2026屆新高考生物沖刺復(fù)習(xí)基因工程的基本操作程序①目的基因的篩選與獲?、诨虮磉_(dá)載體的構(gòu)建(核心)③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④目的基因的檢測和鑒定重組DNA分子舊知識回顧：獲取目的基因的方法①

目的基因；②通過構(gòu)建

來獲取目的基因；③常用

特異性地快速擴(kuò)增目的基因。人工合成基因文庫PCR獲得了目的基因后能不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，為什么？思考提示：不能，原因：①游離的DNA進(jìn)入細(xì)胞后，一般會

；②即使可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，游離的DNA也無法跟著

進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中

。直接被分解細(xì)胞分裂不再含有目的基因00第2步

基因表達(dá)載體的構(gòu)建【知識擴(kuò)展】原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式圖①

編碼區(qū)：

轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，

編碼(翻譯)出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段。②非編碼區(qū)：

轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，

編碼(翻譯)出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段。注：非編碼區(qū)含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列。能能不能不能00【知識擴(kuò)展】真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式圖【注意】不同于原核生物的基因，真核生物的編碼區(qū)是

。又可分為：①外顯子：

轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，

編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。

②內(nèi)含子：

轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，

編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。能能能不能不連續(xù)，有間隔的00基因工程的基本操作程序00重組DNA分子①目的基因的篩選與獲取②基因表達(dá)載體的構(gòu)建③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④目的基因的檢測和鑒定★核心工作基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心工作）021.基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的：①讓目的基因在受體細(xì)胞中

，并且可以遺傳給下一代。②同時使目的基因能夠

和

。2.基因表達(dá)載體的組成：穩(wěn)定存在表達(dá)發(fā)揮作用呆得住能表達(dá)：轉(zhuǎn)錄、翻譯

:便于重組DNA分子的篩選；

:位置：位于基因的上游；作用：RNA聚合酶識別并結(jié)合的位點，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄；

:

:主要是指編碼特定蛋白質(zhì)的基因；位置：位于基因的下游；作用：終止轉(zhuǎn)錄；終止子啟動子標(biāo)記基因目的基因復(fù)制原點：能夠完成自主復(fù)制；基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心工作）02目的基因插入位點是隨意的嗎？應(yīng)注意什么？思考提示：

隨意的；目的基因的表達(dá)需要

與

的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入到啟動子和終止子

的部位。不是啟動子終止子之間基因表達(dá)載體的構(gòu)建（基因工程的核心工作）023.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程:①用一定的

切割載體(質(zhì)粒)，使它出現(xiàn)

個切口。②用

限制酶或能產(chǎn)生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③利用

將含目的基因的DNA片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了

（即：

）。限制酶同種相同DNA連接酶一一個重組DNA分子基因表達(dá)載體基因表達(dá)載體的構(gòu)建·判斷正誤02(1)基因工程操作程序的核心步驟是目的基因的獲取()(2)基因表達(dá)載體中有的含有啟動子和終止密碼子()(3)標(biāo)記基因不一定是抗生素抗性基因()×基因表達(dá)載體的構(gòu)建?！两K止子√位置作用特點啟動子

的起始點起

作用，本身

；.終止子

的終點起始密碼子

的起始點

氨基酸終止密碼子

的終點

氨基酸DNA上mRNA上翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄不轉(zhuǎn)錄編碼不編碼調(diào)控【素養(yǎng)提升①】重組DNA分子的模擬操作021.請寫出限制酶Spe

Ⅰ、Hind

Ⅲ、Xba

Ⅰ和Xho

Ⅰ切割形成的末端。SpeⅠHindⅢXbaⅠXhoⅠ注：上述限制酶中的SpeⅠ和XbaⅠ，識別DNA分子中

核苷酸序列，但能切割產(chǎn)生

黏性末端，這樣的限制酶被稱為同尾酶。不同相同【素養(yǎng)提升①】重組DNA分子的模擬操作022.限制酶

切割產(chǎn)生的DNA片段能與限制酶Spe

Ⅰ切割產(chǎn)生的DNA片段相連接，因為:

；3.連接完成后，該重組DNA分子的新連接處

.（填“能”或“不能”）再被所用的限制酶切割，因為:

.

。SpeⅠHindⅢXbaⅠXhoⅠXbaⅠXbaⅠ與SpeⅠ切割產(chǎn)生了相同的黏性末端不能所用的兩種限制酶均不能識別該重組DNA分子的新連接處的脫氧核苷酸序列重組DNA分子提示：

；原因：用SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的

，不利于

?！舅仞B(yǎng)提升②】限制酶的選擇原則02１．構(gòu)建基因表達(dá)載體時，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能抗生素抗性基因（標(biāo)記基因）進(jìn)一步篩選重組DNA分子提示：

；弊端：①

；

②

；

③

；【素養(yǎng)提升②】限制酶的選擇原則02相同的黏性末端，可以相互連接！2.只使用EcoRⅠ分別切割質(zhì)粒和外源DNA，能否構(gòu)建基因表達(dá)載體？能質(zhì)粒、目的基因會發(fā)生自身環(huán)化連接質(zhì)粒與目的基因會發(fā)生反向連接會發(fā)生兩兩自身連接注：用同種限制酶或同尾酶處理，產(chǎn)生的都是相同的黏性末端，均會出現(xiàn)以上弊端。單酶切法提示：

；優(yōu)點：①

；

②

；【素養(yǎng)提升②】限制酶的選擇原則023.使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質(zhì)粒、外源DNA，能否構(gòu)建基因表達(dá)載體？可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接還可以防止目的基因與載體的反向連接注：不能防止兩兩自身連接。能雙酶切法相同的黏性末端，可以相互連接！【素養(yǎng)提升②】限制酶的選擇原則02【小結(jié)】選擇限制酶的基本原則:①切割目的基因時:

；②切割質(zhì)粒時:至少保留一個完整的

,便于篩選；

除此之外還需保留

、

、

。③確保目的基因和載體上有

黏性末端(補(bǔ)充說明：平末端也可以，但連接平末端效率低）。能切下目的基因且不破壞目的基因相同標(biāo)記基因復(fù)制原點啟動子終止子結(jié)合基因表達(dá)載體的構(gòu)建，考查科學(xué)思維【P332】

021.（2023·重慶卷，12）某小組通過PCR（假設(shè)引物長度為8個堿基，短于實際長度）獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切（如下圖），再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯誤的是（）。B02A.實驗所用引物，其中一個序列為5′－TGCGCAGT－3′B.步驟①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步驟①的酶對載體進(jìn)行酶切至少獲得了2個片段D.酶切片段和載體連接時可使用E.coli連接酶或T4連接酶根據(jù)酶切后得到的黏性末端判斷，步驟①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ，×；如分析所示，√；步驟①用兩種酶切割載體(質(zhì)粒)，質(zhì)粒上至少有兩個切口，至少產(chǎn)生2個片段，√；目的基因片段和質(zhì)粒經(jīng)酶切后產(chǎn)生的均為黏性末端，均可，√；5’-AGCTAGCA-3’3’-TGACGCGT-5’結(jié)合基因表達(dá)載體的構(gòu)建，考查科學(xué)思維【P331】

2.某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細(xì)菌(B1)的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。02酶切位點(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如下圖所示，→表示引物5′→3′方向。

02(1)限制酶切割的化學(xué)鍵是

。為保證N基因能在菌株B2中表達(dá)，在構(gòu)建片段甲時，應(yīng)將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點之間，原因是：

。(2)CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細(xì)菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補(bǔ)配對可以形成的堿基對有G—C和

。磷酸二酯鍵保證N基因啟動子、N基因、N基因終止子的完整性，確保N基因能夠順利表達(dá)C—G、U—A、A—T

02(3)用引物P1和P2進(jìn)行PCR可驗證片段甲插入了細(xì)菌B1基因組，所用的模板是：

；若用該模板與引物P3和P4進(jìn)行PCR，實驗結(jié)果是：

。(4)與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細(xì)菌處理秸稈的優(yōu)點是：

。菌株B2的基因組DNA無PCR產(chǎn)物無空氣污染；更安全，無火災(zāi)隱患；分解效率更高，高效利用秸稈資源等基因工程的基本操作程序①目的基因的篩選與獲?、诨虮磉_(dá)載體的構(gòu)建③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④目的基因的檢測和鑒定00重組DNA分子③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞03Ca2+處理法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法顯微注射法【方法一】用微量注射器將含目的基因的

DNA溶液直接注入

中?！痉椒ǘ吭谥参锸芊酆蟮囊欢〞r間內(nèi)，剪去柱頭，

將DNA溶液滴加在花柱切面上，

使目的基因借助

進(jìn)入胚囊。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞·①花粉管通道法03子房花粉管通道受體細(xì)胞：受精卵→我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞·②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法03【方法一】可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片

，然后

，并

；【方法二】可以將

直接浸沒在

中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得

，再進(jìn)行

、

等；受體細(xì)胞：與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生成植株體細(xì)胞花序含有農(nóng)桿菌的溶液種子篩選鑒定受體細(xì)胞：受精卵→常用將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞·②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法031.農(nóng)桿菌的特點：農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有

質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的

(可轉(zhuǎn)移的DNA)轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞內(nèi)，并且將其整合到該細(xì)胞的

上。注：農(nóng)桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力；隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。TiT-DNA染色體DNA→常用將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞·②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法032.轉(zhuǎn)化：是指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)

和

的過程。3.利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的思路：維持穩(wěn)定表達(dá)→常用Ti質(zhì)粒目的基因植物細(xì)胞植物細(xì)胞染色體DNA農(nóng)桿菌基因表達(dá)載體導(dǎo)入插入表達(dá)新性狀植株轉(zhuǎn)入構(gòu)建注：導(dǎo)入的目的基因，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中，也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進(jìn)入雜草或其他作物中，造成“基因污染”。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞·②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法03【名師解讀】1.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接：①第一次拼接：將

拼接到

上；②第二次拼接（非人工操作）：將

拼接到

上。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次導(dǎo)入：①第一次導(dǎo)入：將

導(dǎo)入到

中；②第二次導(dǎo)入（非人工操作）：將

導(dǎo)入到

中?！Ｓ媚康幕騎i質(zhì)粒的T-DNA被插入目的基因的T-DNA受體細(xì)胞染色體的DNA含目的基因的重組Ti質(zhì)粒農(nóng)桿菌含目的基因的T-DNA受體細(xì)胞將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞·③顯微注射法03顯微注射受精卵受體細(xì)胞：受精卵構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用

將基因表達(dá)載體注入動物的

中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動物將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞·④Ca2+處理法03大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Ca2+混合基因表達(dá)載體緩沖液吸收DNA完成轉(zhuǎn)化Ca2+的作用是什么？思考增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性。感受態(tài)細(xì)胞有什么特點？思考細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)?！舅仞B(yǎng)提升】篩選出含目的基因(基因表達(dá)載體)的受體細(xì)胞03【問題1】質(zhì)粒(普通質(zhì)粒/重組質(zhì)粒)一定能成功導(dǎo)入受體細(xì)胞嗎？提示：

，因為質(zhì)粒攜帶目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的成功率

。因此還需要進(jìn)一步

出成功導(dǎo)入質(zhì)粒的受體細(xì)胞。不一定不高篩選【素養(yǎng)提升】篩選出含目的基因(基因表達(dá)載體)的受體細(xì)胞03【方法1】利用標(biāo)記基因篩選出含質(zhì)粒(普通質(zhì)粒/重組質(zhì)粒)的受體細(xì)胞：①原理：質(zhì)粒上的標(biāo)記基因一般是

。而受體細(xì)胞本身

抵抗該抗生素的能力。用含有

的培養(yǎng)基培養(yǎng)受體細(xì)胞，能夠生存的是

。某種抗生素的抗性基因沒有該抗生素被導(dǎo)入了質(zhì)粒的受體細(xì)胞提示：

，因為導(dǎo)入

的和導(dǎo)入

的受體細(xì)胞均能在該培養(yǎng)基中存活。①普通質(zhì)粒(含抗性基因的質(zhì)粒)氨芐青霉素抗性基因②重組質(zhì)粒(含抗性基因和目的基因的質(zhì)粒)氨芐青霉素抗性基因目的基因【素養(yǎng)提升】篩選出含目的基因(基因表達(dá)載體)的受體細(xì)胞03【問題2】根據(jù)標(biāo)記基因的作用，在含有某種抗生素的培養(yǎng)基中篩選存活的受體細(xì)胞一定是導(dǎo)入目的基因(重組質(zhì)粒/基因表達(dá)載體)的受體細(xì)胞嗎？不一定普通質(zhì)粒重組質(zhì)?！舅仞B(yǎng)提升】篩選出含目的基因(基因表達(dá)載體)的受體細(xì)胞03【方法2】利用雙標(biāo)記技術(shù)篩選出含目的基因(重組質(zhì)粒)的受體細(xì)胞：①原理：在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，使用兩個不同的標(biāo)記基因(如抗性基因)，將目的基因插入其中一個標(biāo)記基因內(nèi)，導(dǎo)致該標(biāo)記基因

正常表達(dá)；則普通質(zhì)粒具有

種標(biāo)記，重組質(zhì)粒只有

種標(biāo)記。無法重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒普通質(zhì)粒兩一【素養(yǎng)提升】篩選出含目的基因(基因表達(dá)載體)的受體細(xì)胞03②篩選方法：影印培養(yǎng)法(以“將目的基因插入四環(huán)素抗性基因”為例)a.用

法將細(xì)菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再利用

影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，b.對比含不同抗生素的平板，

.

的菌落，就是含目的基因(重組質(zhì)粒)的目標(biāo)菌落。c.最后，可在含

的培養(yǎng)基上挑取

菌落(如圖)進(jìn)行培養(yǎng)。稀釋涂布平板滅菌的絨布在含氨芐青霉素培養(yǎng)基上能生長，在四環(huán)素培養(yǎng)基上不能生長氨芐青霉素1、2、3、6、9結(jié)合基因工程的基本操作程序，考查科學(xué)思維【P331】

1.用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）D03A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基

中能形成菌落重組質(zhì)粒和普通質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因，故不一定，√；單酶切法，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，√；重組質(zhì)粒和普通質(zhì)粒的DNA長度不同，凝膠電泳技術(shù)鑒定，√；SphⅠ酶切會破壞TetR，故不能在含Tet的培養(yǎng)基中形成菌落，×；基因工程的基本操作程序00重組DNA分子①目的基因的篩選與獲?、诨虮磉_(dá)載體的構(gòu)建③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞④目的基因的檢測和鑒定④目的基因的檢測和鑒定目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道。目的基因的檢測和鑒定04類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了

.目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了

.目的基因是否翻譯成

.個體生物學(xué)水平的鑒定個體是否具有相應(yīng)

.目的基因(DNA)mRNAPCR等技術(shù)蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)性狀抗蟲接種實驗、抗病接種實驗等逆轉(zhuǎn)錄目的基因的檢測與鑒定·①PCR等技術(shù)04提取待測DNA轉(zhuǎn)基因生物PCR通過電泳檢測是否擴(kuò)增出目的基因提取待測mRNA轉(zhuǎn)基因生物PCR利用目的基因的核苷酸序列設(shè)計引物。PCR中的引物應(yīng)該根據(jù)什么進(jìn)行設(shè)計？思考目的基因的檢測與鑒定·②分子雜交技術(shù)04原理探針含有目的基因的DNA單鏈片段。注：帶有放射性同位素標(biāo)記或熒光分子標(biāo)記等。結(jié)果顯示出

，則檢測出目的基因/mRNA。圖示①DNA分子雜交：

②DNA-RNA分子雜交:堿基互補(bǔ)配對原則雜交帶目的基因的檢測與鑒定·③抗原-抗體雜交技術(shù)04原理探針與抗原特異性結(jié)合的抗體。注：帶有放射性同位素標(biāo)記或熒光分子標(biāo)記等。結(jié)果顯示出

，則檢測出目的蛋白。圖示抗原與抗體的特異性結(jié)合雜交帶→說明目的基因成功表達(dá)。目的基因的檢測與鑒定·④個體生物學(xué)水平的鑒定實例04轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲害蟲死亡病毒（菌）感染未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常關(guān)鍵·真題必刷【P332】2.(2024·福建卷)病毒感染初期，機(jī)體會分泌干擾素并作用于細(xì)胞受體IFNAR來應(yīng)對感染。麻疹是由麻疹病毒感染引起的急性傳染病。已知人白細(xì)胞分化抗原46(hCD46)是麻疹病毒入侵細(xì)胞的主要受體，小鼠沒有該受體，科研人員構(gòu)建hCD46轉(zhuǎn)基因小鼠用于相關(guān)研究，部分流程如圖所示。(1)利用PCR技術(shù)獲取目的基因hCD46，復(fù)性溫度下發(fā)生的擴(kuò)增過程是:

。(2)將hCD46接入質(zhì)粒應(yīng)選用的限制酶組合是

。為提高轉(zhuǎn)基因效率，同時避免標(biāo)記基因進(jìn)入胚胎體內(nèi)，應(yīng)選用

限制酶組合將重組質(zhì)粒變?yōu)榫€性DNA。兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對分別與含hCD46基因的兩條模板鏈結(jié)合EcoRⅠ和NotⅠAgeⅠ和HindⅢ(3)為獲取大量胚胎用于移植，可用激素處理小鼠a，使其

。將胚胎移植到小鼠c的子宮中，應(yīng)選用桑葚胚的原因是：

。(4)利用PCR技術(shù)對子代小鼠進(jìn)行hCD46基因檢測，應(yīng)設(shè)置不加DNA模板的對照組，目的是：

。(5)若能進(jìn)一步構(gòu)建既表達(dá)hCD46受體又敲除IFNAR