小白菊內(nèi)酯抑制肝癌細(xì)胞侵襲與遷移的機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義肝癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球肝癌新發(fā)病例約90.6萬例，死亡病例約83萬例，發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第6位，死亡率則高居第3位。在我國，肝癌的形勢更為嚴(yán)峻，由于乙肝病毒感染率較高、不良生活方式以及環(huán)境污染等因素的影響，我國肝癌的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)均占全球的一半以上，成為了亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。肝癌具有起病隱匿、惡性程度高、進(jìn)展迅速等特點(diǎn)，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)切除的最佳時(shí)機(jī)。即使部分患者能夠接受手術(shù)治療，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)也極高，5年生存率僅為12.1%左右。目前，肝癌的治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、介入治療、放射治療、化學(xué)治療、靶向治療和免疫治療等，但這些治療方法都存在一定的局限性，難以從根本上解決肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問題，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。腫瘤的侵襲和遷移是導(dǎo)致其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，也是影響肝癌患者生存的重要因素。在肝癌的侵襲和遷移過程中，癌細(xì)胞會(huì)突破基底膜的限制，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，形成新的轉(zhuǎn)移灶。這一過程涉及到多個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程和信號(hào)通路的調(diào)控，包括細(xì)胞外基質(zhì)的降解、細(xì)胞間黏附分子的改變、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）以及腫瘤血管生成等。深入研究肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制，對于開發(fā)新的治療靶點(diǎn)和策略，提高肝癌的治療效果具有重要的理論和實(shí)踐意義。小白菊內(nèi)酯（Parthenolide，PTL）是一種從傳統(tǒng)藥用植物小白菊（Tanacetumparthenium）中提取的天然倍半萜內(nèi)酯化合物，具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗菌、抗氧化、解熱、鎮(zhèn)痛等。近年來，越來越多的研究表明，小白菊內(nèi)酯在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力，能夠通過多種途徑抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期以及抑制腫瘤血管生成等。更為重要的是，小白菊內(nèi)酯對腫瘤細(xì)胞具有相對較高的選擇性，對正常細(xì)胞的毒性較小，這使得它成為了一種極具前景的天然抗腫瘤藥物。目前，關(guān)于小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及相關(guān)機(jī)制的研究還相對較少，且已有的研究結(jié)果尚存在一定的爭議和不足。因此，本研究旨在深入探討小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響及其潛在的分子機(jī)制，為肝癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。通過本研究，有望進(jìn)一步揭示小白菊內(nèi)酯的抗腫瘤作用機(jī)制，拓展其在肝癌治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景，為肝癌患者帶來新的希望和治療選擇。同時(shí)，本研究也有助于豐富對天然產(chǎn)物抗腫瘤作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為開發(fā)更多高效、低毒的天然抗腫瘤藥物提供思路和借鑒。1.2小白菊內(nèi)酯概述小白菊內(nèi)酯（Parthenolide，PTL）是從菊科植物小白菊（Tanacetumparthenium）中提取分離得到的一種倍半萜內(nèi)酯化合物，其化學(xué)名稱為（1R，2R，4aS，5R，7aR，8S，10aS，10bR）-2，3，6，7，7a，8，10a，10b-八氫-1a，5-二甲基-8-亞甲基環(huán)氧乙烷并（9，10）環(huán)癸并（1，2-b）呋喃-9（1aH）-酮，分子式為C??H??O?，分子量為248.32。小白菊作為一種傳統(tǒng)藥用植物，在民間被廣泛用于治療發(fā)熱、頭痛、關(guān)節(jié)炎等疾病，其主要活性成分小白菊內(nèi)酯也因此受到了科研人員的關(guān)注。小白菊內(nèi)酯具有廣泛的生物活性，在抗炎方面，它能夠抑制多種炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的激活，減少炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。在抗菌領(lǐng)域，小白菊內(nèi)酯對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌等多種病原菌具有一定的抑制作用，其抗菌機(jī)制可能與破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性、干擾細(xì)菌的代謝過程有關(guān)。此外，小白菊內(nèi)酯還具有抗氧化、解熱、鎮(zhèn)痛等活性，在醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。近年來，小白菊內(nèi)酯的抗腫瘤活性成為了研究的熱點(diǎn)。眾多研究表明，小白菊內(nèi)酯對多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、白血病等。在乳腺癌細(xì)胞中，小白菊內(nèi)酯能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過激活caspase-3、caspase-8、caspase-9等凋亡相關(guān)蛋白酶，切割多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP），促使細(xì)胞發(fā)生凋亡；同時(shí)，它還能阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，抑制細(xì)胞的增殖。對于肺癌細(xì)胞，小白菊內(nèi)酯不僅可以抑制細(xì)胞的增殖和遷移，還能通過調(diào)節(jié)線粒體途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，如Bcl-2、Bax等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在胃癌細(xì)胞中，小白菊內(nèi)酯能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的活性，減少抗凋亡蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)促凋亡蛋白的作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長。在肝癌的研究中，已有一些報(bào)道顯示小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞具有抑制作用。有研究表明小白菊內(nèi)酯能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯可以抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，目前關(guān)于小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移影響的具體分子機(jī)制尚未完全明確，仍需要進(jìn)一步深入研究。1.3肝癌細(xì)胞侵襲和遷移機(jī)制簡述肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移是一個(gè)極其復(fù)雜且多步驟的過程，涉及到多個(gè)分子和信號(hào)通路的調(diào)控，對肝癌病情的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。這一過程不僅是肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因，也是導(dǎo)致肝癌治療失敗和患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素。在侵襲和遷移過程中，肝癌細(xì)胞首先需要突破細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的限制。細(xì)胞外基質(zhì)是由膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等多種成分組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，它不僅為細(xì)胞提供物理支撐，還參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)過程。肝癌細(xì)胞通過分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等，降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，從而為自身的遷移開辟道路。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶家族是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白質(zhì)，如MMP-2和MMP-9可以降解IV型膠原蛋白，而IV型膠原蛋白是基底膜的主要成分之一，其降解使得肝癌細(xì)胞能夠突破基底膜的屏障，侵入周圍組織。細(xì)胞間黏附分子的改變也是肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的重要環(huán)節(jié)。正常情況下，上皮細(xì)胞之間通過多種黏附分子緊密連接在一起，形成穩(wěn)定的組織結(jié)構(gòu)。然而，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，癌細(xì)胞會(huì)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），這是一個(gè)上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間黏附特性，獲得間質(zhì)細(xì)胞特征的過程。在EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)顯著下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白如N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等的表達(dá)則明顯上調(diào)。E-鈣黏蛋白是一種重要的細(xì)胞間黏附分子，它通過介導(dǎo)同型細(xì)胞間的黏附作用，維持上皮細(xì)胞的正常形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)。其表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力減弱，使得肝癌細(xì)胞能夠脫離原有的細(xì)胞群體，獲得遷移和侵襲能力。相反，N-鈣黏蛋白和波形蛋白等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的上調(diào)則賦予肝癌細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，它們能夠促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和變形能力。腫瘤血管生成在肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移中也扮演著不可或缺的角色。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，以獲取營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并排出代謝廢物。當(dāng)腫瘤組織生長到一定大小后，其內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)缺氧微環(huán)境，這種缺氧信號(hào)會(huì)刺激腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等分泌多種血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等。這些血管生成因子可以作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、遷移和管腔形成，從而誘導(dǎo)新生血管的生成。新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供了營養(yǎng)支持，還為肝癌細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供了通道。肝癌細(xì)胞可以通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，穿過血管壁進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到其他器官和組織，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。多條信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞侵襲和遷移過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。其中，PI3K/AKT信號(hào)通路是一條經(jīng)典的促癌信號(hào)通路，在肝癌中常常處于激活狀態(tài)。PI3K可以被多種上游信號(hào)分子激活，如生長因子受體、整合素等。激活后的PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使可以招募AKT到細(xì)胞膜上，并在PDK1等激酶的作用下使AKT發(fā)生磷酸化而激活。激活的AKT可以通過多種途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移，一方面，它可以直接磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、FoxO等，調(diào)節(jié)它們的活性，進(jìn)而調(diào)控與細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)基因的表達(dá)；另一方面，AKT還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的磷酸化狀態(tài)，影響細(xì)胞骨架的重組和動(dòng)態(tài)變化，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。MAPK信號(hào)通路也是調(diào)控肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的重要信號(hào)通路之一，它主要包括ERK、JNK和p38MAPK三條亞通路。在肝癌細(xì)胞中，生長因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激刺激等多種因素都可以激活MAPK信號(hào)通路。以ERK通路為例，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，Ras蛋白被激活，進(jìn)而依次激活Raf、MEK和ERK等激酶，形成一個(gè)級(jí)聯(lián)放大的信號(hào)傳導(dǎo)過程。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等，調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲相關(guān)基因的表達(dá)。研究表明，ERK信號(hào)通路的激活與肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)密切相關(guān)，抑制ERK信號(hào)通路的活性可以顯著降低肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞系本研究選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和Bel-7402。HepG2細(xì)胞系來源于一位男性患者的肝癌組織，具有上皮細(xì)胞形態(tài)，其特點(diǎn)是高增殖潛能和穩(wěn)定的生長特性，在肝癌研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，常被用于藥物篩選和機(jī)理研究。由于其生物學(xué)特性相對穩(wěn)定，易于在體外培養(yǎng)和傳代，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)提供較為穩(wěn)定和可靠的細(xì)胞模型，便于研究人員深入探究各種因素對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。Bel-7402細(xì)胞系則來自一位男性肝癌患者的腹腔積液，呈多邊形形態(tài)，生長穩(wěn)定且容易培養(yǎng)。它在肝癌研究中也具有獨(dú)特的優(yōu)勢，例如對某些藥物的敏感性與其他細(xì)胞系有所不同，這使得它能夠從不同角度為肝癌的研究提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。這兩種細(xì)胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），在實(shí)驗(yàn)前，對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)和鑒定，確保細(xì)胞的質(zhì)量和活性符合實(shí)驗(yàn)要求。2.1.2試劑與儀器小白菊內(nèi)酯（Parthenolide，PTL）購自南京春秋生物工程有限公司，純度≥98%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在避光、低溫條件下保存，使用時(shí)用DMSO溶解配制成所需濃度的儲(chǔ)存液，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求用培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)工作濃度。實(shí)驗(yàn)所需其他試劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），這兩種培養(yǎng)基能夠?yàn)楦伟┘?xì)胞的生長提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），富含多種生長因子和營養(yǎng)成分，有助于細(xì)胞的增殖和存活；胰蛋白酶（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，美國Gibco公司），用于細(xì)胞的消化傳代，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，便于進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（美國Gibco公司），可有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性；MTT試劑（美國Sigma公司），其檢測原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，通過檢測甲瓚的生成量來間接反映活細(xì)胞數(shù)量；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），用于溶解MTT還原生成的甲瓚，以便在酶標(biāo)儀上進(jìn)行吸光度檢測；Transwell小室（美國Corning公司），用于細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)，通過小室上下室之間的膜來模擬體內(nèi)的生理屏障，研究細(xì)胞穿越膜的能力；Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司），鋪在Transwell小室的上室底部，可模擬細(xì)胞外基質(zhì)，用于細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞降解基質(zhì)膠并穿過膜的能力；兔抗人E-cadherin抗體、兔抗人N-cadherin抗體、兔抗人Vimentin抗體（美國CellSignalingTechnology公司），這些抗體可特異性地識(shí)別相應(yīng)的蛋白，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（美國JacksonImmunoResearch公司），作為二抗，與一抗結(jié)合后，通過HRP催化底物顯色，實(shí)現(xiàn)對目的蛋白的檢測；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國ThermoFisherScientific公司），利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光信號(hào)來檢測Westernblot實(shí)驗(yàn)中的目的蛋白條帶，具有高靈敏度和低背景的特點(diǎn)。主要儀器設(shè)備包括：二氧化碳培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和二氧化碳濃度（5%）環(huán)境，滿足細(xì)胞生長的需求；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過過濾空氣中的塵埃和微生物，創(chuàng)造一個(gè)無菌的操作環(huán)境，確保細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作過程不受污染；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況等，實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞的生長情況；酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），可在特定波長下檢測樣品的吸光度值，用于MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞活力的測定；高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），能夠在低溫條件下對樣品進(jìn)行高速離心，用于細(xì)胞的收集、蛋白質(zhì)和核酸的提取等實(shí)驗(yàn)操作；垂直電泳系統(tǒng)和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和轉(zhuǎn)膜過程，將蛋白質(zhì)分離并轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便后續(xù)進(jìn)行免疫檢測；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），用于檢測Westernblot實(shí)驗(yàn)中ECL化學(xué)發(fā)光信號(hào)，拍攝目的蛋白條帶的圖像，并進(jìn)行定量分析。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞株從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內(nèi)完全解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，以去除凍存液中的DMSO。用新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度至合適濃度，接種于T25培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻，使細(xì)胞均勻分布。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1-2天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕輕潤洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和血清。加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，覆蓋細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫離瓶壁時(shí)，迅速加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫落并形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用適量的新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，按照1:2或1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量的培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度（0、5、10、20、40μM）的小白菊內(nèi)酯處理細(xì)胞，對照組則加入等體積的DMSO溶劑處理細(xì)胞。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在加入小白菊內(nèi)酯或DMSO后，繼續(xù)將細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)檢測。2.2.2MTT實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液消化，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔加入100μL，即每孔接種5000個(gè)細(xì)胞。將96孔板置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，吸棄96孔板中的舊培養(yǎng)基，按照實(shí)驗(yàn)分組，實(shí)驗(yàn)組分別加入含有不同濃度（0、5、10、20、40μM）小白菊內(nèi)酯的RPMI-1640培養(yǎng)基，對照組加入含有等體積DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基，每孔加入100μL，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸棄96孔板中的上清液，注意避免吸到細(xì)胞沉淀，每孔加入150μL的DMSO，置于搖床上，低速震蕩10分鐘，使結(jié)晶的甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），記錄數(shù)據(jù)。根據(jù)測得的OD值，按照公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。通過比較不同濃度小白菊內(nèi)酯處理組與對照組的細(xì)胞存活率，分析小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞增殖的影響。2.2.3劃痕試驗(yàn)在6孔板底面，用馬克筆沿著直尺均勻地劃三條橫線，使橫線橫穿過孔，每孔至少穿過5條線，作為后續(xù)劃痕和拍照的參考標(biāo)記。取對數(shù)生長期的HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?/孔，將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔加入適量的完全培養(yǎng)基，輕輕搖勻，使細(xì)胞均勻分布。將6孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿孔底（匯合度達(dá)到100%）。待細(xì)胞長滿后，用直尺比著，將200μL槍頭垂直于孔板和底面畫的標(biāo)記線劃兩條垂線，使劃痕與標(biāo)記線相交，形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測點(diǎn)。劃痕時(shí)，注意保持槍頭垂直，力度均勻，以確保劃痕寬度一致。棄去6孔板中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤洗細(xì)胞2-3次，去除劃下的細(xì)胞，避免對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。按照實(shí)驗(yàn)分組，分別加入含不同濃度小白菊內(nèi)酯的無血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基（對照組），每孔加入適量體積。劃痕、清洗、加液完成后，立即用顯微鏡在低倍鏡下拍攝不同倍數(shù)的照片，記錄劃痕的初始寬度，作為0h對照。將6孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)（如6、12、24小時(shí)）取出6孔板，在顯微鏡下觀察同一位置劃痕的寬度，并拍照記錄。使用ImageJ軟件對照片進(jìn)行分析，測量不同時(shí)間點(diǎn)劃痕的寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移距離，公式為：細(xì)胞遷移距離=0h劃痕寬度-th劃痕寬度。通過比較不同濃度小白菊內(nèi)酯處理組與對照組細(xì)胞的遷移距離，評(píng)估小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。2.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel基質(zhì)膠在4℃冰箱中過夜融化，用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基按照1:8的比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。取適量稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入Transwell小室的上室底部，均勻鋪展，使其形成一層薄膜，將Transwell小室置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)，使Matrigel基質(zhì)膠凝固。取對數(shù)生長期的HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。將細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，每室加入100μL，下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。按照實(shí)驗(yàn)分組，實(shí)驗(yàn)組在上室細(xì)胞懸液中加入不同濃度的小白菊內(nèi)酯，對照組加入等體積的DMSO，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞。將Transwell小室放入甲醇中固定15分鐘，然后用結(jié)晶紫染液染色15分鐘。用PBS緩沖液沖洗Transwell小室數(shù)次，去除多余的染液。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過Matrigel基質(zhì)膠并附著在下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量。通過比較不同濃度小白菊內(nèi)酯處理組與對照組下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量，探究小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)步驟與細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)類似，不同之處在于Transwell小室的上室底部無需鋪Matrigel基質(zhì)膠。取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。將細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，每室加入100μL，下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基作為趨化因子。按照實(shí)驗(yàn)分組，實(shí)驗(yàn)組在上室細(xì)胞懸液中加入不同濃度的小白菊內(nèi)酯，對照組加入等體積的DMSO，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞。將Transwell小室放入甲醇中固定15分鐘，然后用結(jié)晶紫染液染色15分鐘。用PBS緩沖液沖洗Transwell小室數(shù)次，去除多余的染液。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過膜并附著在下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量。通過比較不同濃度小白菊內(nèi)酯處理組與對照組下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量，評(píng)估小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響。2.2.5Westernblotting實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)分組，實(shí)驗(yàn)組用不同濃度的小白菊內(nèi)酯處理，對照組用DMSO處理，處理時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕潤洗細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基。向培養(yǎng)瓶中加入適量的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），置于冰上裂解30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞充分裂解。用細(xì)胞刮將裂解后的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上刮下，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，在37℃孵育30分鐘，使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按照4:1的比例混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。配制10%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣到凝膠孔中，同時(shí)上樣蛋白Marker。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，初始電壓為80V，當(dāng)?shù)鞍讟悠愤M(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。準(zhǔn)備PVDF膜和濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡15秒使其活化，然后將PVDF膜、濾紙和凝膠按照“負(fù)極-濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙-正極”的順序放入轉(zhuǎn)膜裝置中，確保各層之間無氣泡。在恒流條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電流為300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入含有兔抗人E-cadherin抗體、兔抗人N-cadherin抗體、兔抗人Vimentin抗體（一抗）的稀釋液中，4℃孵育過夜，一抗的稀釋比例按照抗體說明書進(jìn)行。孵育過夜后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。將PVDF膜放入含有HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（二抗）的稀釋液中，室溫孵育1小時(shí)，二抗的稀釋比例按照抗體說明書進(jìn)行。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。將PVDF膜放入ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒的發(fā)光液中，孵育1-2分鐘，然后將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，拍攝目的蛋白條帶的圖像。使用ImageJ軟件對目的蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量，公式為：目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。通過比較不同濃度小白菊內(nèi)酯處理組與對照組目的蛋白的相對表達(dá)量，分析小白菊內(nèi)酯對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。2.3數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以確保數(shù)據(jù)處理的準(zhǔn)確性和可靠性。對于計(jì)量資料，如細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移距離、侵襲細(xì)胞數(shù)量以及蛋白相對表達(dá)量等，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析前，首先通過Shapiro-Wilk檢驗(yàn)判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較則采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當(dāng)方差分析結(jié)果顯示存在組間差異時(shí)，進(jìn)一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進(jìn)行多重比較，以確定具體哪些組之間存在顯著差異。若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，如Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比較，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)用于兩組間比較。通過這些嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)分析方法，能夠準(zhǔn)確揭示小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲、遷移等生物學(xué)行為的影響，以及相關(guān)蛋白表達(dá)變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為研究結(jié)論提供有力的數(shù)據(jù)支持。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞增殖的影響通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度小白菊內(nèi)酯（0、5、10、20、40μM）處理HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞24、48和72小時(shí)后的細(xì)胞增殖情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞存活率表示，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中，與對照組（0μM小白菊內(nèi)酯，即DMSO處理組）相比，5μM小白菊內(nèi)酯處理24小時(shí)后，細(xì)胞存活率為（73.3±4.5）%，抑制率達(dá)26.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞存活率逐漸降低，呈明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。當(dāng)小白菊內(nèi)酯濃度為40μM，作用72小時(shí)后，細(xì)胞存活率僅為（18.5±3.2）%，抑制率高達(dá)81.5%，與對照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），具體數(shù)據(jù)如表1所示。<插入表1：小白菊內(nèi)酯對HepG2細(xì)胞增殖的影響（x±s，n=6）>在Bel-7402細(xì)胞中，同樣觀察到小白菊內(nèi)酯對細(xì)胞增殖的顯著抑制作用。5μM小白菊內(nèi)酯處理24小時(shí)后，細(xì)胞存活率為（68.6±5.1）%，抑制率為31.4%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著濃度的遞增和時(shí)間的延長，細(xì)胞存活率持續(xù)下降，40μM小白菊內(nèi)酯處理72小時(shí)后，細(xì)胞存活率降至（15.8±2.8）%，抑制率達(dá)到84.2%，與對照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2。<插入表2：小白菊內(nèi)酯對Bel-7402細(xì)胞增殖的影響（x±s，n=6）>上述MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小白菊內(nèi)酯能夠有效抑制HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用隨著小白菊內(nèi)酯濃度的升高和作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。這一結(jié)果與以往相關(guān)研究中關(guān)于小白菊內(nèi)酯對其他腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用的報(bào)道相一致，進(jìn)一步證實(shí)了小白菊內(nèi)酯在肝癌治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。3.2小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響為了進(jìn)一步探究小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，本研究采用了劃痕試驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)。劃痕試驗(yàn)是一種簡單直觀的檢測細(xì)胞遷移能力的方法，通過在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)對劃痕的愈合情況，從而評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。在HepG2細(xì)胞的劃痕試驗(yàn)中，對照組在24小時(shí)后劃痕愈合明顯，細(xì)胞遷移距離較大；而實(shí)驗(yàn)組隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，劃痕愈合程度逐漸降低。具體數(shù)據(jù)顯示，5μM小白菊內(nèi)酯處理組細(xì)胞遷移距離為（21.5±2.3）μm，抑制率為29.1%；10μM處理組細(xì)胞遷移距離為（18.7±2.0）μm，抑制率為34.9%；20μM處理組細(xì)胞遷移距離為（13.9±1.8）μm，抑制率達(dá)到43.2%，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），具體數(shù)據(jù)見表3。<插入表3：小白菊內(nèi)酯對HepG2細(xì)胞遷移的影響（x±s，n=3）>在Bel-7402細(xì)胞的劃痕試驗(yàn)中，也得到了類似的結(jié)果。對照組細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)快速遷移，使劃痕顯著縮?。欢“拙諆?nèi)酯處理組細(xì)胞遷移受到明顯抑制。5μM小白菊內(nèi)酯處理組細(xì)胞遷移距離為（20.8±2.1）μm，抑制率為28.7%；10μM處理組細(xì)胞遷移距離為（16.9±1.9）μm，抑制率為37.1%；20μM處理組細(xì)胞遷移距離為（11.7±1.6）μm，抑制率高達(dá)46.2%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳細(xì)數(shù)據(jù)見表4。<插入表4：小白菊內(nèi)酯對Bel-7402細(xì)胞遷移的影響（x±s，n=3）>Transwell實(shí)驗(yàn)則可用于檢測細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，Transwell小室的上室鋪有Matrigel基質(zhì)膠，模擬體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細(xì)胞才能降解基質(zhì)膠并穿過膜到達(dá)下室；在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，小室上室則無需鋪Matrigel基質(zhì)膠，細(xì)胞可直接穿過膜到達(dá)下室。在HepG2細(xì)胞的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，對照組下室膜表面的侵襲細(xì)胞數(shù)較多，為（186.3±15.2）個(gè)；而隨著小白菊內(nèi)酯濃度的升高，侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少。5μM小白菊內(nèi)酯處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為（132.5±12.1）個(gè)，抑制率為28.9%；10μM處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為（98.6±10.5）個(gè)，抑制率為47.1%；20μM處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為（62.8±8.3）個(gè)，抑制率達(dá)到66.3%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），具體數(shù)據(jù)如表5所示。<插入表5：小白菊內(nèi)酯對HepG2細(xì)胞侵襲的影響（x±s，n=3）>在Bel-7402細(xì)胞的Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，對照組下室膜表面的侵襲細(xì)胞數(shù)為（192.6±16.3）個(gè)，小白菊內(nèi)酯處理組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少。5μM小白菊內(nèi)酯處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為（137.2±13.0）個(gè)，抑制率為28.8%；10μM處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為（103.4±11.2）個(gè)，抑制率為46.3%；20μM處理組侵襲細(xì)胞數(shù)為（68.5±9.1）個(gè)，抑制率達(dá)到64.4%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），具體數(shù)據(jù)見表6。<插入表6：小白菊內(nèi)酯對Bel-7402細(xì)胞侵襲的影響（x±s，n=3）>在HepG2細(xì)胞的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，對照組下室膜表面的遷移細(xì)胞數(shù)為（213.5±18.1）個(gè)，隨著小白菊內(nèi)酯濃度增加，遷移細(xì)胞數(shù)逐漸下降。5μM小白菊內(nèi)酯處理組遷移細(xì)胞數(shù)為（158.6±14.5）個(gè)，抑制率為25.7%；10μM處理組遷移細(xì)胞數(shù)為（115.4±12.0）個(gè)，抑制率為46.0%；20μM處理組遷移細(xì)胞數(shù)為（75.3±9.8）個(gè)，抑制率達(dá)到64.7%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），具體數(shù)據(jù)如表7所示。<插入表7：小白菊內(nèi)酯對HepG2細(xì)胞遷移的影響（x±s，n=3）>在Bel-7402細(xì)胞的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，對照組下室膜表面的遷移細(xì)胞數(shù)為（220.8±19.0）個(gè)，小白菊內(nèi)酯處理組遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少。5μM小白菊內(nèi)酯處理組遷移細(xì)胞數(shù)為（165.2±15.2）個(gè)，抑制率為25.2%；10μM處理組遷移細(xì)胞數(shù)為（121.6±12.8）個(gè)，抑制率為45.0%；20μM處理組遷移細(xì)胞數(shù)為（81.5±10.5）個(gè)，抑制率達(dá)到63.1%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳細(xì)數(shù)據(jù)見表8。<插入表8：小白菊內(nèi)酯對Bel-7402細(xì)胞遷移的影響（x±s，n=3）>劃痕試驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小白菊內(nèi)酯能夠顯著抑制HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，且這種抑制作用呈濃度依賴性。這說明小白菊內(nèi)酯可能通過抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移，從而減少腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，為其在肝癌治療中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.3小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響為了深入探究小白菊內(nèi)酯抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制，采用Westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測了與肝癌細(xì)胞侵襲和遷移密切相關(guān)的蛋白表達(dá)變化，包括基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9。MMP-2和MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)中的IV型膠原蛋白等成分，在肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IV型膠原蛋白是基底膜的主要組成部分，其降解為肝癌細(xì)胞突破基底膜、侵入周圍組織提供了必要條件。在HepG2細(xì)胞中，與對照組相比，隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低，呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。當(dāng)小白菊內(nèi)酯濃度為5μM時(shí)，MMP-2蛋白的表達(dá)量為對照組的（50.4±5.2）%，降低了49.6%；MMP-9蛋白的表達(dá)量為對照組的（62.6±6.0）%，降低了37.4%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)小白菊內(nèi)酯濃度升高至20μM時(shí)，MMP-2蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步下降至對照組的（21.5±3.0）%，抑制率達(dá)到78.5%；MMP-9蛋白的表達(dá)量降至對照組的（30.2±4.5）%，抑制率為69.8%，與對照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），具體數(shù)據(jù)如表9所示，蛋白條帶圖見圖1。<插入表9：小白菊內(nèi)酯對HepG2細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響（x±s，n=3）><插入圖1：小白菊內(nèi)酯對HepG2細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)影響的Westernblotting條帶圖>在Bel-7402細(xì)胞中，也觀察到了類似的結(jié)果。小白菊內(nèi)酯能夠顯著抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，且抑制作用隨濃度的增加而增強(qiáng)。5μM小白菊內(nèi)酯處理后，MMP-2蛋白的表達(dá)量為對照組的（44.8±4.8）%，抑制率為55.2%；MMP-9蛋白的表達(dá)量為對照組的（60.1±5.8）%，抑制率為39.9%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)小白菊內(nèi)酯濃度為20μM時(shí)，MMP-2蛋白的表達(dá)量降至對照組的（18.6±2.8）%，抑制率高達(dá)81.4%；MMP-9蛋白的表達(dá)量降至對照組的（27.5±4.0）%，抑制率為72.5%，與對照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），具體數(shù)據(jù)見表10，蛋白條帶圖見圖2。<插入表10：小白菊內(nèi)酯對Bel-7402細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響（x±s，n=3）><插入圖2：小白菊內(nèi)酯對Bel-7402細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)影響的Westernblotting條帶圖>上述Westernblotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小白菊內(nèi)酯能夠有效抑制HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)，且這種抑制作用呈明顯的濃度依賴性。由于MMP-2和MMP-9在肝癌細(xì)胞侵襲和遷移過程中起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，小白菊內(nèi)酯對它們表達(dá)的抑制可能是其抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的重要機(jī)制之一。通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，小白菊內(nèi)酯可以減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而阻礙肝癌細(xì)胞突破基底膜和周圍組織的屏障，降低其侵襲和遷移能力。四、討論4.1小白菊內(nèi)酯抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用驗(yàn)證本研究通過劃痕試驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，明確了小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移具有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。這一結(jié)果為小白菊內(nèi)酯在肝癌治療中的潛在應(yīng)用提供了關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在肝癌的研究領(lǐng)域中具有重要的理論和實(shí)踐意義。在劃痕試驗(yàn)中，作為一種經(jīng)典且直觀的細(xì)胞遷移檢測方法，它模擬了細(xì)胞在二維平面上的遷移過程。通過在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞在一定時(shí)間內(nèi)對劃痕的愈合情況，從而有效評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。在本實(shí)驗(yàn)中，對照組肝癌細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)能夠快速遷移，使劃痕明顯愈合，這充分展示了肝癌細(xì)胞強(qiáng)大的遷移活性。而隨著小白菊內(nèi)酯濃度的逐漸增加，劃痕愈合程度顯著降低，細(xì)胞遷移距離明顯縮短。以HepG2細(xì)胞為例，5μM小白菊內(nèi)酯處理組細(xì)胞遷移距離為（21.5±2.3）μm，抑制率達(dá)到29.1%；當(dāng)濃度升高至20μM時(shí)，細(xì)胞遷移距離僅為（13.9±1.8）μm，抑制率高達(dá)43.2%。Bel-7402細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢，5μM小白菊內(nèi)酯處理組細(xì)胞遷移距離為（20.8±2.1）μm，抑制率為28.7%；20μM處理組細(xì)胞遷移距離降至（11.7±1.6）μm，抑制率達(dá)到46.2%。這些數(shù)據(jù)清晰地表明，小白菊內(nèi)酯能夠有效抑制肝癌細(xì)胞在二維平面上的遷移能力，且抑制效果隨著濃度的增加而增強(qiáng)。Transwell實(shí)驗(yàn)則從更接近體內(nèi)生理環(huán)境的角度，對細(xì)胞的侵襲和遷移能力進(jìn)行了檢測。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，Transwell小室的上室鋪有Matrigel基質(zhì)膠，它模擬了體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，只有具備侵襲能力的細(xì)胞才能降解基質(zhì)膠并穿過膜到達(dá)下室。本研究結(jié)果顯示，對照組下室膜表面的侵襲細(xì)胞數(shù)較多，而小白菊內(nèi)酯處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)隨著濃度的升高而逐漸減少。在HepG2細(xì)胞中，對照組侵襲細(xì)胞數(shù)為（186.3±15.2）個(gè)，5μM小白菊內(nèi)酯處理組侵襲細(xì)胞數(shù)降至（132.5±12.1）個(gè)，抑制率為28.9%；20μM處理組侵襲細(xì)胞數(shù)僅為（62.8±8.3）個(gè)，抑制率高達(dá)66.3%。Bel-7402細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之類似，對照組侵襲細(xì)胞數(shù)為（192.6±16.3）個(gè)，20μM小白菊內(nèi)酯處理組侵襲細(xì)胞數(shù)減少至（68.5±9.1）個(gè)，抑制率達(dá)到64.4%。這充分說明小白菊內(nèi)酯能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)并穿過膜的侵襲能力，有效阻礙了肝癌細(xì)胞突破基底膜和周圍組織屏障的過程。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，Transwell小室的上室無需鋪Matrigel基質(zhì)膠，細(xì)胞可直接穿過膜到達(dá)下室。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小白菊內(nèi)酯同樣能夠抑制肝癌細(xì)胞在這種條件下的遷移能力。以HepG2細(xì)胞為例，對照組下室膜表面的遷移細(xì)胞數(shù)為（213.5±18.1）個(gè)，5μM小白菊內(nèi)酯處理組遷移細(xì)胞數(shù)減少至（158.6±14.5）個(gè)，抑制率為25.7%；20μM處理組遷移細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步降至（75.3±9.8）個(gè)，抑制率達(dá)到64.7%。Bel-7402細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)也得到了相似的結(jié)果，對照組遷移細(xì)胞數(shù)為（220.8±19.0）個(gè)，20μM小白菊內(nèi)酯處理組遷移細(xì)胞數(shù)為（81.5±10.5）個(gè)，抑制率達(dá)到63.1%。綜合劃痕試驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用得到了充分驗(yàn)證。這一發(fā)現(xiàn)與以往相關(guān)研究中關(guān)于小白菊內(nèi)酯對其他腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移抑制作用的報(bào)道具有一致性。有研究表明，小白菊內(nèi)酯能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)，改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力，從而減少乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在肺癌細(xì)胞的研究中，小白菊內(nèi)酯也被發(fā)現(xiàn)可以抑制細(xì)胞的侵襲和遷移，其機(jī)制可能與抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程有關(guān)，通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，阻止肺癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，進(jìn)而降低其侵襲和遷移能力。這些研究結(jié)果共同表明，小白菊內(nèi)酯對多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移具有抑制作用，具有潛在的抗腫瘤應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果還為進(jìn)一步深入探究小白菊內(nèi)酯抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。通過明確小白菊內(nèi)酯的這一作用，我們可以有針對性地從多個(gè)角度開展機(jī)制研究，如探討小白菊內(nèi)酯對相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用、對細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的影響以及對細(xì)胞間黏附分子的調(diào)節(jié)等。這不僅有助于揭示小白菊內(nèi)酯在肝癌治療中的作用機(jī)制，為開發(fā)新型肝癌治療藥物提供理論支持，還可能為其他惡性腫瘤的治療研究提供有益的借鑒和思路。4.2小白菊內(nèi)酯作用機(jī)制探討本研究通過Westernblotting實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)，且呈明顯的濃度依賴性，這一結(jié)果與肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的降低密切相關(guān)，揭示了小白菊內(nèi)酯抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的重要作用機(jī)制。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶家族，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過程中扮演著關(guān)鍵角色。其中，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成員，它們能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，尤其是IV型膠原蛋白，而IV型膠原蛋白是基底膜的主要組成部分。在正常生理狀態(tài)下，MMPs的表達(dá)和活性受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，特別是肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移過程中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)和活性常常異常升高。它們通過降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，為肝癌細(xì)胞突破組織屏障、侵入周圍組織和血管創(chuàng)造條件，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。已有大量研究表明，MMP-2和MMP-9的高表達(dá)與肝癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。在臨床肝癌組織樣本中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織，且其高表達(dá)往往預(yù)示著腫瘤更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的生存期更短。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過表達(dá)MMP-2和MMP-9能夠顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，而抑制它們的表達(dá)或活性則可以有效降低肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在本研究中，隨著小白菊內(nèi)酯濃度的增加，HepG2和Bel-7402肝癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平顯著降低。在HepG2細(xì)胞中，5μM小白菊內(nèi)酯處理后，MMP-2蛋白的表達(dá)量降低了49.6%，MMP-9蛋白的表達(dá)量降低了37.4%；當(dāng)小白菊內(nèi)酯濃度升高至20μM時(shí)，MMP-2蛋白的表達(dá)量進(jìn)一步下降至對照組的21.5%，MMP-9蛋白的表達(dá)量降至對照組的30.2%。Bel-7402細(xì)胞也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢，20μM小白菊內(nèi)酯處理后，MMP-2蛋白的表達(dá)量抑制率高達(dá)81.4%，MMP-9蛋白的表達(dá)量抑制率為72.5%。這種濃度依賴性的抑制作用表明，小白菊內(nèi)酯可能通過直接或間接的方式調(diào)控MMP-2和MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄或蛋白合成過程。從分子機(jī)制角度來看，小白菊內(nèi)酯可能作用于相關(guān)的信號(hào)通路，影響轉(zhuǎn)錄因子與MMP-2和MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，從而抑制其轉(zhuǎn)錄過程。已有研究報(bào)道，小白菊內(nèi)酯可以抑制NF-κB信號(hào)通路的活性，而NF-κB是調(diào)控MMP-2和MMP-9表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。小白菊內(nèi)酯可能通過抑制NF-κB的活化，減少其與MMP-2和MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，進(jìn)而降低它們的轉(zhuǎn)錄水平，最終導(dǎo)致蛋白表達(dá)量的下降。小白菊內(nèi)酯對MMP-2和MMP-9表達(dá)的抑制作用與肝癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的降低之間存在緊密的因果關(guān)系。由于MMP-2和MMP-9在肝癌細(xì)胞侵襲和遷移過程中起著關(guān)鍵的促進(jìn)作用，小白菊內(nèi)酯抑制它們的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力明顯減弱。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，Matrigel基質(zhì)膠模擬了體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，小白菊內(nèi)酯處理后，肝癌細(xì)胞降解Matrigel基質(zhì)膠并穿過膜到達(dá)下室的能力顯著下降，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少。在劃痕試驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，小白菊內(nèi)酯處理組的肝癌細(xì)胞遷移能力也受到明顯抑制，遷移距離縮短，遷移細(xì)胞數(shù)減少。這一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小白菊內(nèi)酯通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，有效地阻礙了肝癌細(xì)胞突破基底膜和周圍組織的屏障，從而降低了肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。本研究結(jié)果與以往相關(guān)研究中關(guān)于其他藥物或因素對肝癌細(xì)胞MMPs表達(dá)及侵襲遷移能力影響的報(bào)道具有一致性。有研究表明，一些天然化合物如姜黃素、槲皮素等也能夠通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。姜黃素可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路，抑制NF-κB的活化，從而降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)，減少肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。槲皮素則可以通過抑制MMP-2和MMP-9的活性，阻礙肝癌細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。這些研究結(jié)果共同表明，抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)或活性是抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的重要策略之一，而小白菊內(nèi)酯正是通過這一機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤作用。4.3與其他肝癌治療研究的對比分析目前，肝癌的治療方法眾多，包括手術(shù)切除、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但這些方法都存在一定的局限性。手術(shù)切除是肝癌的主要治療手段之一，對于早期肝癌患者，手術(shù)切除可以達(dá)到根治的效果。然而，由于肝癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)。即使部分患者能夠接受手術(shù)治療，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)也較高?；熓峭ㄟ^使用化學(xué)藥物來殺死癌細(xì)胞，但化療藥物往往缺乏特異性，在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等。此外，肝癌細(xì)胞對化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性，使得化療的療效受到限制。放療是利用高能射線殺死癌細(xì)胞，但放療也會(huì)對周圍正常組織造成損傷，引起放射性肝炎、肝衰竭等并發(fā)癥。靶向治療是針對腫瘤細(xì)胞的特定分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療，具有較高的特異性和療效。然而，目前肝癌的靶向藥物種類有限，且部分患者對靶向藥物不敏感或會(huì)產(chǎn)生耐藥性。免疫治療是通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來攻擊癌細(xì)胞，但免疫治療的有效率較低，且存在免疫相關(guān)不良反應(yīng)。與上述傳統(tǒng)肝癌治療方法相比，小白菊內(nèi)酯作為一種天然的抗腫瘤化合物，具有獨(dú)特的優(yōu)勢。首先，小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞具有顯著的抑制侵襲和遷移作用，且對正常細(xì)胞的毒性較小。這與化療藥物對正常細(xì)胞和癌細(xì)胞無選擇性殺傷的特點(diǎn)形成鮮明對比，能夠在有效抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的同時(shí)，減少對患者身體的傷害，提高患者的生活質(zhì)量。在本研究中，小白菊內(nèi)酯處理肝癌細(xì)胞后，肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯降低，而對正常肝細(xì)胞的生長和功能影響較小。其次，小白菊內(nèi)酯的作用機(jī)制與現(xiàn)有治療方法不同，它通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移。這種獨(dú)特的作用機(jī)制為肝癌的治療提供了新的思路和靶點(diǎn)，有可能與其他治療方法聯(lián)合使用，發(fā)揮協(xié)同增效作用。例如，與靶向治療藥物聯(lián)合使用時(shí)，小白菊內(nèi)酯可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移，而靶向治療藥物可以特異性地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，兩者結(jié)合可能會(huì)更有效地抑制肝癌的發(fā)展。在肝癌治療研究領(lǐng)域，一些研究關(guān)注天然產(chǎn)物與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用。有研究報(bào)道姜黃素與順鉑聯(lián)合使用，可增強(qiáng)順鉑對肝癌細(xì)胞的殺傷作用，其機(jī)制可能與姜黃素調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。然而，這種聯(lián)合治療仍然面臨化療藥物不良反應(yīng)的問題。小白菊內(nèi)酯與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的研究相對較少，但從其單藥作用機(jī)制和優(yōu)勢來看，具有很大的研究潛力。小白菊內(nèi)酯可能通過抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移，降低腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)減少化療藥物的耐藥性，提高化療藥物的療效。在未來的研究中，可以進(jìn)一步探討小白菊內(nèi)酯與化療藥物的最佳聯(lián)合方案，以及聯(lián)合治療對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為和相關(guān)信號(hào)通路的影響。小白菊內(nèi)酯在肝癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，其獨(dú)特的優(yōu)勢和作用機(jī)制為肝癌的治療提供了新的方向。雖然目前小白菊內(nèi)酯的研究仍處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，但隨著研究的不斷深入，有望為肝癌患者提供一種新的、有效的治療選擇。4.4研究的局限性與展望盡管本研究取得了一些有意義的成果，初步揭示了小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用及相關(guān)機(jī)制，但仍存在一定的局限性。從樣本角度來看，本研究僅選用了HepG2和Bel-7402兩種人肝癌細(xì)胞系，雖然這兩種細(xì)胞系在肝癌研究中應(yīng)用廣泛，但它們不能完全代表所有類型的肝癌細(xì)胞。不同來源的肝癌細(xì)胞在生物學(xué)特性、基因表達(dá)譜和對藥物的敏感性等方面可能存在差異，因此研究結(jié)果的普適性受到一定限制。在后續(xù)研究中，應(yīng)增加更多不同類型的肝癌細(xì)胞系，如Huh-7、SK-Hep-1等，甚至原代肝癌細(xì)胞，以更全面地評(píng)估小白菊內(nèi)酯對肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響。原代肝癌細(xì)胞直接從患者的腫瘤組織中分離培養(yǎng)，保留了腫瘤細(xì)胞的原始生物學(xué)特性，能夠更真實(shí)地反映腫瘤在體內(nèi)的狀態(tài)，有助于深入了解小白菊內(nèi)酯在不同肝癌細(xì)胞中的作用差異。在作用機(jī)制研究方面，本研究僅探討了小白菊內(nèi)酯對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響及其與肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)系，然而肝癌細(xì)胞侵襲和遷移是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)信號(hào)通路和分子機(jī)制的調(diào)控。小白菊內(nèi)酯可能還通過其他途徑發(fā)揮抑制作用，如影響細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)、調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程以及干擾腫瘤血管生成相關(guān)信號(hào)通路等。未來研究可以采用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量技術(shù)