ICS65.020.20DB61陜西省地方標(biāo)準(zhǔn)DB61/T21342025蘋果褐斑病早期監(jiān)測技術(shù)規(guī)范specificationoftechonologyforearlymonitoringofappleMarssoninaleafblotch2025-09-16發(fā)布2025-10-16實(shí)施陜西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB61/T2134—2025前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14樣品采集 15LAMP技術(shù)檢測 26防治技術(shù) 27檔案記錄 28證實(shí)方法 2附錄A（資料性附錄）蘋果褐斑病相關(guān)資料 3附錄B（資料性附錄）LAMP檢測技術(shù)和推薦藥劑及使用方法 4DB61/T2134—2025本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由陜西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)、陜西省植物保護(hù)工作總站、乾縣果業(yè)服務(wù)中心、米脂縣植保植檢站。本文件主要起草人：徐亮勝、黃麗麗、馮浩、王亞紅、吳曉政，鞏玉峰。本文件由西北農(nóng)林科技大學(xué)負(fù)責(zé)解釋。本文件首次發(fā)布。聯(lián)系信息如下：單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)電話：029—87091312地址：陜西省楊凌區(qū)邰成路西北農(nóng)林科技大學(xué)郵編：712100DB61/T2134—20251蘋果褐斑病早期監(jiān)測技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了蘋果褐斑病的樣品采集、LAMP技術(shù)檢測、結(jié)果判定、防治技術(shù)、檔案記錄等技術(shù)要求，描述了對應(yīng)證實(shí)方法。本文件適用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增分子檢測技術(shù)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T8321農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)loop-mediatedisothermalamplification，LAMP一種在特定恒溫條件下，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)對靶標(biāo)序列高效擴(kuò)增的技術(shù)。檢測結(jié)果通過肉眼觀察綠色熒光的生成進(jìn)行判斷。3.2蘋果褐斑病又稱綠緣褐斑病，由蘋果雙殼菌侵染所引起的真菌病害，造成生長季大量落葉，樹勢衰弱，影響蘋果產(chǎn)量。3.3帶菌率也稱田間樣品帶菌檢出率，指利用蘋果褐斑病LAMP技術(shù)檢出的陽性結(jié)果數(shù)占總樣品數(shù)的百分率。4樣品采集4.1時(shí)間開花后至套袋前，每隔10d采集一次樣品。4.2方法DB61/T2134—20252采取五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)1株，在東、西、南、北四個(gè)方位各固定1個(gè)枝條，每枝條采1張葉片，用吸水紙包好，保存于4℃冰箱備用。4.3處理樣品用0.6%次氯酸鈉表面消毒5min后，無菌水清洗3次，用無菌手術(shù)刀切取5g組織，裝進(jìn)無菌2mL離心管中提取DNA進(jìn)行LAMP檢測。5LAMP技術(shù)檢測5.1操作方法見附錄B。5.2結(jié)果判定待檢樣品加入反應(yīng)試劑50min后，液體呈綠色，判定為樣品帶菌。6防治技術(shù)6.1防治要求氣象條件適宜于褐斑病發(fā)生時(shí)，以LAMP技術(shù)檢測的田間葉片帶菌率為依據(jù)，確定化學(xué)防控時(shí)期和藥劑種類。農(nóng)藥使用按照GB/T8321（所有部分）和NY/T1276規(guī)定執(zhí)行。藥劑種類選擇見附錄B。6.2防治方法6.2.1當(dāng)檢測帶菌率小于5%時(shí)，不需要采取化學(xué)藥劑防治。6.2.2當(dāng)檢測帶菌率為5%~20%時(shí)，全園使用2次保護(hù)性殺菌劑，每次噴藥時(shí)間間隔10d~15d。6.2.3當(dāng)檢測帶菌率為21%~30%時(shí)，全園使用1次~2次內(nèi)吸性治療劑，每次噴藥時(shí)間間隔15d。6.2.4當(dāng)檢測帶菌率大于30%時(shí)，增加防治次數(shù)，縮短噴藥間隔時(shí)間。7檔案記錄7.1樣品記錄包括樣品來源、種類（品種）、時(shí)間、檢測時(shí)間、地點(diǎn)、方法和結(jié)果等；7.2防治效果記錄包括果園地點(diǎn)、品種、樹齡、噴施藥劑名稱、噴施藥劑前的病情指數(shù)、噴施藥劑后的病情指數(shù)、防治效果。7.3記錄要有檢測人員、審核人員簽字，檔案妥善保存。8證實(shí)方法采用實(shí)驗(yàn)室對照驗(yàn)證的方法對5的條款進(jìn)行證實(shí)。采用實(shí)驗(yàn)室檢測與田間試驗(yàn)相結(jié)合對6進(jìn)行證實(shí)。通過檢查LAMP數(shù)據(jù)、對照氣象記錄、檢查農(nóng)藥使用情況的方法對6.1的條款進(jìn)行證實(shí)。采用核查用藥記錄和實(shí)驗(yàn)室研究相結(jié)合的方法對6.2的條款進(jìn)行證實(shí)。DB61/T2134—20253（資料性）蘋果褐斑病相關(guān)資料A.1病原為子囊菌門蘋果雙殼菌DiplocarponmaliY.Harada&K.Sawamura。A.2發(fā)病特征A.2.1葉片發(fā)病特征一般樹冠下部和內(nèi)膛葉片先發(fā)病，常見的有針芒型、同心輪紋型、混合型和褐點(diǎn)型4種癥狀。A.2.2果實(shí)發(fā)病癥狀先出現(xiàn)淡褐色小斑點(diǎn)，逐漸擴(kuò)大為圓形、褐色、凹陷、表面有黑色小粒點(diǎn)，病部果肉褐色，海綿狀干腐。A.3發(fā)病規(guī)律病菌主要以菌絲體在病落葉中越冬，翌年春季產(chǎn)生分生孢子和子囊孢子隨風(fēng)雨傳播，直接入侵造成初侵染，條件適宜時(shí)存在多次再侵染。冬季溫暖潮濕，春雨早、雨量大，夏季陰雨連綿，發(fā)病早且重。樹冠內(nèi)膛密閉部位葉片以及樹冠下部葉片發(fā)病早且重。DB61/T2134—20254（資料性）LAMP檢測技術(shù)和推薦藥劑及使用方法B.1LAMP檢測技術(shù)B.1.1擴(kuò)增模板以提取的蘋果葉片樣品DNA為模板，以蘋果褐斑菌株105基因組DNA為陽性模板，以無菌水為陰性模板，采用特異性引物對待測樣品進(jìn)行LAMP檢測，引物見表B.1，表B.1給出了蘋果樹褐斑病LAMP檢測引物。表B.1蘋果樹褐斑病LAMP檢測引物序列B.1.2擴(kuò)增體系擴(kuò)增反應(yīng)在25μL體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系見表B.2，表B.2給出了蘋果褐斑病的LAMP檢測體系。表B.2蘋果褐斑病LAMP反應(yīng)體系（25μL）11//1B.1.3擴(kuò)增