王旭曼高級質(zhì)控經(jīng)理北京義翹神州科技股份有限公司ELISpot技術(shù)全景解讀：原理、操作要點及行業(yè)應(yīng)用CONTENT義翹神州123ELISpot技術(shù)簡介ELISpot操作流程及常見問題解析ELISpot技術(shù)的應(yīng)用4義翹神州ELISpot產(chǎn)品及檢測服務(wù)介紹01義翹神州ELISpot技術(shù)簡介義翹神州ELISpot技術(shù)原理

酶聯(lián)免疫斑點檢測（Enzyme-LinkedImmunoSpotAssay,ELISpot）：免疫細胞在刺激物存在的條件下被激活，其分泌的細胞因子/免疫球蛋白被ELISpot板底PVDF膜上（預(yù)包板）的特異性單抗捕獲，去除細胞后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的檢測抗體結(jié)合，隨后通過與堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標記的親和素結(jié)合，加入底物顯色后，PVDF膜上出現(xiàn)的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過酶聯(lián)免疫斑點分析儀（ELISpotReader）對斑點進行自動計數(shù)和分析。ELISA

檢測的是無生命的溶液中抗原分子的濃度。ELISpot檢測的是有生物活性的活細胞分泌抗原的功能。ELISAELISpot原理都是基于抗原抗體反應(yīng)，ELISpot實際上就是ELISA的延伸和新的發(fā)展測定對象抗體捕獲的抗原來自樣品溶液中的已經(jīng)存在的、均勻分布的蛋白分子抗體捕獲的抗原來自于樣品細胞在檢測的當時新鮮分泌的蛋白分子或抗體檢測板普通96孔酶標板PVDF膜96孔板檢測方式通過顯色反應(yīng)，在酶標儀上測吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白的含量通過顯色反應(yīng)，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，通過ELISpot分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，計算出分泌該蛋白的細胞的頻率義翹神州添加標題添加標題先驅(qū)發(fā)展創(chuàng)立底板材質(zhì)的改進檢測內(nèi)容的多樣化預(yù)包被

多因子檢測

熒光斑點FluoroSpot塑料微孔板作為固相材料酶標記的二抗顯色底物為瓊脂糖的凝膠DonMason：“膠片上的斑點技術(shù)”蓋玻片上包被抗原置于細胞培養(yǎng)皿的皿底分泌的特異性抗體與抗原結(jié)合加入B細胞加入放射性碘同位素標記二抗玻片上覆蓋膠片放射自顯影Sedgwich與Czerkinsky：ELISpot技術(shù)的發(fā)展歷程義翹神州0103050204高靈敏度單細胞水平功能性檢測高通量檢測直觀，可信度高只要陽性細胞頻率大于4個/60萬細胞，就可以被ELISpot檢測出來。這算出來的實際靈敏度為十五萬分之一。細胞對刺激物的反應(yīng)能力和分泌細胞因子的能力ELISpot技術(shù)優(yōu)勢02義翹神州ELISpot操作流程及常見問題義翹神州ELISpot檢測方法原理ELISpot檢測T細胞原理BiotinALPanti-IgG/biotin細胞分泌的IgGBiotinALP細胞分泌的IgGanti-IgGBiotinALP細胞分泌的IgGanti-IgGanti-IgG/biotin抗原特異性IgGELISpotTotalIgGELISpotELISpot檢測B細胞原理ELISpot操作流程BiotinALP捕獲抗體檢測抗體分析物SASASASA抗原抗原義翹神州捕獲抗體包被在培養(yǎng)孔底加入細胞及刺激物，陽性細胞分泌細胞因子，被包被的抗體捕獲移除細胞，板底留下細胞因子的潛在“影像”加入二抗，形成“抗體-抗原-抗體”夾心結(jié)構(gòu)斑點計數(shù)加入底物，形成斑點ELISpot一般操作流程無菌操作無須無菌操作ELISpot操作流程1.PVDF膜酒精浸潤2.PBS洗滌三次3.加包被抗體過夜PBS洗滌三次封閉，室溫2小時PBS洗滌三次加入細胞和刺激物于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h4.5.6.7.去除細胞，PBST洗滌5次加檢測抗體，室溫孵育2小時PBST洗滌5次

加二抗(HRP或AP）室溫孵育1hPBST洗滌5次加入

底物顯色計數(shù)，結(jié)果分析8.9.10.11.1213.14.第1天第2天第4天義翹神州懸浮在ELISpot膜板上的細胞，均勻地向四面八方分泌細胞因子，沒有方向性的擴散，其中路徑越短，擴散中耗散損失就越少，到達該點的細胞因子就越多，將來顯色的時候顏色就越深。圓形，有暈核結(jié)構(gòu)斑點的特征大小不均一，成正態(tài)分布ELISpot斑點的直徑通常是50-150μm同一類陽性細胞，受到相同的刺激，產(chǎn)生的斑點大小也不完全相同。這些斑點大小不一，但是如果把它們的直徑統(tǒng)計出來，這發(fā)現(xiàn)它們呈正態(tài)分布的。ELISpot結(jié)果分析義翹神州斑點分析底物的選擇著色稍牢固但斑點松散HRP酶TMB底物著色牢固背景干凈ALP酶BCIP/NBT底物顏色鮮艷但易褪色HRP酶AEC底物有效斑點的定義：通常為圓形或橢圓形，邊緣清晰，大小均一（與陰性對照斑點明顯區(qū)分）。陰陽性對照及實驗組需設(shè)置一致的參數(shù)（如斑點大小、強度閾值）。ELISpot結(jié)果分析AIDiSpotReader

熒光酶聯(lián)免疫斑點分析儀（可見光/熒光雙重檢測功能的ELISPOT分析儀）義翹神州ELISpot檢測的是陽性細胞的頻率，也就是出斑點的細胞占整個加入細胞的比例。ELISpot檢測的單位被定義為，每百萬細胞中陽性細胞的數(shù)目，英文SFC(Spots

Forming

cell)。有足夠的抗原呈遞細胞APCPBMC和小鼠脾臟淋巴細胞都含有足夠的APC，在特定的細胞濃度下都會發(fā)揮正常的抗原呈遞功能刺激物種類終濃度范圍(μg/ml)細胞數(shù)線性范圍推薦數(shù)目孵育時間/推薦非特異性PHA2-205,000-400,000/well100,000/well16-36h/18hConA4-40Ionomycin0.5-1PMA50-100特異性Tcellepitope1-1050,000-600,0000/well200,000/well16-24h/18hpeptide4-40200,000-600,0000/well300,000/well24-36h/30hprotein10-100300,000-600,0000/well400,000/well24-36h/30hELISpot結(jié)果分析刺激物濃度、細胞數(shù)目和孵育時間義翹神州陽性判斷標準：mouseIL-2ELISpot陰性對照組實驗組空白組陽性對照組細胞鋪板數(shù)量：2x105/孔自動化設(shè)備斑點分析ELISpot結(jié)果分析標準閾值要求適用場景2倍背景法實驗組≥2×陰性對照均值初步篩選、快速判斷均值+2×SD實驗組≥陰性對照均值+2×標準差NIH疫苗研究、常規(guī)實驗均值+3×SD實驗組≥陰性對照均值+3×標準差高嚴謹性研究（如臨床試驗）固定Cut-off值SFC≥10（且≥2倍背景）FDA/EMA推薦、文獻資料陰性對照實驗組NumberofSpots4377SFC201883細胞-+++刺激物--++義翹神州1.斑點過少、過多影響斑點形成的因素：主要原因：斑點過多：細胞密度過大斑點過少：細胞數(shù)密度低及刺激物濃度偏低改善方法：通過預(yù)實驗調(diào)整細胞數(shù)量、抗體濃度及孵育時間設(shè)立陰陽性對照2.5x105

細胞/孔1x105

細胞/孔0.5x105

細胞/孔ELISpot常見問題及解析抗體對的質(zhì)量刺激物的特異性及刺激時間細胞密度膜的材質(zhì)及處理方式洗板條件及次數(shù)

干擾因素-內(nèi)毒素污染、培養(yǎng)基成分、細胞凋亡義翹神州2.有空白區(qū)域無斑點未刺激組刺激組主要原因是PVDF膜板活化問題：膜自身問題乙醇活化過程滲漏

改善方法：活化時人工質(zhì)控使用不可拆的PVDF膜板乙醇處理后立即加水稀釋，避免活化過度對膜造成損傷ELISpot常見問題及解析義翹神州3.背景顏色過深正常顯色顯色背景深未刺激組刺激組主要原因是洗滌不充分：死細胞釋放DNA/蛋白或細胞碎片，非特異性吸附到膜上洗滌不充分改善方法：用預(yù)冷的去離子水低滲裂解細胞10min用純PBS洗滌5次（每次200μL），第一次洗滌孵育時間久一些，甩掉孔里面的洗滌液要用力顯色液要過濾后使用，終止顯色反應(yīng)時使用純PBS或去離子水，避免使用自來水。ELISpot常見問題及解析義翹神州4.細胞凋亡對結(jié)果的影響高背景、無斑點主要原因是細胞凋亡有30％細胞凋亡，完全不會出斑點；即使5％凋亡，也有嚴重影響改善方法：細胞制備及處理階段，注意無菌操作、溫和處理細胞保證細胞活率，洗滌細胞用預(yù)冷PBS減少細胞應(yīng)激反應(yīng)。預(yù)孵育或者密度梯度離心去除死細胞后，再做ELISpot實驗ELISpot常見問題及解析03義翹神州ELISpot技術(shù)的應(yīng)用義翹神州ELISpot技術(shù)的應(yīng)用疫苗研發(fā)基因與細胞治療臨床診斷器官移植基礎(chǔ)研究自身免疫與過敏疾病腫瘤免疫研究感染性疾病研究義翹神州公認標準：國際上普遍采用ELISpot方法監(jiān)測HIV疫苗研究中的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在國際艾滋病疫苗行動計劃中，采用ELISpot法對T細胞功能進行評價。ELISpot技術(shù)：疫苗免疫效果評價的有效工具原文鏈接：/10.4102/ajlm.v10i1.1056國際艾滋病疫苗倡議組織，評估非洲和歐洲經(jīng)認證實驗室在支持HIV疫苗臨床試驗過程中的ELISpot檢測能力。義翹神州疫苗誘導(dǎo)的T細胞反應(yīng)：作者對51名參與者（1μg-60μg劑量組）的外周單個核細胞（PBMCs）采用體外IFN-γELISpot法來檢測疫苗接種個體在起始劑量前（第1天）和第29天（1-50μg人群加強免疫的后7天）后的CD4+和CD8+T細胞的反應(yīng)。參考文獻：Sahin,U.,Muik,A.,Derhovanessian,E.

etal.

COVID-19vaccineBNT162b1elicitshumanantibodyandTH1Tcellresponses.

Nature

(2020).

原文鏈接：/10.1038/s41586-020-2814-7ELISpot技術(shù)：疫苗免疫效果評價的有效工具義翹神州ELISpot技術(shù)：CAR-T基礎(chǔ)研究、工藝開發(fā)、臨床評估中均發(fā)揮關(guān)鍵作用參考文獻：LeyuanMa,AlexanderHostetler,DuncanM.Morgan,etal.

Vaccine-boostedCARTcrosstalkwithhostimmunitytorejecttumorswithantigenheterogeneity

[J]

Cell,

July

20,2023.取不同治療組小鼠脾臟T細胞，ex

vivo用腫瘤細胞刺激，ELISpot檢測：CAR-T細胞+疫苗Vax強效介導(dǎo)小鼠脾臟T細胞對腫瘤細胞產(chǎn)生反應(yīng)04義翹神州義翹神州ELISpot產(chǎn)品及檢測服務(wù)介紹義翹神州組成成分數(shù)量Pre-coatedmicroplate1plate(96tests)DetectionAntibody1vialStreptavidin-ALP1vialBCIP/NTB-plusDilution1bottleBCIP/NTB-plusSolutionA1bottleBCIP/NTB-plusSolutionB1bottlepositivestimulationreagent1vial產(chǎn)品陸續(xù)更新中，敬請期待！產(chǎn)品名稱貨號Mouse

IFN-γ

(ALP)ELISpotKitEK50709AMouse

IL-2

(ALP)ELISpotKitEK51061AMouse

IL-4

(ALP)ELISpotKitEK51084AMouseTNF-α(ALP)ELISpotKitEK50349AHuman

IL-2

(ALP)ELISpotKitEK11848AHuman

IL-4

(ALP)ELISpotKitEK11846AHuman

IFN-γ

(ALP)ELISpotKitEK11725AELISpot上線產(chǎn)品義翹神州SinoBiologicalCompetitorMMouseIFN-γELISpotKitELISpot產(chǎn)品對比義翹神州檢測因子：Mouse

IFN-γ

研究方向：病毒疫苗細胞免疫分析應(yīng)用領(lǐng)域：疫苗評價SinoBiological（cat：EK50709A）Internationalbrands反饋結(jié)論：斑點清晰，背景干凈，實驗結(jié)果優(yōu)于進口品牌ELISpot產(chǎn)品客戶案例分享PBS肽義翹神州客戶使用3個批次盒子分別3次獨立實驗結(jié)果PBS肽+357313392353360PBS肽+386333292423530PBS肽+224382417292430批次01批次02批次03反饋結(jié)論：義翹神州的不同批次顯色效果穩(wěn)定，而目前使用的某品牌的不同批次經(jīng)常有顯色效果不一致的情況ELISpot產(chǎn)品客戶案例分享義翹神州服務(wù)內(nèi)容及范圍：ELISpot檢測服務(wù)、讀板服務(wù)藥物篩選、藥效評價疫苗評價免疫學(xué)、基礎(chǔ)研究項目名稱ELISpot檢測服務(wù)內(nèi)容試劑盒來源□義翹產(chǎn)品□義翹代購買

□客戶提供靶點/試劑盒名稱注意：寫明種屬如HumanormouseIFN-γ樣品數(shù)量樣品類型□人全血

□小鼠脾臟

□其它樣品檢測要求陽性對照：□每個樣品一個陽性

□

個陽性對照

□其它陰性對照：□每個樣品一個陰性

□

個陰性對照

□其它樣品重復(fù)：

□

雙復(fù)孔

□三復(fù)孔交付給客戶內(nèi)容結(jié)果數(shù)據(jù)、檢測報告樣品要求（1）樣本需冷藏保存運輸,無污染；（2）客戶自己提供試劑盒應(yīng)確保試劑盒在效期內(nèi)并按照試劑盒說明進行運輸保存；分析檢測服務(wù)：ELISpot檢測服務(wù)CRO服務(wù)現(xiàn)貨供應(yīng)生物試劑9,300+重組蛋白15,000+抗體50,000+基因ELISA試劑盒、無血清培養(yǎng)基、GMP級核酸酶...義翹神州堅持自主研發(fā)生產(chǎn)，打造生命科學(xué)研究和創(chuàng)新藥物研發(fā)“一站式”試劑與服務(wù)支撐平臺重組抗體生產(chǎn)免疫檢測重組蛋白表達生物安全檢測一站式技術(shù)服務(wù)ELISA試劑盒開發(fā)抗體制備高度定制化10天：從基因合成到抗體/蛋白交付每年：自主開發(fā)2000種以上重組蛋白和抗體自主研發(fā)并獨立掌握：以蛋白、抗體為核心的生物試劑創(chuàng)新研發(fā)全套關(guān)鍵技