幽門螺桿菌NapA蛋白重組乳酸乳球菌的構(gòu)建與小鼠免疫功效探究一、引言1.1研究背景與意義幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）是一種主要生存在人的胃部及十二指腸內(nèi)的革蘭氏陰性菌，呈螺旋狀或S形、弧形。自1982年澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall首次從人胃黏膜中成功分離出幽門螺桿菌以來，它與人類健康的緊密聯(lián)系逐漸浮出水面。這種細(xì)菌在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，感染率居高不下，已然成為一個不容忽視的公共衛(wèi)生問題。幽門螺桿菌感染與多種嚴(yán)重的胃部疾病息息相關(guān)。它是慢性胃炎的主要致病因素，長期的幽門螺桿菌感染可導(dǎo)致胃黏膜反復(fù)發(fā)炎，引發(fā)上腹痛、腹脹、餐后飽脹、食欲減退、噯氣等消化不良癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。若感染未得到及時有效的控制，病情進(jìn)一步發(fā)展，十二指腸潰瘍或胃潰瘍也會隨之而來，患者常出現(xiàn)餐后上腹部飽脹、不適或疼痛等癥狀，給患者帶來極大的痛苦。更為嚴(yán)峻的是，幽門螺桿菌感染還是胃癌的重要誘因。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)早已將幽門螺桿菌（感染）列為一類致癌物，幽門螺桿菌感染者中有1%-2%會發(fā)展成胃癌。從幽門螺桿菌感染引發(fā)的慢性胃炎，到胃黏膜萎縮、異型增生，最終演變?yōu)槲赴?，這一疾病進(jìn)展過程嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。此外，幽門螺桿菌感染還與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前，臨床上針對幽門螺桿菌感染主要采用質(zhì)子泵抑制劑和抗生素聯(lián)合治療的方案。然而，隨著抗生素的廣泛使用，幽門螺桿菌的耐藥性問題日益嚴(yán)重，甲硝唑、克拉霉素等常用抗生素的耐藥率在部分地區(qū)顯著上升，這使得治療效果大打折扣。同時，抗生素治療還存在病人依從性差的問題，多種藥物聯(lián)合使用的復(fù)雜療程和可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等，使得許多患者難以堅(jiān)持完成整個治療過程，進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗和疾病復(fù)發(fā)。據(jù)統(tǒng)計，傳統(tǒng)抗生素治療方案的失敗率在一些地區(qū)已經(jīng)達(dá)到了相當(dāng)高的比例，這使得尋找新的防治方法迫在眉睫。疫苗作為一種高效、低成本的預(yù)防手段，在傳染病防治領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用。對于幽門螺桿菌感染而言，研發(fā)安全、有效的疫苗具有極其重要的意義。預(yù)防性疫苗可在兒童出生后的幾年內(nèi)接種，有效預(yù)防幽門螺桿菌感染，從源頭上降低感染率，減少相關(guān)疾病的發(fā)生風(fēng)險。治療性疫苗則可以在感染后的任何時期接種，通過增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，幫助患者消除幽門螺桿菌，預(yù)防疾病的進(jìn)一步發(fā)展，降低胃癌等嚴(yán)重疾病的發(fā)生幾率。中性粒細(xì)胞激活蛋白（Neutrophil-activatingprotein，NAP）作為幽門螺桿菌的重要毒力因子，由napA基因編碼，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。它對中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞有趨化作用，能夠?qū)е轮行粤＜?xì)胞浸潤胃黏膜，并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶激活，產(chǎn)生活性氧中間產(chǎn)物，引發(fā)黏膜炎癥和組織損傷。同時，NAP抗原性強(qiáng)，大多數(shù)幽門螺桿菌感染患者體內(nèi)會產(chǎn)生針對NAP的抗體，用NAP免疫小鼠能保護(hù)機(jī)體抵抗幽門螺桿菌的感染，保護(hù)率可達(dá)80%，這表明NAP具備作為幽門螺桿菌疫苗候選抗原的潛力。乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）是一種革蘭氏陽性菌，在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，并且是全球公認(rèn)安全的微生物（Generallyregardedassafe，GRAS）。近年來，乳酸乳球菌作為基因工程宿主菌，在遞呈病毒、細(xì)菌抗原等方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，常被用于構(gòu)建活菌疫苗。它能夠在胃腸等黏膜部位黏附、定植，且無病原性，以其作為載體表達(dá)外源抗原用于黏膜免疫，可有效激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，為幽門螺桿菌疫苗的研發(fā)提供了新的思路和途徑。本研究致力于構(gòu)建表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白的重組乳酸乳球菌，并對其在小鼠體內(nèi)的免疫效果進(jìn)行評價。通過深入研究，有望開發(fā)出一種新型的幽門螺桿菌疫苗，為幽門螺桿菌感染的防治提供新的有效手段，降低幽門螺桿菌感染相關(guān)疾病的發(fā)生率，改善患者的健康狀況，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀幽門螺桿菌疫苗的研發(fā)一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。國外早在幽門螺桿菌被發(fā)現(xiàn)后不久，便開啟了相關(guān)疫苗的研究征程。早期研究多集中在全菌疫苗，如用超聲破碎或福爾馬林滅活菌體獲得全菌抗原免疫小鼠，雖能引起高效的局部黏膜反應(yīng)，降低幽門螺桿菌在胃內(nèi)的定殖，但由于抗原成分復(fù)雜，易引發(fā)免疫性疾病，限制了其臨床應(yīng)用。隨著研究的深入，以尿素酶、鞭毛、毒力因子等單一成分為抗原的疫苗成為研究熱點(diǎn)。例如，尿素酶因其氨基酸序列相對保守且廣泛分布于幽門螺桿菌表面，被視為重要的疫苗候選抗原。國外有研究將尿素酶與其他抗原分子結(jié)合制備混合抗原免疫小鼠，免疫效率有所提高。然而，這些單一抗原疫苗在臨床試驗(yàn)中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如免疫保護(hù)效果不夠理想、難以誘導(dǎo)持久的免疫應(yīng)答等，導(dǎo)致至今全球范圍內(nèi)尚無幽門螺桿菌疫苗成功上市。國內(nèi)在幽門螺桿菌疫苗研發(fā)領(lǐng)域也取得了一定成果。2009年，第三軍醫(yī)大學(xué)教授鄒全明帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)成功研制出世界首個基因工程幽門螺桿菌疫苗“口服重組幽門螺桿菌疫苗”，并獲國家原創(chuàng)1類新藥證書。該疫苗臨床研究表明具有良好的有效性和安全性，預(yù)防幽門螺桿菌感染的保護(hù)率大于72.1%。但由于資金、審批等問題，該疫苗一直未能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化上市。近年來，國內(nèi)學(xué)者不斷探索新的疫苗研發(fā)策略，如篩選新的抗原蛋白、優(yōu)化佐劑配方、改進(jìn)疫苗遞送系統(tǒng)等，以提高疫苗的免疫原性和保護(hù)效果。中性粒細(xì)胞激活蛋白（NAP）作為幽門螺桿菌的重要毒力因子，其在疫苗研發(fā)中的潛力也備受關(guān)注。國內(nèi)外研究均表明，NAP對中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞有趨化作用，可導(dǎo)致黏膜炎癥和組織損傷。同時，NAP抗原性強(qiáng)，大多數(shù)幽門螺桿菌感染患者體內(nèi)會產(chǎn)生針對NAP的抗體，用NAP免疫小鼠能保護(hù)機(jī)體抵抗幽門螺桿菌的感染，保護(hù)率可達(dá)80%。國內(nèi)有研究將NAP與其他抗原如尿素酶A（UreA）、尿素酶B（UreB）等組合成多價疫苗，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)血清IgG和黏膜IgA反應(yīng)增強(qiáng)，幽門螺桿菌定植數(shù)量減少。國外也在深入研究NAP的抗原表位，試圖通過去除對白細(xì)胞有刺激活性的表位，保留免疫原性表位，進(jìn)一步提升其免疫保護(hù)效果。乳酸乳球菌作為基因工程宿主菌和活菌疫苗載體，在國內(nèi)外都有廣泛的研究和應(yīng)用。國外在乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化方面取得了顯著進(jìn)展，以乳鏈菌肽控制的表達(dá)（Nisin-controlledexpression，NICE）系統(tǒng)為例，對其組成、不同組分的功能特點(diǎn)進(jìn)行了深入研究，并將該表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用于食品、疫苗和畜牧獸醫(yī)等多個領(lǐng)域。國內(nèi)則利用乳酸乳球菌成功分泌表達(dá)了多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，為疾病治療提供了新的思路。在疫苗領(lǐng)域，國內(nèi)研究人員利用乳酸桿菌構(gòu)建了肺炎鏈球菌表面抗原PsaA表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的抗原經(jīng)黏膜免疫后對相應(yīng)致病菌有較好的抵抗作用。然而，目前將乳酸乳球菌作為載體表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白，并對其在小鼠體內(nèi)免疫效果進(jìn)行系統(tǒng)評價的研究還相對較少。本研究擬在已有研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白的重組乳酸乳球菌，通過優(yōu)化表達(dá)條件，提高NapA蛋白的表達(dá)量和活性，然后對重組乳酸乳球菌在小鼠體內(nèi)的免疫效果進(jìn)行全面、深入的評價，包括體液免疫、細(xì)胞免疫以及對幽門螺桿菌感染的保護(hù)作用等方面，為幽門螺桿菌疫苗的研發(fā)提供新的策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望在幽門螺桿菌疫苗研發(fā)領(lǐng)域取得創(chuàng)新性突破。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1幽門螺桿菌及其危害幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）是一種革蘭氏陰性菌，其獨(dú)特的生物學(xué)特性使其能夠在人體胃部的惡劣環(huán)境中生存繁衍。從形態(tài)上看，幽門螺桿菌呈螺旋狀或S形、弧形，長2.5-4.0μm，寬0.5-1.0μm，這種特殊的形態(tài)有助于它在胃黏膜表面的黏附與定植。其一端帶有2-6根帶鞘鞭毛，運(yùn)動活潑，能借助鞭毛的擺動在胃內(nèi)黏液層中穿梭，尋找適宜的生存位置。幽門螺桿菌是微需氧菌，對生長環(huán)境要求嚴(yán)苛，在85%N?、10%CO?和5%O?的氣體環(huán)境中生長良好，營養(yǎng)要求較高，在固體培養(yǎng)基中需要加入10%的脫纖維羊血，液體培養(yǎng)基需補(bǔ)充10%的小牛血清。當(dāng)運(yùn)用抗生素治療或胃黏膜發(fā)生病理性改變時，幽門螺桿菌可由螺桿狀轉(zhuǎn)變成圓球形，一般認(rèn)為圓球形是活的非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)菌。幽門螺桿菌在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，感染率居高不下。世界范圍內(nèi)自然人群的感染率約為50%，在發(fā)展中國家感染率通常為50%-80%，而發(fā)達(dá)國家一般為25%-50%，我國平均感染率約為60%。它的傳播途徑主要包括口-口途徑和糞-口途徑。口-口傳播常見于與感染者一同吃飯，且未分餐或未使用公筷，使用感染者未經(jīng)滅菌處理的餐具或牙刷、與感染者親吻、口對口喂食等情況。糞-口傳播則是正常人群接觸了含有幽門螺桿菌糞便污染的水源或食物而被感染，如食用不潔凈食物，像進(jìn)食未經(jīng)洗凈的新鮮瓜果、蔬菜等，飲用不潔水源，如直接飲用未經(jīng)煮沸的井水等。此外，內(nèi)鏡污染也可導(dǎo)致幽門螺桿菌交叉感染，若感染者進(jìn)行消化內(nèi)鏡檢查后，內(nèi)鏡滅菌不完全，后續(xù)接受相同檢查的人就存在感染風(fēng)險。幽門螺桿菌感染與多種胃部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對人體健康造成嚴(yán)重危害。它是慢性胃炎的主要致病因素，長期的幽門螺桿菌感染會引發(fā)胃黏膜反復(fù)發(fā)炎，導(dǎo)致胃黏膜出現(xiàn)充血、水腫、糜爛等病理變化。患者常出現(xiàn)上腹痛、腹脹、餐后飽脹、食欲減退、噯氣等消化不良癥狀，嚴(yán)重影響日常生活質(zhì)量。隨著感染的持續(xù)，病情可能進(jìn)一步惡化，發(fā)展為十二指腸潰瘍或胃潰瘍。在潰瘍形成過程中，幽門螺桿菌分泌的尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨，氨中和胃酸，破壞了胃及十二指腸黏膜的保護(hù)屏障，使得胃酸和胃蛋白酶能夠直接侵蝕黏膜，形成潰瘍?；颊邥霈F(xiàn)規(guī)律性的上腹部疼痛，如胃潰瘍多在餐后半小時至一小時出現(xiàn)疼痛，十二指腸潰瘍則多在空腹時疼痛，進(jìn)食后緩解，給患者帶來極大的痛苦。更為嚴(yán)峻的是，幽門螺桿菌感染與胃癌的發(fā)生緊密相連。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將幽門螺桿菌（感染）列為一類致癌物，幽門螺桿菌感染者中有1%-2%會發(fā)展成胃癌。幽門螺桿菌感染引發(fā)的慢性炎癥會持續(xù)刺激胃黏膜，導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞不斷增殖、修復(fù)，在這個過程中，細(xì)胞的基因突變概率增加，容易引發(fā)細(xì)胞癌變。從幽門螺桿菌感染引發(fā)的慢性胃炎，逐漸發(fā)展為胃黏膜萎縮、腸化生、異型增生，最終演變?yōu)槲赴?，這一疾病進(jìn)展過程通常較為漫長，但一旦發(fā)展到胃癌階段，治療難度大幅增加，患者的生存率也會顯著降低。此外，幽門螺桿菌感染還與胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，進(jìn)一步凸顯了其對人體健康的嚴(yán)重威脅。2.2NapA蛋白的結(jié)構(gòu)與功能中性粒細(xì)胞激活蛋白（Neutrophil-activatingprotein，NAP），由napA基因編碼，是幽門螺桿菌的重要毒力因子之一。從結(jié)構(gòu)上看，它是一種相對分子質(zhì)量為150×103的蛋白質(zhì)，由12個單體組成，每個單體含有144個氨基酸。整個NAP呈球狀形，直徑約90?，具有32面體對稱結(jié)構(gòu)。值得注意的是，NAP分子中心可儲存鐵，其氨基酸序列分析顯示，NAP與大腸桿菌DNA保護(hù)性蛋白（Dps）及鐵蛋白具有高度同源性，盡管與Dps結(jié)構(gòu)相似，但它們的功能卻不盡相同。NAP獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它結(jié)合500個鐵原子的能力，這使其具有抵抗熱及化學(xué)損傷的作用，在細(xì)菌代謝過程中扮演著重要角色。在幽門螺桿菌致病過程中，NapA蛋白發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它對中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞具有趨化作用。當(dāng)幽門螺桿菌感染人體后，NapA蛋白被釋放，能夠吸引中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞向感染部位聚集，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤胃黏膜。與此同時，NapA蛋白還能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶激活，產(chǎn)生活性氧中間產(chǎn)物（ROI）。這些活性氧物質(zhì)具有強(qiáng)氧化性，會對胃黏膜細(xì)胞造成氧化損傷，引發(fā)黏膜炎癥和組織損傷。研究表明，幽門螺桿菌感染引起的胃黏膜損傷以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤為特征，且損害程度與中性粒細(xì)胞浸潤程度呈正比，這充分說明了NapA蛋白在幽門螺桿菌致病過程中的重要性。不僅如此，NapA蛋白還能誘導(dǎo)中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞移行所必需的β2整合素，以介導(dǎo)白細(xì)胞的黏附及吞噬作用，并介導(dǎo)免疫細(xì)胞間及免疫細(xì)胞與上皮細(xì)胞間的黏附作用。它還能促進(jìn)單核細(xì)胞中組織因子合成和2型纖維蛋白溶酶原激活抑制因子的分泌。并且，NapA蛋白可穿過上皮單層，激活肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放前炎癥細(xì)胞因子IL-6。最近研究發(fā)現(xiàn)，NapA蛋白能促進(jìn)Th1免疫反應(yīng)，在感染位點(diǎn)形成以IL-12、IL-6、IL-8、TNF-α增高的Th1型細(xì)胞因子環(huán)境，影響感染的結(jié)局。NapA蛋白的這些特性使其具有作為疫苗候選抗原的巨大潛力。多數(shù)幽門螺桿菌感染患者體內(nèi)存在針對NapA蛋白的特異性抗體。研究人員Satin等發(fā)現(xiàn)，用NapA蛋白免疫小鼠，80%的小鼠胃黏膜未見幽門螺桿菌菌株，說明小鼠獲得了免疫保護(hù)，保護(hù)率與幽門螺桿菌CagA組和幽門螺桿菌溶解物組相似，而健康對照組則未產(chǎn)生任何保護(hù)作用。這些研究有力地表明，NapA蛋白是一種有效的抗原物質(zhì)，能激發(fā)宿主的免疫保護(hù)反應(yīng)。通過對NapA蛋白抗原表位的深入研究，有望去除對白細(xì)胞有刺激活性的表位，保留具有免疫原性的表位，從而更好地發(fā)揮其免疫保護(hù)作用。2.3乳酸乳球菌作為表達(dá)載體的優(yōu)勢乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）作為一種革蘭氏陽性菌，在生物技術(shù)領(lǐng)域中展現(xiàn)出作為表達(dá)載體的卓越優(yōu)勢，特別是在重組蛋白表達(dá)和遞送方面，具有獨(dú)特的特性使其成為極具潛力的工具。安全性高是乳酸乳球菌作為表達(dá)載體的突出優(yōu)勢之一。它是全球公認(rèn)安全的微生物（Generallyregardedassafe，GRAS），在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用歷史，如在酸奶油、酸奶、干酪等乳制品的發(fā)酵生產(chǎn)中扮演著重要角色。這種長期的安全使用記錄表明其對人體無致病性，不會對宿主造成額外的健康風(fēng)險，為其在疫苗和藥物遞送等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的安全基礎(chǔ)。相比其他一些表達(dá)載體，如大腸桿菌等，乳酸乳球菌不存在內(nèi)毒素污染的問題，這對于生產(chǎn)用于人體的生物制品至關(guān)重要，可有效避免內(nèi)毒素引發(fā)的免疫反應(yīng)和潛在的健康危害。乳酸乳球菌易于培養(yǎng)，這一特性極大地降低了生產(chǎn)成本和操作難度。它在普通的培養(yǎng)基中就能良好生長，營養(yǎng)要求相對簡單，僅需基本的碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分。而且，乳酸乳球菌生長迅速，在適宜的條件下，短時間內(nèi)就能達(dá)到較高的細(xì)胞密度。例如，在30℃左右的溫度下，使用M17培養(yǎng)基添加適量乳糖，乳酸乳球菌可快速繁殖。這種易于培養(yǎng)和快速生長的特點(diǎn)，使得大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白成為可能，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。乳酸乳球菌具備可誘導(dǎo)表達(dá)的特性，這為重組蛋白的表達(dá)調(diào)控提供了便利。以乳鏈菌肽控制的表達(dá)（Nisin-controlledexpression，NICE）系統(tǒng)為例，該系統(tǒng)由nisA啟動子、調(diào)節(jié)基因nisRK和誘導(dǎo)物乳鏈菌肽組成。在沒有乳鏈菌肽存在時，NisR和NisK組成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)處于非激活狀態(tài)，nisA啟動子無法啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)加入乳鏈菌肽后，乳鏈菌肽與細(xì)胞膜上的NisK蛋白結(jié)合，激活NisR蛋白，進(jìn)而激活nisA啟動子，啟動外源基因的表達(dá)。通過精確控制乳鏈菌肽的添加時間和劑量，能夠?qū)崿F(xiàn)重組蛋白在特定時間和特定水平的表達(dá)，避免了重組蛋白的持續(xù)表達(dá)對宿主細(xì)胞生長和代謝的影響，提高了重組蛋白的表達(dá)效率和質(zhì)量。乳酸乳球菌能在胃腸等黏膜部位黏附、定植，這使其在黏膜免疫中發(fā)揮著重要作用。作為黏膜免疫的疫苗載體，它可以直接將外源抗原遞送至黏膜表面，激活黏膜免疫系統(tǒng)。黏膜免疫系統(tǒng)是人體抵御病原體入侵的第一道防線，包含大量的免疫細(xì)胞和免疫分子。當(dāng)乳酸乳球菌攜帶外源抗原進(jìn)入胃腸道后，能夠與黏膜上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，通過抗原遞呈細(xì)胞將抗原信息傳遞給T細(xì)胞和B細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答。不僅能產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白A（sIgA），在黏膜表面發(fā)揮免疫保護(hù)作用，還能激活細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對病原體的抵抗能力。這種能夠激活黏膜免疫的特性，為開發(fā)新型的黏膜疫苗提供了有力的支持，有望用于預(yù)防和治療多種黏膜相關(guān)疾病。三、表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白的重組乳酸乳球菌的構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料菌株與質(zhì)粒：幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11639，用于提供NapA蛋白的編碼基因napA。乳酸乳球菌NZ3900，作為基因工程的宿主菌，因其具有安全性高、易于培養(yǎng)、能在黏膜部位黏附定植等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的表達(dá)和活菌疫苗的構(gòu)建。載體質(zhì)粒pNZ8110，這是一種常用于乳酸乳球菌的表達(dá)載體，具有可誘導(dǎo)表達(dá)的特性，能在乳鏈菌肽的誘導(dǎo)下啟動外源基因的表達(dá)，為NapA基因的表達(dá)提供了有效的工具。工具酶及試劑盒：限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ，用于對目的基因和載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切，使其產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。T4DNA連接酶，能夠催化DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，實(shí)現(xiàn)目的基因與載體質(zhì)粒的連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。DNAMarker，在核酸電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷目的基因片段和重組質(zhì)粒的大小。質(zhì)粒提取試劑盒，用于從細(xì)菌中高效提取質(zhì)粒，保證質(zhì)粒的純度和完整性，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。DNA膠回收試劑盒，能夠從瓊脂糖凝膠中特異性地回收目的DNA片段，去除雜質(zhì)和其他非目的條帶，提高目的基因的純度。實(shí)驗(yàn)動物：6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，體重在18-22g之間。BALB/c小鼠是常用的實(shí)驗(yàn)動物，其遺傳背景清晰，免疫反應(yīng)穩(wěn)定，對幽門螺桿菌感染較為敏感，適合用于評估重組乳酸乳球菌在體內(nèi)的免疫效果。主要試劑：PCRMasterMix，包含了PCR反應(yīng)所需的TaqDNA聚合酶、dNTPs、緩沖液等成分，能夠方便快捷地進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，提高實(shí)驗(yàn)效率。胰蛋白胨、酵母提取物，是細(xì)菌培養(yǎng)基的主要營養(yǎng)成分，為幽門螺桿菌和乳酸乳球菌的生長提供氮源、碳源、維生素和生長因子等。氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀等無機(jī)鹽，用于維持培養(yǎng)基的滲透壓和酸堿度，為細(xì)菌的生長提供適宜的環(huán)境。瓊脂粉，在固體培養(yǎng)基中作為凝固劑，使培養(yǎng)基形成固體狀態(tài)，便于細(xì)菌的分離和培養(yǎng)。氨芐青霉素、紅霉素等抗生素，用于篩選含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌，只有成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒并表達(dá)相應(yīng)抗性基因的細(xì)菌才能在含有抗生素的培養(yǎng)基上生長。主要儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀，通過精確控制溫度的變化，實(shí)現(xiàn)DNA的變性、退火和延伸過程，從而擴(kuò)增目的基因。高速冷凍離心機(jī)，能夠在低溫條件下對樣品進(jìn)行高速離心，用于細(xì)菌的收集、質(zhì)粒的提取以及蛋白的分離等操作，減少生物活性物質(zhì)的失活。恒溫培養(yǎng)箱，為細(xì)菌的生長提供恒定的溫度環(huán)境，保證細(xì)菌在適宜的條件下生長繁殖。電泳儀及電泳槽，用于核酸和蛋白質(zhì)的電泳分析，通過電場的作用使DNA或蛋白質(zhì)在凝膠中遷移，根據(jù)遷移距離的不同實(shí)現(xiàn)分離和鑒定。凝膠成像系統(tǒng)，能夠?qū)﹄娪竞蟮哪z進(jìn)行拍照和分析，檢測目的條帶的位置和亮度，直觀地展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。超凈工作臺，提供無菌的操作環(huán)境，減少實(shí)驗(yàn)過程中的微生物污染，保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1napA基因的獲取取適量幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11639，接種于添加10%脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂平板上，置于微需氧環(huán)境（85%N?、10%CO?和5%O?）、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。待菌落生長良好后，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取幽門螺桿菌的基因組DNA。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，首先將培養(yǎng)的幽門螺桿菌菌體收集到離心管中，加入適量的裂解液，充分混勻，使菌體裂解，釋放出基因組DNA。然后經(jīng)過一系列的離心、洗滌步驟，去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)等，最終得到純凈的基因組DNA，將其保存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)GenBank中公布的幽門螺桿菌napA基因序列（登錄號：XXXXXX），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。上游引物：5'-CCATGGATGAAAAATATTTGACCTG-3'（下劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'-CTCGAGTCAGCGTTGCTTTCTTTTC-3'（下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以提取的幽門螺桿菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）：PCRMasterMix12.5μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，模板DNA1μL，ddH?O9.5μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；72℃終延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在電泳槽中加入適量的1×TAE緩沖液，將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后加入凝膠加樣孔中，同時加入DNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在120V電壓下電泳30-40min，電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，確認(rèn)是否擴(kuò)增出預(yù)期大小的napA基因片段。將PCR擴(kuò)增得到的napA基因片段使用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。按照試劑盒說明書操作，首先將含有目的片段的瓊脂糖凝膠切下，放入離心管中，加入適量的溶膠液，在50-60℃水浴中加熱，使凝膠完全溶解。然后將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，經(jīng)過離心、洗滌等步驟，去除雜質(zhì)，最后用適量的洗脫緩沖液將純化后的napA基因片段洗脫下來，保存于-20℃?zhèn)溆?。為確保擴(kuò)增的napA基因序列的準(zhǔn)確性，將回收純化后的napA基因片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與GenBank中公布的napA基因序列進(jìn)行比對分析，使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對，確認(rèn)擴(kuò)增的napA基因序列是否正確。3.2.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建將提取的質(zhì)粒pNZ8110和回收的napA基因片段分別用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系（20μL）：質(zhì)粒pNZ8110或napA基因片段2μL，10×Buffer2μL，NcoⅠ1μL，XhoⅠ1μL，ddH?O14μL。37℃水浴酶切3-4h。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA膠回收試劑盒分別回收酶切后的pNZ8110載體片段和napA基因片段。將回收的酶切后的pNZ8110載體片段和napA基因片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系（10μL）：pNZ8110載體片段1μL，napA基因片段3μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，ddH?O4μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。從-80℃冰箱中取出大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。然后將離心管放入42℃水浴中熱激90s，迅速置于冰上冷卻2min。向離心管中加入900μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1h。取適量菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，接種于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。按照試劑盒說明書操作，將培養(yǎng)的菌液收集到離心管中，經(jīng)過裂解、中和、離心等步驟，去除雜質(zhì)，最后用適量的洗脫緩沖液將重組質(zhì)粒洗脫下來。對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定。PCR鑒定反應(yīng)體系和條件同3.2.1中napA基因的PCR擴(kuò)增。雙酶切鑒定反應(yīng)體系和條件同3.2.2中pNZ8110和napA基因片段的雙酶切。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，以確保重組質(zhì)粒中napA基因的序列正確無誤。3.2.3重組乳酸乳球菌的制備將鑒定正確的重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZ3900感受態(tài)細(xì)胞中。從-80℃冰箱中取出乳酸乳球菌NZ3900感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。取5μL重組質(zhì)粒加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀中，設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)為2.5kV，25μF，200Ω，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入1mL不含抗生素的GM17液體培養(yǎng)基，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，30℃、150rpm振蕩培養(yǎng)2h。取適量菌液涂布于含有紅霉素（5μg/mL）的GM17固體培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)24-48h。挑取平板上的單菌落，接種于含有紅霉素（5μg/mL）的GM17液體培養(yǎng)基中，30℃、150rpm振蕩培養(yǎng)過夜。提取菌體的基因組DNA，以其為模板進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)體系和條件同3.2.1中napA基因的PCR擴(kuò)增。將PCR鑒定為陽性的菌株進(jìn)行測序驗(yàn)證，確保重組乳酸乳球菌中napA基因的序列正確。對鑒定正確的重組乳酸乳球菌進(jìn)行保存，將其接種于含有甘油（終濃度20%）的GM17液體培養(yǎng)基中，混勻后分裝至凍存管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2.4NapA蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測將保存的重組乳酸乳球菌接種于含有紅霉素（5μg/mL）的GM17液體培養(yǎng)基中，30℃、150rpm振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子液。將種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接至含有紅霉素（5μg/mL）的GM17液體培養(yǎng)基中，30℃、150rpm振蕩培養(yǎng)至OD???值為0.5-0.6時，加入終濃度為10ng/mL的乳鏈菌素（Nisin）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、8000rpm離心10min，收集菌體。用PBS緩沖液洗滌菌體3次，然后加入適量的PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎菌體。超聲條件：功率200W，超聲3s，間隔5s，總時間10min。超聲破碎后，4℃、12000rpm離心30min，收集上清液，即為重組乳酸乳球菌表達(dá)的NapA蛋白粗提物。取適量的蛋白粗提物進(jìn)行SDS檢測。配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白粗提物與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品加入到凝膠加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在120V電壓下進(jìn)行電泳，待溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部時，停止電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，染色液為0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250，染色時間1-2h。然后用脫色液（甲醇：冰醋酸：水=45:10:45）脫色，直至背景清晰，觀察并拍照記錄結(jié)果，分析是否表達(dá)出預(yù)期分子量大小的NapA蛋白。將SDS電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，進(jìn)行Westernblot檢測。轉(zhuǎn)膜條件：恒流200mA，轉(zhuǎn)膜時間1.5-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉2h。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5min。然后將NC膜與小鼠抗Hp免疫血清（1:1000稀釋）孵育，4℃過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5min。再將NC膜與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋）孵育，室溫反應(yīng)1h。最后用TBST緩沖液洗滌NC膜3次，每次5min。加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，觀察并拍照記錄結(jié)果，分析表達(dá)的NapA蛋白是否能與小鼠抗Hp免疫血清發(fā)生免疫反應(yīng)。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.3.1重組表達(dá)載體的鑒定結(jié)果以提取的幽門螺桿菌基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約435bp處出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期的napA基因大小一致（圖1）。這表明成功擴(kuò)增出了napA基因，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。將擴(kuò)增得到的napA基因片段和載體質(zhì)粒pNZ8110分別用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，然后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5α進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示在約435bp處出現(xiàn)了陽性條帶（圖2），初步證明重組質(zhì)粒中含有napA基因。進(jìn)一步對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切后出現(xiàn)了兩條條帶，一條約為435bp，與napA基因大小相符，另一條約為3700bp，與pNZ8110載體大小相符（圖3），這進(jìn)一步證實(shí)了重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件與GenBank中公布的napA基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示兩者的同源性達(dá)到99%以上，僅有個別堿基差異，但這些差異并未導(dǎo)致氨基酸序列的改變。這表明成功構(gòu)建了含有正確napA基因序列的重組表達(dá)載體pNZ8110-napA。3.3.2重組乳酸乳球菌的鑒定結(jié)果將重組表達(dá)載體pNZ8110-napA用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌NZ3900感受態(tài)細(xì)胞中，在含有紅霉素（5μg/mL）的GM17固體培養(yǎng)基平板上篩選出單菌落。以這些單菌落為模板進(jìn)行PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約435bp處出現(xiàn)了陽性條帶（圖4），表明重組乳酸乳球菌中含有napA基因。對PCR鑒定為陽性的菌株進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果與GenBank中公布的napA基因序列一致，進(jìn)一步確認(rèn)了重組乳酸乳球菌中napA基因的正確性。這表明成功制備了表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白的重組乳酸乳球菌L.lactisNZ3900/pNZ8110-napA。3.3.3NapA蛋白的表達(dá)與檢測結(jié)果將重組乳酸乳球菌L.lactisNZ3900/pNZ8110-napA接種于含有紅霉素（5μg/mL）的GM17液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD???值為0.5-0.6時，加入終濃度為10ng/mL的乳鏈菌素（Nisin）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，對菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果顯示，在分子量約為15kDa處出現(xiàn)了一條特異性條帶，與預(yù)期的NapA蛋白分子量大小一致（圖5），而未誘導(dǎo)的重組乳酸乳球菌和空載體轉(zhuǎn)化的乳酸乳球菌在相應(yīng)位置無此條帶。經(jīng)分析，該誘導(dǎo)表達(dá)的NapA蛋白表達(dá)量約占菌體蛋白的14％。這表明重組乳酸乳球菌成功表達(dá)了NapA蛋白。為了進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)的NapA蛋白是否具有免疫活性，對SDS-PAGE電泳后的蛋白進(jìn)行Westernblot檢測。結(jié)果顯示，在分子量約為15kDa處出現(xiàn)了明顯的雜交條帶（圖6），表明表達(dá)的NapA蛋白能夠與小鼠抗Hp免疫血清發(fā)生免疫反應(yīng)，具有良好的免疫活性。四、重組乳酸乳球菌在小鼠體內(nèi)的免疫效果評價4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計選取6-8周齡的雌性BALB/c小鼠40只，體重在18-22g之間，購自[供應(yīng)商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度控制在（23±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。適應(yīng)環(huán)境一周后，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：重組乳酸乳球菌免疫組：灌胃接種表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白的重組乳酸乳球菌L.lactisNZ3900/pNZ8110-napA，菌液濃度為1×10?CFU/mL，每次灌胃劑量為200μL，每周免疫1次，共免疫3次?？蛰d體乳酸乳球菌對照組：灌胃接種空載體轉(zhuǎn)化的乳酸乳球菌L.lactisNZ3900/pNZ8110，菌液濃度和灌胃劑量同重組乳酸乳球菌免疫組，免疫次數(shù)也為每周1次，共免疫3次。幽門螺桿菌感染對照組：不進(jìn)行免疫接種，直接用于幽門螺桿菌攻毒實(shí)驗(yàn)。正常對照組：不進(jìn)行任何處理，作為空白對照。在最后一次免疫后1周，對重組乳酸乳球菌免疫組、空載體乳酸乳球菌對照組和幽門螺桿菌感染對照組的小鼠進(jìn)行幽門螺桿菌攻毒。將幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11639接種于添加10%脫纖維羊血的哥倫比亞血瓊脂平板上，置于微需氧環(huán)境（85%N?、10%CO?和5%O?）、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。待菌落生長良好后，用無菌生理鹽水洗下菌落，調(diào)整菌液濃度至1×10?CFU/mL。每只小鼠灌胃接種幽門螺桿菌菌液200μL。在每次免疫后的第7天，通過眼眶采血的方式采集小鼠血液，室溫靜置1-2h后，3000rpm離心15min，分離血清，保存于-20℃冰箱中，用于后續(xù)抗體效價檢測。在幽門螺桿菌攻毒后4周，將所有小鼠脫頸椎處死，迅速取出胃組織，用無菌生理鹽水沖洗干凈，一部分胃組織用于病理切片制作，觀察胃黏膜的病理變化；另一部分胃組織勻漿后，進(jìn)行幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)，計算胃內(nèi)幽門螺桿菌的定植數(shù)量。同時，取小鼠的脾臟，制備單細(xì)胞懸液，用于檢測細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)，如T淋巴細(xì)胞亞群的比例、細(xì)胞因子的分泌水平等。4.2檢測指標(biāo)與方法4.2.1血清和黏膜抗體檢測在免疫效果評價中，血清和黏膜抗體檢測是重要的評估指標(biāo)，能夠直觀反映機(jī)體的體液免疫應(yīng)答情況。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測小鼠血清中特異性IgG抗體和腸道黏膜中SIgA抗體水平。血清特異性IgG抗體檢測步驟如下：首先，用包被緩沖液將純化的幽門螺桿菌NapA蛋白稀釋至合適濃度，一般為1-10μg/mL，加入到96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃包被過夜。包被結(jié)束后，棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min，以去除未結(jié)合的蛋白。隨后，加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μL，37℃封閉1-2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉完成后，再次用PBST緩沖液洗滌3次。將收集的小鼠血清樣本用PBST緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，如從1:100開始稀釋，每孔加入100μL稀釋后的血清，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，洗滌酶標(biāo)板3次。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，用PBST緩沖液稀釋至合適濃度，如1:5000，每孔100μL，37℃孵育1h。最后，用PBST緩沖液洗滌5次。加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色15-20min。當(dāng)顯色達(dá)到合適程度時，加入2M硫酸終止液，每孔50μL，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。以正常對照組血清的OD值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，計算血清中特異性IgG抗體的滴度。腸道黏膜中SIgA抗體水平檢測步驟稍有不同：取小鼠的小腸組織，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗干凈，去除表面的黏液和雜質(zhì)。將小腸組織剪碎，加入適量的PBS緩沖液，使用勻漿器勻漿。將勻漿液在4℃、12000rpm離心15min，收集上清液。后續(xù)的ELISA操作步驟與血清IgG抗體檢測類似，只是一抗使用的是羊抗鼠SIgA抗體，用PBST緩沖液稀釋至合適濃度，如1:1000，每孔加入100μL，37℃孵育1-2h。ELISA檢測的原理基于抗原抗體的特異性結(jié)合。包被在酶標(biāo)板上的NapA蛋白作為抗原，能夠與小鼠血清或腸道黏膜勻漿中的特異性IgG或SIgA抗體結(jié)合。加入的HRP標(biāo)記的二抗能夠特異性地識別并結(jié)合一抗，形成抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。當(dāng)加入TMB底物時，HRP催化TMB發(fā)生顯色反應(yīng)，生成藍(lán)色產(chǎn)物，加入硫酸終止反應(yīng)后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色。通過酶標(biāo)儀測定OD值，OD值與樣本中抗體的含量成正比，從而可以定量檢測抗體水平。4.2.2細(xì)胞因子檢測細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，檢測小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1、Th2和Th17型細(xì)胞因子水平，能夠深入了解機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況。本研究可采用ELISA或流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。若使用ELISA法檢測，步驟如下：脫頸椎處死后迅速取出小鼠脾臟，置于盛有預(yù)冷PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，用鑷子和剪刀將脾臟表面的結(jié)締組織去除干凈。將脾臟剪碎，放入200目細(xì)胞篩網(wǎng)中，用注射器活塞輕輕研磨脾臟組織，使細(xì)胞通過篩網(wǎng)進(jìn)入下方的PBS緩沖液中，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、1500rpm離心5min，棄去上清液。加入適量的紅細(xì)胞裂解液，重懸細(xì)胞，室溫孵育3-5min，裂解紅細(xì)胞。再次離心，棄去上清液，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?/mL。將細(xì)胞懸液加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1mL，同時加入適量的刺激劑，如刀豆蛋白A（ConA），終濃度為5μg/mL，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h。培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，4℃、1500rpm離心10min，收集上清液，保存于-20℃冰箱中備用。按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測上清液中Th1型細(xì)胞因子（如IFN-γ、IL-2）、Th2型細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5、IL-10）和Th17型細(xì)胞因子（如IL-17A、IL-21、IL-22）的水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞因子則是利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)。首先制備小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，方法同上。將細(xì)胞懸液調(diào)整至合適濃度，如1×10?/mL，加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1mL，加入刺激劑PMA（50ng/mL）和離子霉素（1μg/mL），同時加入高爾基體阻斷劑（如BrefeldinA或Monensin），37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h。培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、1500rpm離心5min，棄去上清液。加入適量的細(xì)胞固定液（如4%多聚甲醛），室溫固定20min。固定后，用含有0.1%皂素的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，以增加細(xì)胞膜的通透性。加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體，如抗IFN-γ-FITC、抗IL-4-PE、抗IL-17A-APC等，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用含有0.1%皂素的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次。最后，加入適量的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。檢測這些細(xì)胞因子水平具有重要意義。Th1型細(xì)胞因子主要參與細(xì)胞免疫，IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病原體的能力，IL-2則促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2型細(xì)胞因子主要介導(dǎo)體液免疫，IL-4能夠促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)IgE的產(chǎn)生，IL-5主要促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的活化和增殖，IL-10則具有免疫抑制作用，能夠抑制Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫平衡。Th17型細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，IL-17A能夠招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞到炎癥部位，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。通過檢測這些細(xì)胞因子的水平，可以全面了解重組乳酸乳球菌免疫小鼠后機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況，為評估免疫效果提供重要依據(jù)。4.2.3幽門螺桿菌定植檢測幽門螺桿菌在小鼠胃內(nèi)的定植水平是評估重組乳酸乳球菌免疫保護(hù)效果的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究通過檢測小鼠胃組織尿素酶活性和幽門螺桿菌分離培養(yǎng)兩種方法來評估其定植水平。檢測小鼠胃組織尿素酶活性的原理基于幽門螺桿菌能產(chǎn)生大量高活性尿素酶。將小鼠脫頸椎處死后，迅速取出胃組織，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗干凈，去除表面的黏液和雜質(zhì)。稱取適量的胃組織，一般為0.1-0.2g，加入5倍體積的PBS緩沖液，使用勻漿器勻漿。將勻漿液在4℃、12000rpm離心15min，收集上清液。按照尿素酶檢測試劑盒說明書操作，取適量的上清液加入到反應(yīng)體系中，尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨，使反應(yīng)體系的pH升高，通過檢測pH的變化或氨的生成量來間接反映尿素酶活性。一般在37℃孵育15-30min后，加入顯色劑，使用酶標(biāo)儀在特定波長下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算尿素酶活性。幽門螺桿菌分離培養(yǎng)步驟如下：將小鼠胃組織剪碎，放入含有適量布氏肉湯培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)基中添加10%小牛血清、10%葡萄糖、抗生素（如萬古霉素10mg/L、多粘菌素2500U/L、二性霉素10mg/L）。將試管置于微需氧環(huán)境（85%N?、10%CO?和5%O?）、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。每天觀察培養(yǎng)基的變化，若培養(yǎng)基變混濁，表明有細(xì)菌生長。取適量培養(yǎng)物進(jìn)行涂片，革蘭染色后在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)，幽門螺桿菌呈革蘭氏陰性、螺旋狀或S形。為進(jìn)一步確認(rèn)，可進(jìn)行尿素酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)和過氧化氫酶試驗(yàn)。尿素酶試驗(yàn)中，將培養(yǎng)物接種到含有尿素和酚紅指示劑的培養(yǎng)基中，若培養(yǎng)基變紅，表明尿素酶陽性；氧化酶試驗(yàn)中，用氧化酶試劑滴加到濾紙上，再用接種環(huán)挑取培養(yǎng)物涂抹在試劑上，若在10s內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色，表明氧化酶陽性；過氧化氫酶試驗(yàn)中，將培養(yǎng)物涂抹在載玻片上，滴加3%過氧化氫溶液，若出現(xiàn)氣泡，表明過氧化氫酶陽性。通過這些試驗(yàn)，可準(zhǔn)確鑒定分離出的細(xì)菌是否為幽門螺桿菌。計算培養(yǎng)平板上的菌落數(shù)，結(jié)合胃組織的重量，可得出每克胃組織中幽門螺桿菌的定植數(shù)量。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.3.1血清和黏膜抗體檢測結(jié)果采用ELISA法檢測小鼠血清中特異性IgG抗體和腸道黏膜中SIgA抗體水平，結(jié)果顯示重組乳酸乳球菌免疫組小鼠血清中特異性IgG抗體水平在每次免疫后均顯著高于空載體乳酸乳球菌對照組、幽門螺桿菌感染對照組和正常對照組（P＜0.05）。隨著免疫次數(shù)的增加，重組乳酸乳球菌免疫組小鼠血清IgG抗體水平逐漸升高，第三次免疫后達(dá)到峰值，OD???值約為1.8，而空載體乳酸乳球菌對照組、幽門螺桿菌感染對照組和正常對照組小鼠血清IgG抗體水平在整個實(shí)驗(yàn)過程中均維持在較低水平，OD???值均小于0.5（圖7）。這表明重組乳酸乳球菌能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生系統(tǒng)性的體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高水平的特異性IgG抗體。在腸道黏膜中SIgA抗體水平檢測方面，重組乳酸乳球菌免疫組小鼠腸道黏膜中SIgA抗體水平也顯著高于空載體乳酸乳球菌對照組、幽門螺桿菌感染對照組和正常對照組（P＜0.05）。免疫三次后，重組乳酸乳球菌免疫組小鼠腸道黏膜SIgA抗體的OD???值約為1.2，而其他三組小鼠腸道黏膜SIgA抗體水平較低，OD???值均小于0.4（圖8）。這說明重組乳酸乳球菌能夠誘導(dǎo)小鼠腸道黏膜產(chǎn)生特異性SIgA抗體，增強(qiáng)黏膜局部的免疫防御能力。4.3.2細(xì)胞因子檢測結(jié)果采用ELISA法檢測小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1、Th2和Th17型細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示，重組乳酸乳球菌免疫組小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的水平顯著高于空載體乳酸乳球菌對照組、幽門螺桿菌感染對照組和正常對照組（P＜0.05）。其中，IFN-γ的濃度在重組乳酸乳球菌免疫組中約為300pg/mL，而在其他三組中均低于100pg/mL；IL-2的濃度在重組乳酸乳球菌免疫組中約為200pg/mL，其他三組則低于50pg/mL（圖9）。這表明重組乳酸乳球菌能夠促進(jìn)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。在Th2型細(xì)胞因子方面，重組乳酸乳球菌免疫組小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-4、IL-5和IL-10的水平與空載體乳酸乳球菌對照組、幽門螺桿菌感染對照組和正常對照組相比，無顯著差異（P＞0.05），說明重組乳酸乳球菌對Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響較?。▓D10）。對于Th17型細(xì)胞因子，重組乳酸乳球菌免疫組小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A的水平顯著高于空載體乳酸乳球菌對照組、幽門螺桿菌感染對照組和正常對照組（P＜0.05），其濃度約為150pg/mL，而其他三組均低于50pg/mL（圖11）。這表明重組乳酸乳球菌能夠誘導(dǎo)Th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答，在炎癥反應(yīng)和免疫防御中發(fā)揮作用。4.3.3幽門螺桿菌定植檢測結(jié)果通過檢測小鼠胃組織尿素酶活性和幽門螺桿菌分離培養(yǎng)來評估幽門螺桿菌在小鼠胃內(nèi)的定植水平。結(jié)果顯示，重組乳酸乳球菌免疫組小鼠胃組織尿素酶活性顯著低于空載體乳酸乳球菌對照組和幽門螺桿菌感染對照組（P＜0.05），與正常對照組相近。重組乳酸乳球菌免疫組小鼠胃組織尿素酶活性的吸光度值約為0.2，而空載體乳酸乳球菌對照組和幽門螺桿菌感染對照組的吸光度值分別約為0.8和0.9（圖12）。這表明重組乳酸乳球菌免疫能夠有效降低幽門螺桿菌在小鼠胃內(nèi)的定植，減少尿素酶的產(chǎn)生。幽門螺桿菌分離培養(yǎng)結(jié)果顯示，重組乳酸乳球菌免疫組小鼠胃內(nèi)幽門螺桿菌的定植數(shù)量顯著低于空載體乳酸乳球菌對照組和幽門螺桿菌感染對照組（P＜0.05）。重組乳酸乳球菌免疫組小鼠每克胃組織中幽門螺桿菌的定植數(shù)量約為1×10?CFU/g，而空載體乳酸乳球菌對照組和幽門螺桿菌感染對照組分別約為1×10?CFU/g和1×10?CFU/g（圖13）。這進(jìn)一步證實(shí)了重組乳酸乳球菌對幽門螺桿菌在小鼠胃內(nèi)定植的抑制作用，表明其具有一定的免疫保護(hù)效果。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白的重組乳酸乳球菌能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，提高血清中特異性IgG抗體和腸道黏膜中SIgA抗體水平，促進(jìn)Th1和Th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。同時，重組乳酸乳球菌免疫能夠顯著降低幽門螺桿菌在小鼠胃內(nèi)的定植水平，對幽門螺桿菌感染具有一定的保護(hù)作用，為幽門螺桿菌疫苗的研發(fā)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。五、討論5.1重組乳酸乳球菌構(gòu)建的關(guān)鍵因素在構(gòu)建表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白的重組乳酸乳球菌過程中，多個關(guān)鍵因素對構(gòu)建的成功與否以及重組蛋白的表達(dá)效果產(chǎn)生了重要影響。基因克隆是構(gòu)建重組乳酸乳球菌的基礎(chǔ)步驟，其準(zhǔn)確性和效率至關(guān)重要。在本研究中，從幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11639中擴(kuò)增napA基因時，引物的設(shè)計直接關(guān)系到擴(kuò)增的特異性和成功率。若引物設(shè)計不合理，如引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)存在錯配或引物之間存在二聚體等問題，可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或產(chǎn)生非特異性條帶。通過利用PrimerPremier5.0軟件，根據(jù)GenBank中公布的napA基因序列設(shè)計特異性引物，并在引物兩端引入合適的酶切位點(diǎn)，成功擴(kuò)增出了目的napA基因片段。然而，在實(shí)際操作中，PCR擴(kuò)增過程還受到多種因素的影響，如模板DNA的質(zhì)量和濃度、TaqDNA聚合酶的活性、dNTPs的濃度以及PCR反應(yīng)條件（包括變性、退火和延伸的溫度與時間）等。模板DNA的降解或雜質(zhì)污染可能會抑制PCR反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)量降低；TaqDNA聚合酶的活性不足或失活，無法有效催化DNA的合成；dNTPs濃度過高或過低，都會影響DNA合成的準(zhǔn)確性和效率；不合適的PCR反應(yīng)條件，如退火溫度過高或過低，會使引物與模板的結(jié)合不穩(wěn)定，從而影響擴(kuò)增效果。因此，在基因克隆過程中，需要對這些因素進(jìn)行嚴(yán)格控制和優(yōu)化，以確保獲得高質(zhì)量的目的基因片段。載體選擇是構(gòu)建重組乳酸乳球菌的另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究選用了載體質(zhì)粒pNZ8110，它具有可誘導(dǎo)表達(dá)的特性，能在乳鏈菌肽的誘導(dǎo)下啟動外源基因的表達(dá)。這種可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)對于重組蛋白的表達(dá)具有重要意義，它可以避免重組蛋白在宿主細(xì)胞生長過程中持續(xù)表達(dá)對細(xì)胞代謝的影響，提高重組蛋白的表達(dá)效率和質(zhì)量。不同的載體質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制效率、穩(wěn)定性以及對外源基因表達(dá)的調(diào)控能力等方面存在差異。一些載體可能存在拷貝數(shù)不穩(wěn)定的問題，導(dǎo)致重組質(zhì)粒在宿主細(xì)胞傳代過程中丟失，影響重組蛋白的持續(xù)表達(dá)；還有些載體的啟動子活性可能較弱，無法有效啟動外源基因的表達(dá)，或者對誘導(dǎo)物的響應(yīng)不靈敏，導(dǎo)致重組蛋白的表達(dá)量較低。因此，在選擇載體時，需要綜合考慮載體的各種特性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮托枨筮M(jìn)行合理選擇。轉(zhuǎn)化效率是決定重組乳酸乳球菌構(gòu)建成功的關(guān)鍵因素之一。本研究采用電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入乳酸乳球菌NZ3900感受態(tài)細(xì)胞中。電轉(zhuǎn)化效率受到多種因素的影響，包括細(xì)菌生長時期、電擊參數(shù)（如電壓、電阻）、電擊緩沖液的成分以及質(zhì)粒濃度等。細(xì)菌處于對數(shù)生長中期時，其細(xì)胞膜的通透性較高，此時進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，外源質(zhì)粒更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而提高轉(zhuǎn)化效率。若細(xì)菌生長時期不合適，如處于生長后期，細(xì)胞代謝活性降低，細(xì)胞膜的通透性也會發(fā)生變化，不利于外源質(zhì)粒的導(dǎo)入。電擊參數(shù)的選擇也非常重要，電壓過高可能會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，電壓過低則無法使細(xì)胞膜形成足夠的微孔讓質(zhì)粒進(jìn)入；電阻的大小會影響電流的強(qiáng)度，進(jìn)而影響電轉(zhuǎn)化的效果。電擊緩沖液的成分能夠影響細(xì)胞的生理狀態(tài)和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，合適的緩沖液可以提高電轉(zhuǎn)化效率。此外，質(zhì)粒濃度過高或過低也會對轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生負(fù)面影響，過高的質(zhì)粒濃度可能會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒聚集，影響轉(zhuǎn)化效果，而過低的質(zhì)粒濃度則會減少質(zhì)粒與細(xì)胞的接觸機(jī)會，降低轉(zhuǎn)化成功率。因此，在電轉(zhuǎn)化過程中，需要對這些因素進(jìn)行優(yōu)化，以提高轉(zhuǎn)化效率。5.2免疫效果影響因素分析在重組乳酸乳球菌對小鼠的免疫效果評價中，多種因素會對免疫效果產(chǎn)生顯著影響，深入分析這些因素對于優(yōu)化疫苗設(shè)計和提高免疫效果具有重要意義。免疫劑量是影響免疫效果的關(guān)鍵因素之一。在本研究中，灌胃接種表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白的重組乳酸乳球菌時，菌液濃度為1×10?CFU/mL，此劑量下小鼠產(chǎn)生了一定程度的免疫應(yīng)答，血清中特異性IgG抗體和腸道黏膜中SIgA抗體水平顯著升高，對幽門螺桿菌感染也有一定的保護(hù)作用。但不同的免疫劑量可能會導(dǎo)致免疫效果的差異。若免疫劑量過低，重組乳酸乳球菌攜帶的NapA抗原量不足，無法充分刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫應(yīng)答較弱，抗體產(chǎn)生量少，對幽門螺桿菌的抵抗能力也會相應(yīng)降低。例如，有研究在構(gòu)建表達(dá)其他抗原的重組乳酸乳球菌用于免疫動物時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)免疫劑量降低至一定程度后，動物血清中的抗體水平明顯下降，對病原體的感染保護(hù)率也大幅降低。相反，若免疫劑量過高，可能會引發(fā)機(jī)體的免疫耐受或免疫病理反應(yīng)。過高的抗原刺激可能會使機(jī)體的免疫系統(tǒng)處于過度激活狀態(tài)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能紊亂，產(chǎn)生免疫耐受，使后續(xù)的免疫應(yīng)答無法正常進(jìn)行。同時，過高劑量的重組乳酸乳球菌可能會對機(jī)體的胃腸道等組織造成一定的損傷，引發(fā)免疫病理反應(yīng)，影響機(jī)體的健康。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，如設(shè)置不同的免疫劑量梯度，對小鼠進(jìn)行免疫，檢測抗體水平、細(xì)胞免疫指標(biāo)以及對幽門螺桿菌感染的保護(hù)效果等，來確定最佳的免疫劑量，以獲得最佳的免疫效果。免疫途徑對重組乳酸乳球菌的免疫效果也有重要影響。本研究采用灌胃接種的方式，這是因?yàn)槿樗崛榍蚓軌蛟谖改c等黏膜部位黏附、定植，灌胃接種可以使重組乳酸乳球菌直接接觸腸道黏膜免疫系統(tǒng)，激發(fā)黏膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生腸道黏膜中SIgA抗體，增強(qiáng)黏膜局部的免疫防御能力。然而，不同的免疫途徑具有各自的特點(diǎn)和優(yōu)勢。除了灌胃接種外，還有滴鼻免疫、肌肉注射、皮下注射等免疫途徑。滴鼻免疫能夠直接將重組乳酸乳球菌遞送至呼吸道黏膜，刺激呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，對于預(yù)防呼吸道感染可能具有一定的作用。但滴鼻免疫可能存在抗原吸收不均勻、容易引起呼吸道刺激等問題。肌肉注射和皮下注射則主要激發(fā)機(jī)體的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，能夠使重組乳酸乳球菌攜帶的NapA抗原進(jìn)入血液循環(huán)，刺激脾臟等免疫器官中的免疫細(xì)胞，產(chǎn)生高水平的血清特異性IgG抗體。然而，這兩種免疫途徑無法有效激發(fā)黏膜免疫，對于預(yù)防黏膜相關(guān)的感染效果可能不如灌胃接種和滴鼻免疫。因此，在選擇免疫途徑時，需要綜合考慮疫苗的作用靶點(diǎn)、機(jī)體的免疫需求以及不同免疫途徑的優(yōu)缺點(diǎn)。可以通過對比不同免疫途徑下小鼠的免疫應(yīng)答情況，包括抗體水平、細(xì)胞免疫指標(biāo)、對幽門螺桿菌感染的保護(hù)效果以及免疫相關(guān)的不良反應(yīng)等，來確定最適合重組乳酸乳球菌的免疫途徑。免疫次數(shù)同樣會對免疫效果產(chǎn)生影響。本研究中每周免疫1次，共免疫3次，小鼠的免疫應(yīng)答隨著免疫次數(shù)的增加而逐漸增強(qiáng)，血清IgG抗體水平在第三次免疫后達(dá)到峰值。這表明多次免疫能夠持續(xù)刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞不斷增殖和分化，產(chǎn)生更多的抗體和免疫活性細(xì)胞，從而增強(qiáng)免疫效果。若免疫次數(shù)過少，機(jī)體的免疫系統(tǒng)無法得到充分的刺激，免疫應(yīng)答不充分，抗體產(chǎn)生量少，對幽門螺桿菌的抵抗能力較弱。例如，在一些疫苗研究中發(fā)現(xiàn)，只進(jìn)行一次免疫接種的動物，其抗體水平和對病原體的保護(hù)率明顯低于多次免疫的動物。相反，若免疫次數(shù)過多，可能會增加機(jī)體的負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致免疫疲勞，使免疫效果不再增強(qiáng)甚至下降。過度的免疫刺激可能會使免疫細(xì)胞的功能逐漸衰退，產(chǎn)生免疫抑制因子，抑制免疫應(yīng)答的進(jìn)一步發(fā)展。因此，需要通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化免疫次數(shù)，確定一個既能充分激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，又不會給機(jī)體帶來過度負(fù)擔(dān)的最佳免疫次數(shù)?？梢栽O(shè)置不同的免疫次數(shù)組，如免疫1次、2次、3次、4次等，觀察小鼠的免疫應(yīng)答情況，包括抗體水平的變化趨勢、細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱以及對幽門螺桿菌感染的保護(hù)效果等，來確定最適宜的免疫次數(shù)。佐劑的使用也是影響重組乳酸乳球菌免疫效果的重要因素。佐劑能夠增強(qiáng)抗原的免疫原性，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。在幽門螺桿菌疫苗研究中，常用的佐劑有大腸桿菌雙突變不耐熱毒素（dmLT）、霍亂毒素（CT）等。佐劑可以通過多種機(jī)制增強(qiáng)免疫效果，例如，它可以改變抗原的物理狀態(tài)，使抗原更易于被免疫細(xì)胞攝取和處理；還能激活免疫細(xì)胞表面的模式識別受體，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答；同時，佐劑還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，改變免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)度。在本研究中，若能添加合適的佐劑，可能會進(jìn)一步提高重組乳酸乳球菌的免疫效果，增強(qiáng)小鼠對幽門螺桿菌感染的抵抗能力。然而，佐劑的使用也可能帶來一些問題，如佐劑本身可能具有一定的毒性，可能會引發(fā)機(jī)體的不良反應(yīng)。因此，在選擇佐劑時，需要綜合考慮佐劑的增強(qiáng)免疫效果和安全性。可以通過實(shí)驗(yàn)對比不同佐劑以及不同佐劑劑量對重組乳酸乳球菌免疫效果的影響，檢測小鼠的免疫應(yīng)答指標(biāo)和不良反應(yīng)情況，篩選出既能有效增強(qiáng)免疫效果，又安全可靠的佐劑及其使用劑量。5.3研究結(jié)果的應(yīng)用前景與局限性本研究成功構(gòu)建了表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白的重組乳酸乳球菌，并對其在小鼠體內(nèi)的免疫效果進(jìn)行了評價，研究結(jié)果具有廣闊的應(yīng)用前景。在幽門螺桿菌疫苗開發(fā)領(lǐng)域，重組乳酸乳球菌展現(xiàn)出巨大的潛力。乳酸乳球菌作為全球公認(rèn)安全的微生物，可在胃腸等黏膜部位黏附、定植，以其為載體表達(dá)幽門螺桿菌NapA蛋白，能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。血清中特異性IgG抗體和腸道黏膜中SIgA抗體水平顯著升高，Th1和Th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答得到促進(jìn)，且能顯著降低幽門螺桿菌在小鼠胃內(nèi)的定植水平，對幽門螺桿菌感染具有一定的保護(hù)作用。這為開發(fā)新型的幽門螺桿菌口服疫苗提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望通過進(jìn)一步的研究和優(yōu)化，將其應(yīng)用于人類幽門螺桿菌感染的預(yù)防和治療?？诜呙缦噍^于傳統(tǒng)的抗生素治療，具有成本低、安全性高、能激發(fā)機(jī)體主動免疫等優(yōu)勢，對于降低幽門螺桿菌感染率、減少相關(guān)胃部疾病的發(fā)生具有重要意義。在免疫調(diào)節(jié)劑研究方面，本研究結(jié)果也具有一定的參考價值。重組乳酸乳球菌能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，促進(jìn)Th1和Th17型細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。這提示重組乳酸乳球菌可能作為一種新型的免疫調(diào)節(jié)劑，用于增強(qiáng)機(jī)體對其他病原體的抵抗能力，或者調(diào)節(jié)免疫失衡相關(guān)疾病的免疫狀態(tài)。例如，在一些免疫功能低下的患者中，使用重組乳酸乳球菌可能有助于提高其免疫功能，降低感染的風(fēng)險；在自身免疫性疾病的治療中，通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，有可能緩解疾病的癥狀。然而，本研究也存在一定的局限性。在免疫效果方面，雖然重組乳酸乳球菌能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答并對幽門螺桿菌感染有一定保護(hù)作用，但免疫保護(hù)效果仍有待進(jìn)一步提高。免疫劑量、免疫途徑、免疫次數(shù)以及佐劑的使用等因素均會影響免疫效果，本研究僅對其中部分因素進(jìn)行了初步探索，尚未確定最佳的免疫方案。未來需要通過更深入的實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地研究這些因素對免疫效果的影響，優(yōu)化免疫方案，以提高重組乳酸乳球菌的免疫保護(hù)效果。從安全性角度來看，盡管乳酸乳球菌被認(rèn)為是安全的微生物，但作為疫苗載體，其在長期使用過程中的安全性仍需進(jìn)一步評估。重組乳酸乳球菌在體內(nèi)的定植時間、分布情況以及是否會對機(jī)體的微生態(tài)平衡產(chǎn)生影響等問題，都需要進(jìn)一步的研究。長期定植可能會改變腸道微生物群落的組成和功能，從而對機(jī)體健康產(chǎn)生潛在影響。此外，重組乳酸乳球菌表達(dá)的NapA蛋白是否會引起過敏反應(yīng)或其他不良反應(yīng)，也需要在后續(xù)研究中進(jìn)行深入探討。在實(shí)際應(yīng)用方面，重組乳酸乳球菌的大規(guī)模生產(chǎn)和保存技術(shù)還需要進(jìn)一步完善。乳酸乳球菌的