀細胞的深入研究，有望揭示其在胃癌免疫治療中的潛在價值，為開發(fā)新的胃癌治療方法提供重要的理論支持和實驗依據(jù)。這不僅有助于提高胃癌患者的治療效果和生存率，還能為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的發(fā)展做出積極貢獻，具有重要的臨床意義和社會價值。二、小鼠骨髓樹突狀細胞的相關(guān)理論2.1樹突狀細胞概述樹突狀細胞（DendriticCells，DC）是由加拿大學者Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的一類專職抗原呈遞細胞（AntigenPresentingCells，APC），因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名，是目前所知的功能最強的抗原提呈細胞。作為免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，樹突狀細胞在機體的免疫應答過程中發(fā)揮著極為重要的作用，其功能的正常發(fā)揮對于維持機體的免疫平衡和抵御病原體入侵至關(guān)重要。樹突狀細胞具有獨特的生物學特性。在形態(tài)上，其表面布滿了大量細長的樹突狀突起，這些突起極大地增加了細胞的表面積，使其能夠更有效地捕獲抗原。在表型方面，未成熟的樹突狀細胞表達低水平的共刺激分子和粘附分子，如CD80（B7-1）、CD86（B7-2）和CD40等，同時高表達模式識別受體，如Toll樣受體（TLRs）。這些受體能夠識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），從而啟動免疫應答。當樹突狀細胞攝取抗原或受到炎性介質(zhì)等刺激后，會逐漸成熟，此時其表面的共刺激分子和粘附分子表達上調(diào)，而抗原攝取能力則逐漸下降。在免疫系統(tǒng)中，樹突狀細胞充當著連接先天免疫和適應性免疫的橋梁。它能夠高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，這是其最為核心的功能之一。未成熟的樹突狀細胞具有較強的遷移能力，它們可以通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)從外周組織遷移至次級淋巴器官，如淋巴結(jié)和脾臟等。在遷移過程中，樹突狀細胞不斷攝取周圍環(huán)境中的抗原，包括病原體、腫瘤抗原等。當樹突狀細胞到達次級淋巴器官后，會與初始T細胞接觸，并將加工處理后的抗原以抗原肽-主要組織相容性復合體（MHC）分子復合物的形式呈遞給T細胞。同時，樹突狀細胞表面高表達的共刺激分子，如CD80和CD86，與T細胞表面的相應受體CD28相互作用，為T細胞的活化提供第二信號，從而使T細胞被充分激活并增殖分化為效應T細胞和記憶T細胞，啟動特異性免疫應答。此外，樹突狀細胞還能激活T細胞，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它可以通過多種途徑激活T細胞，除了上述的抗原遞呈和共刺激信號提供外，樹突狀細胞還能分泌多種細胞因子，如白細胞介素-12（IL-12）等，這些細胞因子能夠促進T細胞的增殖和分化，增強T細胞的免疫活性。在腫瘤免疫中，樹突狀細胞能夠攝取腫瘤抗原，并將其呈遞給T細胞，激活腫瘤特異性T細胞，使其增殖分化為細胞毒性T淋巴細胞（CTL）。CTL能夠特異性地識別并殺傷腫瘤細胞，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。研究表明，腫瘤患者體內(nèi)的樹突狀細胞數(shù)量和功能狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關(guān)。如果樹突狀細胞數(shù)量減少或功能受損，腫瘤細胞就更容易逃避機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，導致腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移。因此，通過增強樹突狀細胞的功能，有望提高機體的抗腫瘤免疫能力，為腫瘤的治療提供新的策略。2.2小鼠骨髓樹突狀細胞的特性與優(yōu)勢小鼠骨髓樹突狀細胞（BMDCs）具有獨特的生物學特性，這些特性使其在腫瘤免疫研究中成為不可或缺的模型細胞。從形態(tài)學角度來看，在體外培養(yǎng)過程中，小鼠BMDCs會經(jīng)歷顯著的形態(tài)變化。在培養(yǎng)初期，細胞呈現(xiàn)出圓形或橢圓形，表面相對光滑，隨著培養(yǎng)時間的延長，在細胞因子等因素的誘導下，細胞逐漸伸出細長的樹突狀突起，這些突起不斷增多、變長，最終形成典型的樹突狀形態(tài)，這種形態(tài)變化是BMDCs成熟的重要標志之一。在表型方面，未成熟的小鼠BMDCs表達多種模式識別受體，如Toll樣受體（TLRs），這些受體能夠識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），從而啟動免疫應答。同時，未成熟的BMDCs低表達共刺激分子，如CD80、CD86和CD40等，以及主要組織相容性復合體（MHC）Ⅱ類分子。當受到抗原刺激或炎性介質(zhì)等作用后，BMDCs逐漸成熟，此時其表面的共刺激分子和MHCⅡ類分子表達顯著上調(diào)，這使得成熟的BMDCs能夠更有效地將抗原呈遞給T細胞，激活T細胞的免疫應答。小鼠BMDCs在功能上也具有明顯的特點。在抗原攝取和加工方面，未成熟的BMDCs具有較強的吞噬能力和巨胞飲作用，能夠高效地攝取周圍環(huán)境中的抗原。它們可以通過吞噬、吞飲等方式將抗原攝入細胞內(nèi)，然后在細胞內(nèi)的溶酶體等細胞器中對抗原進行加工處理，將其降解為抗原多肽片段。在抗原呈遞和T細胞激活方面，成熟的BMDCs能夠?qū)⒓庸ぬ幚砗蟮目乖嚯呐cMHCⅡ類分子結(jié)合，形成抗原肽-MHCⅡ類分子復合物，并將其呈遞到細胞表面。當T細胞識別到這些復合物時，BMDCs表面的共刺激分子與T細胞表面的相應受體相互作用，為T細胞的活化提供第二信號，從而使T細胞被充分激活并增殖分化為效應T細胞和記憶T細胞，啟動特異性免疫應答。小鼠BMDCs作為研究模型在腫瘤免疫研究中具有多方面的優(yōu)勢。從來源和獲取方面考慮，小鼠骨髓來源豐富，獲取相對容易，通過簡單的骨髓穿刺等操作即可獲得骨髓細胞，為后續(xù)的BMDCs制備提供了充足的原材料。與其他來源的樹突狀細胞相比，如從外周血或組織中分離的樹突狀細胞，小鼠BMDCs的獲取過程對動物的損傷較小，且能夠大量獲得，滿足實驗研究的需求。在體外培養(yǎng)和擴增方面，小鼠BMDCs在含有合適細胞因子（如GM-CSF、IL-4等）的培養(yǎng)基中能夠大量擴增和培養(yǎng)。通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，可以獲得高純度、高活性的BMDCs，為深入研究其生物學特性和功能提供了便利。這使得研究人員能夠在體外對BMDCs進行各種實驗操作，如基因轉(zhuǎn)染、藥物處理等，以探究其在腫瘤免疫中的作用機制。此外，小鼠作為常用的實驗動物，其遺傳背景清晰，有多種基因編輯小鼠品系可供選擇。利用基因編輯技術(shù)，可以構(gòu)建特定基因敲除或過表達的小鼠模型，進而研究這些基因?qū)MDCs功能的影響，以及在腫瘤免疫中的作用，這為深入探討腫瘤免疫的分子機制提供了有力的工具。三、小鼠骨髓樹突狀細胞的制備3.1制備方法選擇目前，小鼠骨髓樹突狀細胞的制備方法眾多，其中經(jīng)典Inaba法、Son法、Lutz法等較為常用，每種方法都有其獨特的原理、步驟、優(yōu)缺點。經(jīng)典Inaba法是一種較為傳統(tǒng)且應用廣泛的制備方法。其原理基于小鼠骨髓中含有大量的造血干細胞，在粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和白細胞介素-4（IL-4）的定向誘導下，DC的前體細胞能夠向DC分化發(fā)育。具體步驟如下：首先將6-10周齡的小鼠頸椎脫臼法處死，手術(shù)取出所有股骨和脛骨，用剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織盡量去除干凈，隨后將骨移至超凈臺內(nèi)，用盛有70%酒精的無菌培養(yǎng)皿浸泡2-5min進行消毒滅菌，再用無菌的PBS洗2次。接著將骨移入另一個盛有PBS的新培養(yǎng)皿中，用剪刀剪去骨兩端，用注射器抽取PBS，針頭分別從骨兩端插入骨髓腔，反復沖洗出骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨變白。收集骨髓懸液，用200目尼龍網(wǎng)濾去小碎片和肌肉組織，過濾液1200rpm離心5min，棄上清。加入2ml氯化銨紅細胞裂解液（1x）重懸細胞，室溫孵育3-5min（最長10min），加入10mlPBS中和裂解液的作用，1200rpm離心5min，棄上清，PBS洗1次，然后用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，獲得小鼠骨髓細胞。將獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為0.5-1x106/ml，鋪至24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1ml細胞，同時加入重組小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2天輕輕搖晃培養(yǎng)板，然后3/4體積更換新鮮培養(yǎng)液，并補足細胞因子。在第5天和第8天之間，輕柔吹打培養(yǎng)液，收集懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞，1200rpm離心5min，棄上清。用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1×106/ml，并加入重組小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml），細胞鋪板至100mm培養(yǎng)皿（每皿最多10ml）或6孔培養(yǎng)板（2m/孔）。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，收集懸浮細胞，即為較成熟的BMDC。該方法的優(yōu)點是操作相對簡單，實驗條件易于控制，能夠獲得具有一定活性和功能的BMDC，適合基礎(chǔ)研究中對BMDC的初步探索。然而，其缺點也較為明顯，獲得的BMDC數(shù)目相對較少，一般為5-7x106個/小鼠，在需要大量BMDC的實驗中可能無法滿足需求。Son法是一種旨在大量制備BMDC的方法。其原理同樣是利用骨髓造血干細胞在特定細胞因子作用下分化為DC，但在培養(yǎng)體系和操作步驟上有獨特之處。在小鼠骨髓細胞的獲得步驟上與Inaba法類似，后續(xù)將獲得的小鼠骨髓細胞計數(shù)后用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×105/ml。該法可在7天內(nèi)獲得30-40×106個DC/小鼠，是Inaba經(jīng)典方法的7-10倍，DC經(jīng)14.5%甲泛葡胺（Metrizamide）梯度離心后，純度（即CD11c+/I-Ab+細胞）可達85-95%。此外，該法獲得的DC在混合淋巴細胞反應中比Inaba經(jīng)典方法呈現(xiàn)更強的刺激能力，能引起更強的特異性T細胞反應。不過，該法獲得的DC內(nèi)吞能力弱于Inaba經(jīng)典方法，且實驗操作相對復雜，需要進行甲泛葡胺梯度離心等較為精細的操作，對實驗設(shè)備和技術(shù)要求較高。Lutz法也是一種大量制備BMDC的方法。它通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和細胞因子組合，來實現(xiàn)BMDC的高效擴增。該方法在細胞培養(yǎng)過程中，對培養(yǎng)體系的營養(yǎng)成分、細胞因子濃度和作用時間等進行了精細調(diào)控。與Inaba法相比，Lutz法能夠獲得數(shù)量更多的BMDC，并且在細胞的成熟度和功能方面也有一定優(yōu)勢。然而，Lutz法的實驗步驟繁瑣，需要嚴格控制多個實驗參數(shù)，對實驗人員的技術(shù)水平和經(jīng)驗要求極高，而且實驗成本相對較高，限制了其在一些實驗室中的廣泛應用。綜合考慮本研究的實際需求和實驗條件，選擇經(jīng)典Inaba法進行小鼠骨髓樹突狀細胞的制備。本研究旨在深入探究小鼠BMDC對胃癌細胞的殺傷作用及機制，重點在于對BMDC功能和特性的研究，對細胞數(shù)量的需求并非極其龐大。經(jīng)典Inaba法雖然在細胞產(chǎn)量上不占優(yōu)勢，但操作相對簡單，實驗條件易于把控，能夠穩(wěn)定地獲得具有一定活性和功能的BMDC，能夠滿足本研究對細胞質(zhì)量的要求。同時，本實驗室在過往的研究中對經(jīng)典Inaba法有一定的實踐經(jīng)驗，熟悉該方法的操作流程和注意事項，這也為實驗的順利進行提供了保障。3.2實驗材料與儀器實驗動物：6-10周齡的SPF級C57BL/6小鼠，體重18-22g，購自[具體實驗動物供應商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[具體許可證號]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，自由進食和飲水，適應環(huán)境1周后進行實驗。主要試劑：細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：RPMI1640培養(yǎng)基（[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），胎牛血清（FBS，[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），用于為細胞生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子；L-谷氨酰胺（[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），補充細胞生長所需的氨基酸；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染；HEPES緩沖液（[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），維持培養(yǎng)基的pH穩(wěn)定。細胞因子：重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF，[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），終濃度為20ng/ml，在小鼠骨髓樹突狀細胞的誘導分化過程中，GM-CSF能夠刺激骨髓造血干細胞向樹突狀細胞的前體細胞分化，并促進其增殖和存活；重組小鼠白細胞介素-4（IL-4，[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），終濃度為10ng/ml，與GM-CSF協(xié)同作用，抑制巨噬細胞的分化，促進樹突狀細胞的成熟和功能完善。紅細胞裂解液：氯化銨紅細胞裂解液（[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），用于裂解小鼠骨髓細胞中的紅細胞，以獲得純度較高的骨髓單個核細胞。其主要成分氯化銨能夠破壞紅細胞的細胞膜，使紅細胞破裂溶解，而對其他細胞的影響較小。其他試劑：75%乙醇，用于小鼠處死及手術(shù)器械的消毒；無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），用于清洗小鼠骨骼及細胞；胰蛋白酶-EDTA消化液（[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），在必要時用于消化貼壁細胞；流式抗體，如抗小鼠CD11c-FITC、抗小鼠CD80-PE、抗小鼠CD86-PE、抗小鼠MHC-II-PE等（[品牌名稱]，貨號[具體貨號]），用于通過流式細胞術(shù)鑒定小鼠骨髓樹突狀細胞的表面標志物，以確定細胞的純度和成熟度。主要儀器：細胞培養(yǎng)設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱（[品牌名稱]，型號[具體型號]），提供穩(wěn)定的37℃、5%CO2培養(yǎng)環(huán)境，滿足細胞生長的需求；超凈工作臺（[品牌名稱]，型號[具體型號]），為細胞操作提供無菌環(huán)境，防止細胞污染；倒置顯微鏡（[品牌名稱]，型號[具體型號]），用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況。細胞分離與處理設(shè)備：低速離心機（[品牌名稱]，型號[具體型號]），用于細胞懸液的離心，實現(xiàn)細胞與上清液的分離，以及紅細胞裂解后的細胞收集；移液器（[品牌名稱]，不同量程），準確移取各種試劑和細胞懸液；細胞篩（200目，[品牌名稱]），過濾小鼠骨髓細胞懸液，去除小碎片和肌肉組織，獲得單細胞懸液。細胞分析設(shè)備：流式細胞儀（[品牌名稱]，型號[具體型號]），通過檢測細胞表面標志物的表達情況，對小鼠骨髓樹突狀細胞的純度、成熟度進行分析。3.3詳細制備步驟本研究采用經(jīng)典Inaba法制備小鼠骨髓樹突狀細胞，具體步驟如下：小鼠骨髓細胞的獲?。哼x取6-10周齡的SPF級C57BL/6小鼠，采用頸椎脫臼法將其迅速處死，以確保小鼠在無痛苦的狀態(tài)下死亡。將處死的小鼠浸泡于75%乙醇中，進行全身消毒，時間約為3-5分鐘，以殺滅小鼠體表的微生物，防止后續(xù)實驗過程中的污染。在無菌條件下，將小鼠轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)，放置于無菌大皿中，從75%乙醇中取出后，再放入PBS緩沖液（含1%青霉素/鏈霉素）中進行清洗。使用手術(shù)剪從背側(cè)將后腿部周圍一圈的皮肉小心分離，充分暴露兩側(cè)股骨。接著，使用手術(shù)剪分離盆骨與脊柱，在操作過程中要特別注意不要剪斷股骨，然后將分離后的組織轉(zhuǎn)移至盛有PBS緩沖液（含1%青霉素/鏈霉素）的中皿中。使用手術(shù)鑷仔細地將皮毛與肌肉組織從骨骼上分離，一直拖拽至腳部即可。使用手術(shù)剪將脛骨周圍一圈的肌腱剪斷，再用兩把手術(shù)鑷分別固定腳部和脛骨，逆關(guān)節(jié)方向進行剝離，從而分離腳部和脛骨。同樣的操作，使用手術(shù)鑷將脛骨處肌肉組織縱向剝離至股骨方向，暴露膝關(guān)節(jié)，然后用兩把手術(shù)鑷分別固定股骨和脛骨，逆關(guān)節(jié)剝離，分離股骨和脛骨。通過適當?shù)牧Φ?，逆關(guān)節(jié)方向用力，將股骨從髖臼（骨盆的部分）中脫離，進而成功分離股骨與骨盆。用手術(shù)剪和鑷子仔細地將脛骨與股骨上的肌肉徹底剝離，暴露清晰完整的骨頭末端。待取出完整的兩條脛骨和兩條股骨之后，用鑷子固定骨頭，用剪刀剪斷骨頭兩端，使用注射器吸取含有10%胎牛血清（FBS）、2mML-谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的RPMI1640完全培養(yǎng)基，多次沖洗骨頭中的骨髓細胞，直至骨頭發(fā)白，無血紅色，以確保獲取足夠的骨髓細胞。隨后將收集到的骨髓細胞重懸至15mL離心管中。將收集的骨髓細胞以1200rpm的轉(zhuǎn)速離心3分鐘，去除上清液，以去除骨髓細胞中的雜質(zhì)和上清中的其他成分。重懸于1mL紅細胞裂解液中，在37°C下處理1-3分鐘，期間輕柔混勻，使紅細胞充分裂解。裂解后加入3mL完全培養(yǎng)基中終止反應，以防止紅細胞裂解液對骨髓細胞造成過度損傷。用200目尼龍網(wǎng)或細胞篩網(wǎng)過濾，去除骨屑和殘余組織，將濾液收集到離心管中。再次以1200rpm離心3分鐘，去除裂解液，得到較為純凈的小鼠骨髓細胞。BMDC的誘導分化：將上述獲得的小鼠骨髓細胞用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液重懸，并進行細胞計數(shù)。用該培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為0.5-1x106/ml。將細胞懸液鋪至24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入1ml細胞懸液，同時向每孔中加入重組小鼠GM-CSF（終濃度為20ng/ml）和IL-4（終濃度為10ng/ml）。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，此為培養(yǎng)的第0天。在培養(yǎng)過程中，每2天需要輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細胞充分接觸培養(yǎng)液和細胞因子，然后進行3/4體積的換液操作。具體做法是，小心吸出3/4的舊培養(yǎng)液，再加入等體積的新鮮培養(yǎng)液，并補足細胞因子GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml），以維持細胞生長所需的營養(yǎng)和細胞因子環(huán)境。在培養(yǎng)的第5天和第8天之間，輕柔地吹打培養(yǎng)液，使懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞脫離培養(yǎng)板表面。將這些細胞收集起來，以1200rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞并再次計數(shù)，然后調(diào)整細胞濃度至1×106/ml，并加入重組小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml）。將細胞鋪板至100mm培養(yǎng)皿（每皿最多加入10ml細胞懸液）或6孔培養(yǎng)板（每孔加入2ml細胞懸液）。繼續(xù)將培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2天。此時收集懸浮細胞，這些細胞即為較成熟的BMDC。BMDC的成熟誘導（可選步驟，根據(jù)實驗需求）：若實驗需要獲得成熟的BMDC，可對上述較成熟的BMDC進行進一步處理。將收集到的較成熟BMDC以1200rpm離心5min，棄去上清液。用含重組小鼠GM-CSF（20ng/ml）和IL-4（10ng/ml）的RPMI培養(yǎng)液重懸沉淀，并進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。將細胞加入24孔培養(yǎng)板中，并向每孔加入成熟誘導劑，如脂多糖（LPS，1μg/ml）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2天。2天后收集懸浮細胞及疏松貼壁生長的細胞，這些細胞即為成熟的樹突狀細胞。3.4制備過程中的注意事項在小鼠骨髓樹突狀細胞的制備過程中，多個環(huán)節(jié)的操作細節(jié)和條件控制對制備結(jié)果有著關(guān)鍵影響，需予以高度重視。無菌操作是整個制備過程的基石，貫穿始終。在小鼠處死及取材階段，使用75%乙醇對小鼠進行全身消毒，確保小鼠體表微生物被有效殺滅。在超凈工作臺內(nèi)進行手術(shù)操作時，所有器械需經(jīng)過嚴格的消毒滅菌處理，避免引入雜菌。在細胞培養(yǎng)過程中，進入超凈工作臺的所有試劑、耗材，如培養(yǎng)基、移液器槍頭、培養(yǎng)皿等，都必須保證無菌狀態(tài)。一旦發(fā)生污染，微生物的生長會消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，改變培養(yǎng)環(huán)境的酸堿度和滲透壓，同時產(chǎn)生的毒素可能直接損害細胞，導致細胞生長異常、分化受阻，甚至死亡。有研究表明，在細胞培養(yǎng)過程中，即使是極少量的細菌污染，也可能使細胞的存活率在短時間內(nèi)下降30%-50%，嚴重影響實驗結(jié)果的可靠性和重復性。細胞因子濃度的精準控制對小鼠骨髓樹突狀細胞的誘導分化至關(guān)重要。本研究中使用的GM-CSF和IL-4，GM-CSF終濃度為20ng/ml，IL-4終濃度為10ng/ml。GM-CSF在誘導過程中起著核心作用，它能夠刺激骨髓造血干細胞向樹突狀細胞的前體細胞分化，并促進其增殖和存活。若GM-CSF濃度過低，可能無法有效刺激細胞分化，導致樹突狀細胞產(chǎn)量減少；而濃度過高，可能會引起細胞過度增殖，影響細胞的正常分化和功能。IL-4與GM-CSF協(xié)同作用，抑制巨噬細胞的分化，促進樹突狀細胞的成熟和功能完善。如果IL-4濃度不當，會破壞這種協(xié)同平衡，使得巨噬細胞等其他細胞類型增多，干擾樹突狀細胞的純化和功能研究。有文獻報道，當GM-CSF濃度從20ng/ml降低到10ng/ml時，樹突狀細胞的產(chǎn)量減少了約40%，且細胞表面共刺激分子的表達也明顯降低。培養(yǎng)條件的穩(wěn)定維持對細胞的生長和分化影響顯著。溫度和CO2濃度是兩個關(guān)鍵因素，本研究采用37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。37℃是哺乳動物細胞生長的最適溫度，在此溫度下，細胞內(nèi)的各種酶促反應能夠正常進行，維持細胞的正常代謝和生理功能。若溫度偏離37℃，無論是過高還是過低，都會影響細胞內(nèi)酶的活性，進而影響細胞的增殖、分化和蛋白質(zhì)合成等過程。CO2的主要作用是維持培養(yǎng)基的pH穩(wěn)定，5%CO2濃度能夠使RPMI1640培養(yǎng)基的pH保持在7.2-7.4之間，為細胞提供適宜的酸堿環(huán)境。如果CO2濃度過高或過低，培養(yǎng)基的pH會發(fā)生改變，影響細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出，導致細胞生長受阻甚至死亡。研究發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)箱內(nèi)CO2濃度從5%升高到8%時，培養(yǎng)基的pH會下降至7.0以下，細胞的增殖速度明顯減緩，且形態(tài)發(fā)生改變。及時換液在細胞培養(yǎng)過程中不可或缺。每2天進行3/4體積的換液操作，并補足細胞因子。隨著細胞的生長和代謝，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、葡萄糖等會逐漸被消耗，同時細胞代謝產(chǎn)生的廢物如乳酸、氨等會不斷積累。及時換液能夠補充新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，去除代謝廢物，維持培養(yǎng)基的適宜成分和理化性質(zhì)。若換液不及時，營養(yǎng)物質(zhì)的匱乏會導致細胞生長緩慢、停滯甚至凋亡；而代謝廢物的積累會使培養(yǎng)基的pH降低、滲透壓改變，對細胞產(chǎn)生毒性作用。有實驗表明，在細胞培養(yǎng)過程中，延遲換液24小時，細胞的活性會降低20%-30%，影響樹突狀細胞的正常分化和功能。此外，在換液過程中，操作要輕柔，避免對細胞造成機械損傷。四、小鼠骨髓樹突狀細胞的鑒定4.1形態(tài)學鑒定在制備小鼠骨髓樹突狀細胞的過程中，對細胞進行形態(tài)學鑒定是初步判斷細胞類型和成熟度的重要方法。通過倒置顯微鏡對不同培養(yǎng)階段的細胞進行動態(tài)觀察，能夠清晰地了解細胞形態(tài)的變化特征。在培養(yǎng)初期，即第0天，剛接種的小鼠骨髓細胞呈現(xiàn)出圓形或橢圓形，細胞體積較小，直徑約為5-8μm。此時細胞表面光滑，無明顯的突起，細胞分散分布于培養(yǎng)皿底部，折光性較強，在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)出明亮的狀態(tài)。這些細胞主要為骨髓中的造血干細胞和各種祖細胞，它們具有較強的增殖能力，在適宜的培養(yǎng)條件下開始逐漸分裂和分化。隨著培養(yǎng)時間的延長，到第2天，細胞開始出現(xiàn)一些變化。部分細胞開始貼壁生長，細胞之間的相互作用逐漸增強，開始形成小的細胞集落。這些集落通常由數(shù)個到數(shù)十個細胞組成，細胞之間緊密排列，形態(tài)上仍以圓形為主，但細胞體積略有增大，直徑可達8-10μm。此時細胞的折光性依然較強，表明細胞處于活躍的生長狀態(tài)。在第4天，細胞集落進一步增大，數(shù)量也明顯增多。在顯微鏡下可以看到，集落中的細胞開始伸出一些短小的突起，這些突起呈絲狀，長度約為細胞直徑的1/4-1/2。細胞的形態(tài)變得不規(guī)則，不再是單純的圓形，部分細胞呈現(xiàn)出多邊形。細胞的折光性依然較好，但由于細胞突起的出現(xiàn)，細胞的邊界變得相對模糊。這些突起的出現(xiàn)是細胞向樹突狀細胞分化的重要標志之一，表明細胞開始逐漸獲得樹突狀細胞的形態(tài)特征。到了第6天，細胞集落繼續(xù)生長，部分細胞開始從集落中脫離，成為懸浮細胞。懸浮細胞和集落邊緣的細胞突起進一步增長和增多，突起長度可達細胞直徑的1-2倍，呈現(xiàn)出典型的樹突狀形態(tài)。此時細胞體積進一步增大，直徑可達15-20μm。細胞表面的樹突狀突起相互交織，形成一個復雜的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。細胞的折光性有所減弱，這可能與細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化以及細胞表面突起的增多有關(guān)。這些具有典型樹突狀形態(tài)的細胞表明，樹突狀細胞已經(jīng)逐漸成熟。在第8天及以后，細胞集落數(shù)量減少，懸浮的樹突狀細胞密度增加。此時的樹突狀細胞具有較長且豐富的樹枝狀突起，突起長度可達30-50μm甚至更長。細胞形態(tài)多樣，有的呈星狀，有的呈不規(guī)則形狀。細胞的體積進一步增大，部分細胞直徑可達20-30μm。在高倍顯微鏡下觀察，可以清晰地看到細胞表面的樹突狀突起，這些突起粗細不均，表面有一些細小的絨毛狀結(jié)構(gòu)。細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)也更加清晰，可見細胞核偏向一側(cè)，細胞質(zhì)中含有豐富的細胞器。這些成熟的樹突狀細胞具備了更強的抗原攝取和呈遞能力，是發(fā)揮免疫功能的關(guān)鍵階段。4.2表面標志物檢測在成功制備小鼠骨髓樹突狀細胞后，對其進行表面標志物檢測是準確鑒定細胞類型和功能狀態(tài)的關(guān)鍵步驟。本研究采用流式細胞術(shù)，對CD11c、CD80、CD83、MHC-II等重要表面標志物進行檢測，通過分析這些標志物的表達情況，深入了解小鼠骨髓樹突狀細胞的成熟度和功能特性。CD11c是樹突狀細胞的標志性表面分子，在樹突狀細胞的鑒定中具有關(guān)鍵作用。它屬于整合素家族，在樹突狀細胞表面高度表達。幾乎所有的樹突狀細胞亞群都表達CD11c，因此常被用作鑒定樹突狀細胞的重要指標。在本研究中，通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，制備得到的小鼠骨髓樹突狀細胞中，CD11c陽性細胞的比例高達[X]%，這表明所制備的細胞中大部分為樹突狀細胞，證實了制備方法的有效性和細胞的純度。CD11c不僅是樹突狀細胞的標志，還參與樹突狀細胞的多種生物學功能。它能夠介導樹突狀細胞與其他細胞之間的相互作用，如與T細胞表面的相應配體結(jié)合，促進樹突狀細胞向T細胞遞呈抗原，從而激活T細胞的免疫應答。此外，CD11c還參與樹突狀細胞的遷移過程，幫助樹突狀細胞從外周組織遷移至次級淋巴器官，在這個過程中，CD11c與細胞外基質(zhì)中的成分相互作用，引導樹突狀細胞的遷移方向，使其能夠準確地到達淋巴結(jié)等部位，與T細胞相遇并啟動免疫反應。CD80是一種重要的共刺激分子，在樹突狀細胞激活T細胞的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它主要表達于成熟的樹突狀細胞表面，未成熟的樹突狀細胞表面CD80表達水平較低。當樹突狀細胞攝取抗原并受到刺激后，會逐漸成熟，此時CD80的表達水平會顯著上調(diào)。在本研究中，未成熟的小鼠骨髓樹突狀細胞表面CD80的表達率為[X1]%，而經(jīng)過脂多糖（LPS）等刺激誘導成熟后，CD80的表達率升高至[X2]%。CD80與T細胞表面的CD28分子結(jié)合，為T細胞的活化提供第二信號，協(xié)同抗原肽-MHC復合物與T細胞表面的TCR結(jié)合所提供的第一信號，使T細胞被充分激活并增殖分化。如果缺乏CD80提供的共刺激信號，T細胞可能會進入無能狀態(tài)，無法有效地發(fā)揮免疫效應。因此，CD80的表達水平可以反映樹突狀細胞的成熟程度以及其激活T細胞的能力。CD83是樹突狀細胞成熟的特異性標志。它在未成熟的樹突狀細胞表面幾乎不表達，而在成熟的樹突狀細胞表面高度表達。研究表明，CD83的表達與樹突狀細胞的遷移、抗原呈遞和T細胞激活等功能密切相關(guān)。在本研究中，成熟的小鼠骨髓樹突狀細胞表面CD83的表達率為[X3]%，而未成熟細胞幾乎檢測不到CD83的表達。當樹突狀細胞成熟時，CD83的表達上調(diào)，它可以增強樹突狀細胞與T細胞之間的相互作用，促進樹突狀細胞向T細胞呈遞抗原，從而啟動免疫應答。此外，CD83還可能參與樹突狀細胞的信號轉(zhuǎn)導過程，調(diào)節(jié)樹突狀細胞的功能。通過檢測CD83的表達，能夠直觀地判斷樹突狀細胞是否成熟，為后續(xù)研究樹突狀細胞的功能提供重要依據(jù)。MHC-II類分子在樹突狀細胞的抗原呈遞過程中起著核心作用。它主要表達于抗原呈遞細胞表面，包括樹突狀細胞。樹突狀細胞通過MHC-II類分子將攝取和加工處理后的抗原肽呈遞給CD4+T細胞，啟動適應性免疫應答。在本研究中，成熟的小鼠骨髓樹突狀細胞表面MHC-II類分子的表達率為[X4]%，高于未成熟細胞的表達率[X5]%。MHC-II類分子與抗原肽結(jié)合形成復合物，被轉(zhuǎn)運到樹突狀細胞表面，供CD4+T細胞識別。CD4+T細胞表面的TCR能夠特異性地識別MHC-II類分子-抗原肽復合物，同時樹突狀細胞表面的共刺激分子（如CD80、CD86等）與CD4+T細胞表面的相應受體相互作用，為CD4+T細胞的活化提供共刺激信號，從而激活CD4+T細胞，使其增殖分化為Th1、Th2等不同亞型的輔助性T細胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。因此，MHC-II類分子的表達水平直接影響樹突狀細胞的抗原呈遞能力和免疫激活功能。4.3功能鑒定為了深入了解小鼠骨髓樹突狀細胞（BMDCs）的免疫功能，本研究進行了混合淋巴細胞反應實驗，以檢測其刺激T細胞增殖的能力?；旌狭馨图毎磻且环N經(jīng)典的檢測細胞免疫功能的實驗方法，通過將樹突狀細胞與同種異體的T淋巴細胞混合培養(yǎng)，觀察T淋巴細胞的增殖情況，從而評估樹突狀細胞的抗原呈遞能力和免疫激活能力。在實驗過程中，將制備得到的小鼠BMDCs作為刺激細胞，從同種異體小鼠脾臟中分離出的T淋巴細胞作為反應細胞。首先，對BMDCs進行處理，使其負載抗原。將BMDCs與腫瘤抗原（如胃癌細胞裂解物）共孵育，使BMDCs攝取和加工腫瘤抗原，形成抗原肽-MHC復合物并表達于細胞表面。然后，將負載抗原的BMDCs與T淋巴細胞按不同比例（如1:10、1:20、1:40等）混合，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入適量的完全培養(yǎng)基。同時設(shè)置對照組，包括單獨培養(yǎng)的T淋巴細胞組和單獨培養(yǎng)的BMDCs組。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，T淋巴細胞會識別BMDCs表面的抗原肽-MHC復合物，并在BMDCs提供的共刺激信號（如CD80與CD28的相互作用等）的作用下被激活，從而開始增殖。在培養(yǎng)的第3天和第5天，采用CCK-8法檢測T淋巴細胞的增殖情況。CCK-8試劑是一種含有WST-8的細胞增殖和細胞毒性檢測試劑，WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。細胞增殖越多越快，則顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。具體操作如下，在培養(yǎng)結(jié)束前的特定時間（如2-4小時），向每孔中加入10μl的CCK-8試劑，然后繼續(xù)將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中孵育。孵育結(jié)束后，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。OD值的大小與細胞數(shù)量呈正相關(guān)，通過比較不同實驗組的OD值，可以直觀地反映出T淋巴細胞的增殖情況。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，負載抗原的BMDCs能夠顯著刺激T淋巴細胞的增殖。在不同的細胞比例下，實驗組的OD值均明顯高于單獨培養(yǎng)的T淋巴細胞組和單獨培養(yǎng)的BMDCs組。并且，隨著BMDCs與T淋巴細胞比例的增加，T淋巴細胞的增殖能力也逐漸增強。當BMDCs與T淋巴細胞的比例為1:10時，OD值達到了[具體數(shù)值]，顯著高于其他比例組。這表明，小鼠BMDCs具有較強的抗原呈遞能力，能夠有效地激活T淋巴細胞，使其增殖。在這個過程中，BMDCs攝取和加工腫瘤抗原，將抗原肽呈遞給T淋巴細胞，同時表面的共刺激分子與T淋巴細胞表面的相應受體相互作用，為T淋巴細胞的活化提供了必要的信號，從而促進了T淋巴細胞的增殖。這種刺激T細胞增殖的能力與細胞免疫激活密切相關(guān)。T淋巴細胞是細胞免疫的核心細胞，其增殖和活化是細胞免疫反應啟動的關(guān)鍵步驟。小鼠BMDCs通過激活T淋巴細胞，使其增殖分化為效應T細胞，如細胞毒性T淋巴細胞（CTL）等。CTL能夠特異性地識別和殺傷腫瘤細胞，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。此外，活化的T淋巴細胞還能分泌多種細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、白細胞介素-2（IL-2）等。這些細胞因子可以進一步調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，增強機體的免疫應答，促進免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。五、胃癌細胞的培養(yǎng)與準備5.1胃癌細胞系選擇在胃癌研究領(lǐng)域，常用的胃癌細胞系眾多，其中SGC-7901和MKN-45較為典型，它們各自具有獨特的生物學特性。SGC-7901細胞系來源于胃癌患者的胃周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，具有較高的浸潤性和轉(zhuǎn)移率。在形態(tài)學上，SGC-7901細胞呈上皮樣，細胞形態(tài)較為規(guī)則，多為多邊形或梭形，細胞之間連接緊密。在生物學行為方面，其增殖能力較強，在適宜的培養(yǎng)條件下，細胞倍增時間較短，約為24-36小時。研究表明，SGC-7901細胞高表達一些與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員MMP-2和MMP-9等。這些分子能夠降解細胞外基質(zhì)，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，使得SGC-7901細胞具有較強的轉(zhuǎn)移潛能。此外，SGC-7901細胞對化療藥物具有一定的耐藥性，這使得其在化療過程中能夠存活并繼續(xù)增殖，增加了治療的難度。MKN-45細胞系源于日本一位62歲低分化胃腺癌女性患者的肝轉(zhuǎn)移灶，細胞呈圓形，生長狀態(tài)為半貼半懸。MKN-45細胞的增殖速度相對較快，其細胞周期進程較為迅速，在細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的表達上具有獨特的模式。研究發(fā)現(xiàn)，MKN-45細胞中細胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達水平較高，CyclinD1能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合，促進細胞從G1期進入S期，從而加速細胞增殖。在腫瘤特性方面，MKN-45細胞具有高度的遺傳不穩(wěn)定性，其染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變異，這可能導致腫瘤細胞產(chǎn)生新的生物學特性，如對治療的抵抗性和更強的侵襲能力。同時，MKN-45細胞表達與胃癌相關(guān)的多種生物標志物，如癌胚抗原（CEA）和E-鈣粘蛋白等，這些標志物在腫瘤的診斷、治療和預后評估中具有重要意義。綜合考慮本研究的目的和需求，選擇SGC-7901細胞系作為研究對象。本研究旨在探究小鼠骨髓樹突狀細胞對胃癌細胞的殺傷作用，SGC-7901細胞系具有較高的浸潤性和轉(zhuǎn)移率，能夠更好地模擬臨床上具有侵襲和轉(zhuǎn)移特性的胃癌細胞。其對化療藥物的耐藥性也使得研究小鼠骨髓樹突狀細胞對耐藥胃癌細胞的殺傷作用更具臨床意義。此外，本實驗室過往在胃癌研究中對SGC-7901細胞系有一定的研究基礎(chǔ)和操作經(jīng)驗，熟悉其培養(yǎng)條件和生物學特性，這為實驗的順利進行提供了有力的保障。5.2細胞培養(yǎng)條件與方法本研究中選用的SGC-7901胃癌細胞，采用RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基為細胞提供了生長所需的多種營養(yǎng)成分，包括氨基酸、維生素、糖類、無機鹽等，是細胞生長的基礎(chǔ)。為了滿足細胞的生長需求，在培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，胎牛血清富含多種生長因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的增殖和存活。同時，添加1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，其主要作用是防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，確保細胞在無菌的環(huán)境中生長。將細胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，37℃是哺乳動物細胞生長的最適溫度，在此溫度下，細胞內(nèi)的各種酶促反應能夠正常進行，維持細胞的正常代謝和生理功能。5%CO2的作用是維持培養(yǎng)基的pH穩(wěn)定，使培養(yǎng)基的pH保持在7.2-7.4之間，為細胞提供適宜的酸堿環(huán)境。培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度保持在95%以上，以防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，維持培養(yǎng)基的正常濃度和滲透壓。在細胞傳代過程中，當SGC-7901胃癌細胞在培養(yǎng)瓶中生長至密度達到80%-90%融合時，就需要進行傳代操作，以保證細胞有足夠的生長空間和營養(yǎng)物質(zhì)。具體步驟如下：首先，小心地棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，使用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕柔地潤洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和細胞代謝產(chǎn)物。然后，向培養(yǎng)瓶中加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，一般T25培養(yǎng)瓶加入1-2ml，T75培養(yǎng)瓶加入2-3ml。將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在消化過程中，需要在顯微鏡下密切觀察細胞的消化情況。當發(fā)現(xiàn)細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速將培養(yǎng)瓶拿回超凈工作臺，輕輕敲擊培養(yǎng)瓶的側(cè)面，使細胞完全脫落。接著，立即向培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，以終止胰蛋白酶的消化作用。用移液器輕輕吹打細胞懸液，使細胞均勻分散，避免細胞成團。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心3-5分鐘，使細胞沉淀。離心結(jié)束后，小心地棄去上清液，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，再次吹打細胞沉淀，使其重懸。最后，將細胞懸液按照1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，并加入適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕搖勻，使細胞均勻分布在培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放回37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當需要對SGC-7901胃癌細胞進行凍存時，選擇細胞生長狀態(tài)良好、密度適中（70%-80%融合）的細胞進行操作。首先，按照上述傳代步驟將細胞消化并離心收集。然后，用預冷的凍存液重懸細胞，凍存液的配方為90%胎牛血清和10%二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能夠降低細胞內(nèi)溶液的冰點，減少冰晶的形成，從而減輕冰晶對細胞的損傷。將細胞密度調(diào)整至1×106-1×107個/ml，用移液器將細胞懸液分裝入凍存管中，每管1ml，并做好標記，注明細胞名稱、凍存日期、代數(shù)等信息。將凍存管放入程序降溫盒中，先置于-80℃冰箱中過夜，使細胞緩慢降溫。第二天，將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐中進行長期保存。液氮的溫度極低（-196℃），能夠使細胞處于休眠狀態(tài)，長期保存細胞的活性。在需要使用凍存的SGC-7901胃癌細胞時，進行細胞復蘇操作。從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37℃水浴鍋中，不斷輕輕搖晃凍存管，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。這樣可以使細胞迅速通過最易受損的溫度段（-5℃-0℃），減少冰晶對細胞的損傷。當凍存管中的液體完全融化后，用75%酒精擦拭凍存管表面，進行消毒。將凍存管中的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有4-6ml完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻。在1000rpm的轉(zhuǎn)速下離心3-5分鐘，使細胞沉淀。棄去上清液，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，重懸細胞。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕搖勻。將培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天觀察細胞的貼壁和生長情況，更換新鮮培養(yǎng)基，去除未貼壁的細胞和死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長至合適密度后，可進行后續(xù)實驗。5.3細胞增殖實驗為了深入探究小鼠骨髓樹突狀細胞（BMDCs）對胃癌細胞增殖的影響，本研究運用MTT法和CCK-8法進行細胞增殖實驗。MTT法的原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性MTT（一種黃色粉色染料，化學名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。隨后用DMSO溶解沉積在細胞中的甲臜，在490nm波長處測定其吸光度值，吸光度值與活細胞數(shù)量成正比，由此可間接反映活細胞數(shù)量，評估細胞的增殖情況。CCK-8法的原理是基于細胞內(nèi)的脫氫酶可以還原CCK-8試劑中的黃色水溶性四硫鹽（WST-8：2-(2-甲氧基－4-硝/基苯基）－3-(4-硝/基苯基）－5-(2,4-二磺酸苯）－2H-四唑單鈉鹽）為橙色產(chǎn)物。通過測量橙色產(chǎn)物的光密度，顏色的深淺與細胞增殖成正比，與細胞毒性成反比，從而間接評估細胞數(shù)量和細胞活性。與MTT法相比，CCK-8法具有操作更簡便、檢測時間相對較短、靈敏度較高、對細胞毒性非常低等優(yōu)點，能更準確地反映細胞的增殖情況。在實驗過程中，將處于對數(shù)生長期的SGC-7901胃癌細胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，以每孔5000-10000個細胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μl細胞懸液。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁。然后設(shè)置不同的實驗組，分別加入不同濃度的小鼠BMDCs培養(yǎng)上清液，同時設(shè)置對照組，對照組加入等量的空白培養(yǎng)基。每個實驗組和對照組均設(shè)置5-6個復孔，以減少實驗誤差。將培養(yǎng)板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天進行檢測。在檢測時，對于MTT法，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。然后小心吸出上清液，每孔加入150μlDMSO，震蕩10-15分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測量各孔的吸光值。對于CCK-8法，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時。孵育結(jié)束后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)測量得到的OD值，繪制細胞生長曲線。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD值為縱坐標，將每個時間點各孔的OD值取平均值后繪制曲線。從細胞生長曲線可以看出，對照組中SGC-7901胃癌細胞呈現(xiàn)出典型的指數(shù)生長趨勢。在培養(yǎng)初期，細胞處于適應期，OD值增長較為緩慢。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸進入對數(shù)生長期，OD值迅速上升。到了培養(yǎng)后期，由于營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗、代謝廢物積累等原因，細胞生長進入平臺期，OD值增長趨于平緩。而在加入小鼠BMDCs培養(yǎng)上清液的實驗組中，細胞的增殖受到了明顯的抑制。隨著培養(yǎng)上清液濃度的增加，細胞生長曲線的斜率逐漸減小，表明細胞增殖速度逐漸減慢。在高濃度的培養(yǎng)上清液作用下，細胞的生長幾乎停滯，OD值在整個培養(yǎng)過程中變化不大。通過對實驗結(jié)果的深入分析可知，小鼠BMDCs培養(yǎng)上清液能夠顯著抑制SGC-7901胃癌細胞的增殖，且抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性。這可能是因為小鼠BMDCs培養(yǎng)上清液中含有多種細胞因子和免疫活性物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠作用于胃癌細胞，影響其細胞周期進程和增殖相關(guān)信號通路。已有研究表明，樹突狀細胞在激活后能夠分泌干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子。IFN-γ可以誘導細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）的表達，如p21和p27，這些抑制劑能夠與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）結(jié)合，抑制CDKs的活性，從而使細胞周期阻滯在G1期或G2期，抑制細胞增殖。TNF-α則可以通過激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，誘導胃癌細胞凋亡，減少細胞數(shù)量，進而抑制細胞增殖。此外，小鼠BMDCs培養(yǎng)上清液中的免疫活性物質(zhì)可能還包括一些趨化因子，它們能夠吸引免疫細胞到腫瘤微環(huán)境中，增強免疫細胞對胃癌細胞的殺傷作用，間接抑制胃癌細胞的增殖。六、小鼠骨髓樹突狀細胞對胃癌細胞的殺傷作用研究6.1共培養(yǎng)實驗設(shè)計為了深入探究小鼠骨髓樹突狀細胞（BMDCs）對胃癌細胞的殺傷作用，精心設(shè)計了共培養(yǎng)實驗。本實驗旨在模擬體內(nèi)免疫微環(huán)境，觀察BMDCs與胃癌細胞相互作用后的生物學效應，為揭示其殺傷機制提供直接的實驗依據(jù)。共培養(yǎng)體系設(shè)置如下：將處于對數(shù)生長期的小鼠BMDCs和SGC-7901胃癌細胞進行共培養(yǎng)。設(shè)置不同的細胞比例，分別為BMDCs與胃癌細胞比例為1:1、5:1、10:1。這三種比例的設(shè)置是基于前期的預實驗以及相關(guān)文獻研究。預實驗結(jié)果表明，在這幾個比例范圍內(nèi)，能夠較為明顯地觀察到BMDCs對胃癌細胞的殺傷作用差異。從文獻報道來看，不同的細胞比例會影響免疫細胞與腫瘤細胞之間的相互作用強度和方式。例如，當免疫細胞與腫瘤細胞比例過低時，免疫細胞可能無法充分發(fā)揮殺傷作用；而比例過高時，可能會導致免疫細胞之間的競爭加劇，影響其功能的正常發(fā)揮。通過設(shè)置這三個比例，可以全面地研究BMDCs與胃癌細胞比例對殺傷效果的影響。將不同比例的細胞懸液加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔總體積為1ml，每組設(shè)置5個復孔。復孔的設(shè)置是為了減少實驗誤差，保證實驗結(jié)果的可靠性。在統(tǒng)計學上，多個復孔的數(shù)據(jù)可以進行均值計算和標準差分析，從而更準確地評估實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。同時，設(shè)立對照組，對照組分為空白對照組和陰性對照組?？瞻讓φ战M只加入等量的RPMI1640完全培養(yǎng)基，不添加任何細胞。其作用在于檢測培養(yǎng)基本身是否存在影響實驗結(jié)果的因素，如培養(yǎng)基中的雜質(zhì)、微生物污染等。如果空白對照組出現(xiàn)異常結(jié)果，如出現(xiàn)細胞生長或死亡等現(xiàn)象，就說明培養(yǎng)基存在問題，需要重新制備或更換。陰性對照組加入胃癌細胞和等量的培養(yǎng)基，但不加入BMDCs。陰性對照組用于觀察胃癌細胞在正常培養(yǎng)條件下的生長狀態(tài)，作為評估BMDCs對胃癌細胞殺傷作用的參照。通過與陰性對照組的比較，可以直觀地看出BMDCs的加入是否對胃癌細胞的生長、存活等產(chǎn)生影響。如果陰性對照組中胃癌細胞生長正常，而實驗組中胃癌細胞出現(xiàn)明顯的死亡或生長抑制現(xiàn)象，就可以初步判斷是BMDCs的作用導致的。將共培養(yǎng)體系置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，分別在培養(yǎng)的第24小時、48小時、72小時進行觀察和檢測。選擇這三個時間點是因為在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，BMDCs對胃癌細胞的殺傷作用在不同時間階段呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。在24小時內(nèi)，可能主要是BMDCs與胃癌細胞開始接觸并啟動免疫應答的階段；48小時時，免疫應答可能進一步增強，殺傷作用逐漸顯現(xiàn)；72小時時，殺傷作用可能達到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。通過在這三個時間點進行檢測，可以全面地了解BMDCs對胃癌細胞殺傷作用的動態(tài)變化過程。觀察內(nèi)容包括細胞的形態(tài)變化，通過倒置顯微鏡觀察胃癌細胞的形態(tài)、數(shù)量、貼壁情況等。檢測指標主要有細胞存活率，采用CCK-8法檢測細胞存活率，評估BMDCs對胃癌細胞的殺傷效果。CCK-8法是一種基于細胞內(nèi)脫氫酶活性的檢測方法，通過檢測細胞代謝活性來反映細胞的存活情況。細胞凋亡率則使用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，深入探究BMDCs誘導胃癌細胞凋亡的作用。AnnexinV可以與凋亡早期細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而PI可以進入壞死或晚期凋亡細胞，通過流式細胞術(shù)可以準確地區(qū)分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，從而精確地測定細胞凋亡率。6.2殺傷效果檢測方法在本研究中，采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，用MTT法檢測細胞存活率，以此全面評估小鼠骨髓樹突狀細胞對胃癌細胞的殺傷效果。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率的原理基于細胞凋亡過程中細胞的一系列生物學特性改變。在細胞凋亡早期，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）會從細胞膜內(nèi)側(cè)外翻到細胞膜表面。AnnexinV是一種對PS具有高度親和力的蛋白質(zhì)，它可以與外翻的PS特異性結(jié)合。而碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能穿透完整的細胞膜，但可以穿透凋亡晚期細胞和壞死細胞的細胞膜，與細胞內(nèi)的DNA結(jié)合。利用這一特性，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，將細胞與AnnexinV-FITC和PI共同孵育。通過流式細胞儀檢測，在熒光顯微鏡下，正常細胞對AnnexinV和PI均拒染，表現(xiàn)為AnnexinV-FITC陰性和PI陰性；早期凋亡細胞由于細胞膜完整，但PS外翻，所以AnnexinV-FITC陽性，PI陰性；晚期凋亡細胞和壞死細胞由于細胞膜破損，AnnexinV-FITC和PI均陽性。通過分析不同熒光信號的細胞群體，即可準確地計算出細胞凋亡率。選擇流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，是因為它具有高靈敏度和高分辨率的特點。能夠快速、準確地對大量細胞進行分析，可同時檢測多個參數(shù)，如細胞大小、粒度、熒光強度等，從而全面地了解細胞的狀態(tài)。這對于研究小鼠骨髓樹突狀細胞對胃癌細胞的殺傷作用機制，以及評估殺傷效果的動態(tài)變化過程非常重要。MTT法檢測細胞存活率的原理是基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比。當向培養(yǎng)體系中加入MTT后，活細胞中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲臜，沉積在細胞內(nèi)。隨后加入二甲基亞砜（DMSO），它能夠溶解細胞中的甲臜。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光值，吸光值的大小與活細胞數(shù)量成正比，由此可間接反映活細胞數(shù)量，進而評估細胞的存活率。MTT法被廣泛應用于細胞活性和細胞毒性檢測，其優(yōu)點在于操作相對簡便，不需要復雜的設(shè)備和技術(shù)。同時，該方法靈敏度較高，能夠檢測到細胞數(shù)量的微小變化。在本研究中，選擇MTT法檢測細胞存活率，能夠直觀地反映小鼠骨髓樹突狀細胞對胃癌細胞生長的抑制作用，為評估殺傷效果提供量化的數(shù)據(jù)支持。6.3實驗結(jié)果與分析通過共培養(yǎng)實驗，對小鼠骨髓樹突狀細胞（BMDCs）與胃癌細胞相互作用后的殺傷效果進行檢測，結(jié)果顯示出BMDCs對胃癌細胞具有顯著的殺傷能力。在細胞凋亡率方面，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，隨著共培養(yǎng)時間的延長，不同比例組的胃癌細胞凋亡率均呈現(xiàn)上升趨勢。在24小時時，BMDCs與胃癌細胞比例為1:1的實驗組中，胃癌細胞凋亡率為[X1]%；比例為5:1的實驗組中，凋亡率為[X2]%；比例為10:1的實驗組中，凋亡率為[X3]%。到48小時，各比例組凋亡率進一步升高，分別達到[X4]%、[X5]%、[X6]%。72小時時，比例為1:1、5:1、10:1的實驗組胃癌細胞凋亡率分別為[X7]%、[X8]%、[X9]%?？梢悦黠@看出，隨著BMDCs與胃癌細胞比例的增加，胃癌細胞凋亡率顯著上升，且在相同比例下，隨著時間的推移，凋亡率也逐漸升高。這表明BMDCs能夠誘導胃癌細胞發(fā)生凋亡，且這種誘導作用與BMDCs的數(shù)量以及作用時間密切相關(guān)。在細胞存活率方面，MTT法檢測結(jié)果顯示出相似的趨勢。對照組（僅培養(yǎng)胃癌細胞）中，胃癌細胞在72小時內(nèi)呈現(xiàn)出穩(wěn)定的生長態(tài)勢，細胞存活率始終維持在較高水平。而在實驗組中，隨著共培養(yǎng)時間的延長，不同比例組的胃癌細胞存活率均逐漸降低。在24小時時，BMDCs與胃癌細胞比例為1:1的實驗組中，胃癌細胞存活率為[Y1]%；比例為5:1的實驗組中，存活率為[Y2]%；比例為10:1的實驗組中，存活率為[Y3]%。到48小時，各比例組存活率繼續(xù)下降，分別降至[Y4]%、[Y5]%、[Y6]%。72小時時，比例為1:1、5:1、10:1的實驗組胃癌細胞存活率分別為[Y7]%、[Y8]%、[Y9]%。這清晰地表明，BMDCs能夠有效抑制胃癌細胞的存活，隨著BMDCs數(shù)量的增加以及共培養(yǎng)時間的延長，對胃癌細胞存活的抑制作用愈發(fā)顯著。通過對實驗結(jié)果的深入分析可知，BMDCs對胃癌細胞的殺傷作用呈現(xiàn)出明顯的時間-劑量依賴關(guān)系。隨著BMDCs數(shù)量的增加，其與胃癌細胞接觸的概率增大，能夠更有效地遞呈腫瘤抗原，激活T淋巴細胞等免疫細胞，從而增強對胃癌細胞的殺傷能力。同時，隨著共培養(yǎng)時間的延長，免疫細胞與胃癌細胞之間的相互作用不斷增強，免疫應答逐漸放大，導致胃癌細胞凋亡率升高，存活率降低。這一結(jié)果為進一步研究BMDCs在胃癌免疫治療中的應用提供了重要的實驗依據(jù)。七、殺傷作用機制探究7.1免疫調(diào)節(jié)相關(guān)機制樹突狀細胞在激活T細胞的過程中，涉及一系列復雜且有序的步驟，這些步驟緊密相連，共同啟動和調(diào)節(jié)機體的抗腫瘤免疫應答。首先，樹突狀細胞攝取胃癌細胞釋放的腫瘤抗原，這一過程主要通過吞噬作用、巨胞飲作用以及受體介導的內(nèi)吞作用來實現(xiàn)。樹突狀細胞表面表達多種模式識別受體，如Toll樣受體（TLRs），能夠識別腫瘤抗原相關(guān)的分子模式，從而高效地攝取腫瘤抗原。在細胞內(nèi)，腫瘤抗原被轉(zhuǎn)運至溶酶體等細胞器中，經(jīng)過一系列蛋白酶的作用，被加工處理成短肽片段。這些短肽片段隨后與樹突狀細胞內(nèi)的主要組織相容性復合體（MHC）分子結(jié)合，形成抗原肽-MHC復合物。對于內(nèi)源性抗原，抗原肽與MHCⅠ類分子結(jié)合；而外源性抗原肽則與MHCⅡ類分子結(jié)合。這些復合物被轉(zhuǎn)運到樹突狀細胞表面，以供T細胞識別。當T細胞識別樹突狀細胞表面的抗原肽-MHC復合物時，T細胞表面的T細胞受體（TCR）與抗原肽-MHC復合物特異性結(jié)合，這是T細胞活化的第一信號。然而，僅有第一信號不足以完全激活T細胞，還需要第二信號，即共刺激信號。樹突狀細胞表面高表達共刺激分子，如CD80（B7-1）、CD86（B7-2）和CD40等。其中，CD80和CD86與T細胞表面的CD28分子結(jié)合，提供關(guān)鍵的共刺激信號。CD40則與T細胞表面的CD40L相互作用，進一步增強T細胞的活化。這些共刺激信號的提供，使得T細胞能夠被充分激活，進入細胞周期，開始增殖和分化。在這個過程中，樹突狀細胞還分泌多種細胞因子，如白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-12（IL-12）等，這些細胞因子在T細胞的增殖和分化中發(fā)揮重要作用。IL-12能夠促進初始T細胞向Th1細胞分化，Th1細胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子，介導細胞免疫應答。IL-6則參與T細胞的增殖和分化，促進T細胞的活化。在T細胞的增殖和分化過程中，初始T細胞在樹突狀細胞提供的信號和細胞因子的作用下，分化為不同的T細胞亞群，包括輔助性T細胞（Th）和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）。Th細胞又可進一步分為Th1、Th2、Th17等亞群，它們各自分泌不同的細胞因子，發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用。Th1細胞主要分泌IFN-γ、腫瘤壞死因子-β（TNF-β）等細胞因子。IFN-γ具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，它可以激活巨噬細胞，增強巨噬細胞的吞噬和殺傷能力，使其能夠更有效地清除腫瘤細胞。IFN-γ還能上調(diào)腫瘤細胞表面MHC分子的表達，增強腫瘤細胞的抗原呈遞能力，使腫瘤細胞更容易被T細胞識別和殺傷。同時，IFN-γ可以抑制Th2細胞的分化，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，有利于細胞免疫應答的進行。TNF-β則可以直接殺傷腫瘤細胞，或通過誘導腫瘤細胞凋亡來抑制腫瘤的生長。Th2細胞主要分泌白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）和白細胞介素-10（IL-10）等細胞因子，主要參與體液免疫應答，在抗腫瘤免疫中作用相對較弱。Th17細胞分泌白細胞介素-17（IL-17）等細胞因子，參與炎癥反應和免疫防御，在抗腫瘤免疫中也發(fā)揮一定的作用。CTL是直接殺傷腫瘤細胞的關(guān)鍵效應細胞，它能夠識別并結(jié)合腫瘤細胞表面的抗原肽-MHCⅠ類分子復合物，通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接殺傷腫瘤細胞。穿孔素能夠在腫瘤細胞膜上形成小孔，使顆粒酶等物質(zhì)進入腫瘤細胞內(nèi)，激活腫瘤細胞內(nèi)的凋亡信號通路，導致腫瘤細胞凋亡。T細胞分泌的細胞因子，如IFN-γ等，對胃癌細胞具有多方面的影響。IFN-γ可以誘導胃癌細胞發(fā)生細胞周期阻滯，使其停滯在G1期或G2期，從而抑制胃癌細胞的增殖。研究表明，IFN-γ能夠上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKIs）的表達，如p21和p27，這些抑制劑可以與細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）結(jié)合，抑制CDKs的活性，從而阻止細胞周期的進程。IFN-γ還可以誘導胃癌細胞凋亡，通過激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，如線粒體途徑和死亡受體途徑，促使胃癌細胞凋亡。在線粒體途徑中，IFN-γ可以誘導線粒體膜電位的改變，促使細胞色素c從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，激活caspase-9，進而激活下游的caspase-3等凋亡蛋白酶，導致細胞凋亡。在死亡受體途徑中，IFN-γ可以上調(diào)胃癌細胞表面死亡受體的表達，如Fas等，F(xiàn)as與FasL結(jié)合后，激活caspase-8，進而激活下游的凋亡蛋白酶，誘導細胞凋亡。此外，IFN-γ還可以抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力，通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)降解酶的表達，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，減少細胞外基質(zhì)的降解，從而抑制胃癌細胞的遷移和侵襲。7.2信號通路分析在樹突狀細胞與胃癌細胞的相互作用過程中，多條信號通路參與其中，它們相互交織，共同調(diào)節(jié)樹突狀細胞的功能以及對胃癌細胞的殺傷作用。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在樹突狀細胞的活化和功能調(diào)節(jié)中扮演著關(guān)鍵角色。該信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的分支。當樹突狀細胞攝取胃癌細胞抗原后，抗原信號通過模式識別受體（如Toll樣受體）傳遞，激活下游的一系列蛋白激酶。首先，接頭蛋白MyD88被招募到受體上，激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)激酶（IRAK），進而激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6激活轉(zhuǎn)化生長因子-β激活激酶1（TAK1），TAK1可以激活MAPK激酶激酶（MKKK），如Raf-1、MEKK1等。MKKK進一步激活MAPK激酶（MKK），其中Raf-1激活MEK1/2，MEK1/2激活ERK1/2；MEKK1激活MKK4和MKK7，MKK4激活JNK，MKK7激活p38MAPK。激活后的ERK1/2、JNK和p38MAPK轉(zhuǎn)位進入細胞核，磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Jun、ATF2等。這些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到特定的基因啟動子區(qū)域，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達。在樹突狀細胞中，MAPK信號通路的激活可以促進樹突狀細胞的成熟，上調(diào)共刺激分子（如CD80、CD86）和MHCⅡ類分子的表達，增強樹突狀細胞的抗原呈遞能力。研究表明，使用ERK1/2抑制劑可以顯著降低樹突狀細胞表面CD80和CD86的表達，抑制樹突狀細胞對T細胞的激活能力。此外，MAPK信號通路還參與調(diào)節(jié)樹突狀細胞分泌細胞因子，如IL-12、IL-6等，這些細胞因子在樹突狀細胞激活T細胞以及調(diào)節(jié)免疫應答中發(fā)揮重要作用。核因子-κB（NF-κB）信號通路同樣在樹突狀細胞的功能調(diào)節(jié)和抗腫瘤免疫中發(fā)揮著核心作用。在靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體（通常由p50和p65組成）與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細胞質(zhì)中。當樹突狀細胞受到胃癌細胞抗原或炎性細胞因子（如TNF-α、IL-1β）等刺激時，IκB激酶（IKK）復合物被激活。IKK復合物由IKKα、IKKβ和調(diào)節(jié)亞基NEMO組成，其中IKKβ在NF-κB激活中起主要作用。激活后的IKKβ磷酸化IκB，使其泛素化并被蛋白酶體降解