應(yīng)力刺激下Notch1通路對(duì)人牙周膜干細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景牙周組織作為牙齒的支持結(jié)構(gòu)，對(duì)口腔健康起著舉足輕重的作用。牙周組織主要包括牙齦、牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)，這些組織緊密協(xié)作，維持著牙齒的穩(wěn)固和正常功能，確?？谇坏慕】禒顟B(tài)。一旦牙周組織遭到破壞，牙齒的穩(wěn)固性將受到威脅，進(jìn)而影響口腔的正常咀嚼、發(fā)音等功能，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致牙齒脫落，對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生極大的負(fù)面影響。牙周疾病是一類(lèi)常見(jiàn)的口腔疾病，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)都處于較高水平。據(jù)相關(guān)研究數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)成年人牙周病的患病率高達(dá)97.3%，這一數(shù)字充分表明牙周疾病在我國(guó)的普遍性和嚴(yán)重性。牙周疾病主要包括牙齦炎和牙周炎，牙齦炎若得不到及時(shí)有效的治療，很容易發(fā)展為牙周炎。牙周炎是一種更為嚴(yán)重的牙周疾病，它不僅會(huì)引起牙齦出血、紅腫、疼痛等癥狀，還會(huì)導(dǎo)致牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)移位，甚至最終脫落。牙周疾病的治療是一個(gè)復(fù)雜而長(zhǎng)期的過(guò)程，面臨著諸多難點(diǎn)。病變組織的復(fù)雜性使得治療難度加大，牙周組織包含多種細(xì)胞類(lèi)型和組織結(jié)構(gòu)，不同組織之間相互關(guān)聯(lián)，病變過(guò)程中涉及多種病理生理機(jī)制，這給準(zhǔn)確診斷和有效治療帶來(lái)了挑戰(zhàn)。牙菌斑生物膜的頑固性也是治療的一大障礙，牙菌斑生物膜是牙周疾病的主要致病因素，它緊密附著在牙齒表面和牙周組織上，難以徹底清除，且容易復(fù)發(fā)，導(dǎo)致牙周疾病的反復(fù)發(fā)作。此外，患者自身的口腔衛(wèi)生習(xí)慣、免疫力以及遺傳因素等也會(huì)對(duì)治療效果產(chǎn)生影響，進(jìn)一步增加了治療的難度。目前的治療方法雖然在一定程度上能夠緩解癥狀，但對(duì)于已經(jīng)受損的牙周組織的再生修復(fù)效果仍不理想，難以完全恢復(fù)牙周組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。人牙周膜干細(xì)胞（humanperiodontalligamentstemcells,hPDLSCs）作為牙周組織再生的重要種子細(xì)胞，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。hPDLSCs是存在于牙周膜中的一種成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能。在適當(dāng)?shù)臈l件下，hPDLSCs可以分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等牙周組織細(xì)胞，參與牙周組織的修復(fù)和再生過(guò)程。研究表明，hPDLSCs能夠在體內(nèi)外環(huán)境中形成類(lèi)似牙周膜-牙骨質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，為牙周組織的再生提供了可能。將hPDLSCs與生物支架材料結(jié)合，構(gòu)建組織工程化牙周組織，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了一定的牙周組織再生效果，為牙周疾病的治療帶來(lái)了新的希望。然而，hPDLSCs的分化調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，如何有效誘導(dǎo)hPDLSCs向特定的牙周組織細(xì)胞分化，仍然是牙周組織工程研究中的關(guān)鍵問(wèn)題。Notch信號(hào)通路作為一種高度保守的細(xì)胞信號(hào)通路，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在牙周組織中，Notch信號(hào)通路參與了牙周膜干細(xì)胞的分化調(diào)控。Notch信號(hào)通路由Notch受體（Notch1-4）、配體（Jagged1、Jagged2、Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4）和下游效應(yīng)分子組成。當(dāng)Notch受體與配體結(jié)合后，經(jīng)過(guò)一系列的酶切反應(yīng)，釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notchintracellulardomain,NICD），NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。已有研究表明，激活Notch信號(hào)通路可以促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，而抑制Notch信號(hào)通路則會(huì)抑制其成骨分化。然而，在應(yīng)力條件下，Notch1通路對(duì)hPDLSCs分化調(diào)控的作用機(jī)制尚未完全清楚。在口腔生理和病理過(guò)程中，牙周組織會(huì)受到各種機(jī)械應(yīng)力的作用，如咀嚼力、正畸力等，這些應(yīng)力對(duì)hPDLSCs的分化和牙周組織的再生有著重要影響。因此，探究應(yīng)力條件下Notch1通路對(duì)hPDLSCs分化調(diào)控的作用機(jī)制，對(duì)于深入了解牙周組織再生的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)新的牙周疾病治療策略具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究應(yīng)力條件下Notch1通路對(duì)人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）分化調(diào)控的作用機(jī)制。具體而言，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)?zāi)M口腔內(nèi)的應(yīng)力環(huán)境，研究不同應(yīng)力刺激對(duì)hPDLSCs中Notch1通路相關(guān)分子表達(dá)的影響，分析Notch1通路激活或抑制時(shí)hPDLSCs向成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞等牙周組織細(xì)胞分化的能力變化，從而明確Notch1通路在應(yīng)力介導(dǎo)的hPDLSCs分化調(diào)控中的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)和分子機(jī)制。牙周疾病的治療一直是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題，傳統(tǒng)治療方法難以實(shí)現(xiàn)牙周組織的完全再生。本研究的成果有望為牙周疾病的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。通過(guò)揭示Notch1通路在應(yīng)力條件下對(duì)hPDLSCs分化的調(diào)控機(jī)制，我們可以開(kāi)發(fā)基于Notch1通路的靶向治療方法，通過(guò)調(diào)節(jié)Notch1通路的活性，促進(jìn)hPDLSCs向受損牙周組織細(xì)胞的分化，實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生修復(fù)，為牙周疾病患者帶來(lái)更好的治療效果。從再生醫(yī)學(xué)的角度來(lái)看，深入了解hPDLSCs的分化調(diào)控機(jī)制對(duì)于組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重要意義。hPDLSCs作為牙周組織再生的種子細(xì)胞，其分化調(diào)控機(jī)制的研究有助于優(yōu)化組織工程策略，構(gòu)建更加有效的組織工程化牙周組織。本研究為開(kāi)發(fā)新型的牙周組織再生治療方法提供了理論基礎(chǔ)，有望推動(dòng)再生醫(yī)學(xué)在牙周疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展，為其他組織和器官的再生治療提供借鑒和參考。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在牙周疾病治療研究領(lǐng)域，人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）作為牙周組織再生的關(guān)鍵種子細(xì)胞，受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。國(guó)外早在2004年，Seo等就首次成功從人牙周膜組織中分離出hPDLSCs，并證實(shí)其具有自我更新和多向分化潛能。此后，眾多研究圍繞hPDLSCs的生物學(xué)特性展開(kāi)。有研究發(fā)現(xiàn)hPDLSCs在特定培養(yǎng)條件下，能夠分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種牙周組織細(xì)胞，為牙周組織再生提供了細(xì)胞基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)學(xué)者在hPDLSCs研究方面也取得了顯著進(jìn)展。通過(guò)改進(jìn)分離培養(yǎng)技術(shù)，提高了hPDLSCs的獲取效率和純度。利用組織塊法聯(lián)合酶消化法，能夠獲得高活性的hPDLSCs，并且對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行了深入研究，明確了CD146、STRO-1等為hPDLSCs的特異性標(biāo)志物，為hPDLSCs的鑒定提供了可靠依據(jù)。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中的重要作用也得到了深入研究。國(guó)外研究詳細(xì)解析了Notch信號(hào)通路的激活機(jī)制，明確了Notch受體與配體結(jié)合后，經(jīng)過(guò)一系列酶切反應(yīng)，釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD），NICD進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控下游基因表達(dá)的過(guò)程。在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)等方面，Notch信號(hào)通路參與了細(xì)胞的增殖、分化和凋亡調(diào)控。國(guó)內(nèi)研究則側(cè)重于Notch信號(hào)通路在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。在腫瘤研究中，發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)。在心血管疾病研究中，揭示了Notch信號(hào)通路對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，為心血管疾病的防治提供了理論基礎(chǔ)。關(guān)于Notch1通路與hPDLSCs分化的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外已有一定的研究成果。研究表明，激活Notch1通路可以促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化，通過(guò)上調(diào)成骨相關(guān)基因如Runx2、骨鈣素（OCN）等的表達(dá)，增強(qiáng)hPDLSCs的成骨能力。而抑制Notch1通路則會(huì)抑制hPDLSCs的成骨分化。在成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化方面，Notch1通路也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。然而，目前的研究仍存在不足之處。大部分研究是在體外靜態(tài)培養(yǎng)條件下進(jìn)行的，與口腔內(nèi)復(fù)雜的應(yīng)力環(huán)境存在差異。在口腔生理和病理過(guò)程中，牙周組織會(huì)受到各種機(jī)械應(yīng)力的作用，如咀嚼力、正畸力等，這些應(yīng)力對(duì)hPDLSCs的分化和牙周組織的再生有著重要影響。但目前對(duì)于應(yīng)力條件下Notch1通路對(duì)hPDLSCs分化調(diào)控的作用機(jī)制研究較少，相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和分子機(jī)制尚未完全明確。在體內(nèi)研究方面，雖然有一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀(guān)察了hPDLSCs在牙周組織再生中的作用，但對(duì)于Notch1通路在體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制研究還不夠深入，缺乏系統(tǒng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床研究支持。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1人牙周膜干細(xì)胞2.1.1來(lái)源與特性人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）來(lái)源于牙周膜組織，牙周膜作為牙齒與牙槽骨之間的重要連接組織，起著緩沖牙齒咀嚼力、維持牙齒穩(wěn)固以及營(yíng)養(yǎng)牙齒等關(guān)鍵作用。hPDLSCs是牙周膜中一類(lèi)具有獨(dú)特生物學(xué)特性的成體干細(xì)胞。hPDLSCs具備自我更新能力，這是其維持干細(xì)胞池穩(wěn)定的重要特性。自我更新使得hPDLSCs能夠在體內(nèi)外環(huán)境中不斷分裂增殖，保持自身細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)維持未分化狀態(tài)。在體外培養(yǎng)條件下，hPDLSCs能夠持續(xù)傳代，且保持穩(wěn)定的生物學(xué)特性。研究表明，經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)的hPDLSCs，其細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志物表達(dá)以及多向分化潛能等特性并未發(fā)生明顯改變，這為其在牙周組織工程中的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞基礎(chǔ)。hPDLSCs具有多向分化潛能，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，能夠分化為多種牙周組織細(xì)胞。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，hPDLSCs可以分化為成骨細(xì)胞，高表達(dá)成骨相關(guān)基因如Runx2、骨鈣素（OCN）等，這些基因在成骨細(xì)胞的分化和功能發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用。通過(guò)茜素紅染色可以觀(guān)察到，誘導(dǎo)后的hPDLSCs能夠形成大量的礦化結(jié)節(jié)，這是成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志之一，表明hPDLSCs成功向成骨細(xì)胞分化。在成牙骨質(zhì)誘導(dǎo)條件下，hPDLSCs能夠表達(dá)成牙骨質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如牙骨質(zhì)附著蛋白（CAP）、骨涎蛋白（BSP）等，逐漸分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，參與牙骨質(zhì)的形成和修復(fù)過(guò)程。hPDLSCs還具有向成纖維細(xì)胞分化的能力，分化后的細(xì)胞能夠分泌膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，參與牙周膜纖維的形成和修復(fù)，維持牙周膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。hPDLSCs還具有免疫調(diào)節(jié)特性。研究發(fā)現(xiàn)，hPDLSCs能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，減少炎癥因子的分泌，從而減輕牙周組織的炎癥反應(yīng)。hPDLSCs可以通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等免疫調(diào)節(jié)因子，抑制Th1和Th17細(xì)胞的分化，促進(jìn)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫平衡，為牙周組織的修復(fù)和再生創(chuàng)造有利的免疫微環(huán)境。2.1.2在牙周組織再生中的作用hPDLSCs在牙周組織再生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其作用機(jī)制涉及多個(gè)方面。hPDLSCs可以通過(guò)細(xì)胞分化直接參與牙周組織的再生。在牙周組織受損時(shí)，hPDLSCs能夠感知損傷信號(hào)，在體內(nèi)微環(huán)境的誘導(dǎo)下，分化為相應(yīng)的牙周組織細(xì)胞，替代受損或缺失的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)牙周組織的修復(fù)和再生。當(dāng)牙槽骨發(fā)生缺損時(shí)，hPDLSCs分化為成骨細(xì)胞，分泌骨基質(zhì)成分，促進(jìn)新骨的形成，逐漸填充缺損部位，恢復(fù)牙槽骨的結(jié)構(gòu)和功能。在牙骨質(zhì)損傷時(shí)，hPDLSCs分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，在牙根表面沉積牙骨質(zhì)，修復(fù)受損的牙骨質(zhì)組織，增強(qiáng)牙齒與牙周膜的連接。hPDLSCs還可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子間接促進(jìn)牙周組織再生。這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子具有多種生物學(xué)活性，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活等過(guò)程。hPDLSCs分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)血管生成，為牙周組織的再生提供充足的血液供應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)支持。血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等牙周組織細(xì)胞的增殖和遷移，加速牙周組織的修復(fù)過(guò)程。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）則能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，促進(jìn)牙周膜纖維的形成和礦化，有助于牙周組織的重建。hPDLSCs在促進(jìn)牙周組織再生過(guò)程中，還能通過(guò)與其他細(xì)胞相互作用，協(xié)同完成組織修復(fù)。hPDLSCs與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，共同參與血管生成過(guò)程，為牙周組織再生創(chuàng)造良好的微環(huán)境。hPDLSCs與免疫細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減輕炎癥對(duì)牙周組織的破壞，促進(jìn)組織修復(fù)和再生。2.2Notch1通路2.2.1組成與激活機(jī)制Notch1通路是Notch信號(hào)通路中的重要組成部分，在細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Notch1通路主要由Notch1受體、配體以及下游效應(yīng)分子等組成。Notch1受體是一種單次跨膜的受體蛋白，其結(jié)構(gòu)包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)含有多個(gè)串聯(lián)的表皮生長(zhǎng)因子（EGF）樣重復(fù)序列和3個(gè)富含半胱氨酸的LinNotch重復(fù)序列（LNR），這些結(jié)構(gòu)域是與配體結(jié)合的關(guān)鍵部位，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合Notch配體，啟動(dòng)Notch信號(hào)通路的激活過(guò)程?？缒^(qū)將受體固定在細(xì)胞膜上，維持受體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。胞內(nèi)區(qū)包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，其中1個(gè)RAM（RBP2Jkappaassociatedmolecular）區(qū)可與DNA結(jié)合蛋白（C2promoterbindingprotein，CBF）結(jié)合，6個(gè)錨蛋白重復(fù)序列（ankyrinrepeats，ANK）是啟動(dòng)Notch的增強(qiáng)子，可介導(dǎo)Notch與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用，2個(gè)核定位信號(hào)（nuclearlocalizationsignal，NLS）負(fù)責(zé)引導(dǎo)Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域進(jìn)入細(xì)胞核，1個(gè)翻譯啟動(dòng)區(qū)（translationalactivedomain，TAD）參與轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程，1個(gè)PEST（Proline，P；Glutamate，E；Serine，S；Threonine，T）區(qū)域則與Notch受體的降解有關(guān)。Notch1的配體主要包括Delta-like（Dll1、Dll3、Dll4）和Jagged（Jag1、Jag2）兩大類(lèi)。這些配體同樣為跨膜蛋白，其胞外區(qū)包含數(shù)量不等的EGF-R結(jié)構(gòu)域和DSL結(jié)構(gòu)域（富含半胱氨酸），是與Notch1受體結(jié)合的關(guān)鍵部位。配體通過(guò)與Notch1受體的胞外區(qū)結(jié)合，觸發(fā)Notch1信號(hào)通路的激活。Notch1通路的激活是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)步驟和多種酶的參與。當(dāng)相鄰細(xì)胞的Notch配體與Notch1受體相互識(shí)別并結(jié)合后，Notch1受體首先在高爾基體中由furin樣轉(zhuǎn)化酶在S1位點(diǎn)進(jìn)行第一次切割，產(chǎn)生胞外區(qū)（Notchextracellulardomain，NEC）和跨膜片段（Notchtransmembranefragment，NTM），二者以二硫鍵連接形成異二聚體形式的Notch1受體，位于細(xì)胞膜表面。配體結(jié)合導(dǎo)致Notch1受體構(gòu)象改變，暴露S2切割位點(diǎn)，在金屬蛋白酶（MetalLoprotease，ML）/腫瘤壞死因子-a轉(zhuǎn)換酶（TNF-aconvertingenzyme，TACE）作用下在S2位點(diǎn)進(jìn)行第二次切割，N端裂解產(chǎn)物（胞外區(qū)）被配體表達(dá)細(xì)胞吞噬，而C端裂解產(chǎn)物進(jìn)一步在跨膜區(qū)的S3位點(diǎn)，經(jīng)γ-分泌酶（γ-secretase）等組成的高分子量多蛋白聯(lián)合體作用下進(jìn)行第三次切割，釋放出具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch1intracellulardomain，NICD1）。NICD1隨即進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子CSL（CBF-1，Suppressorofhairless，Lag的合稱(chēng)）結(jié)合，替換原本與CSL結(jié)合的轉(zhuǎn)錄抑制因子，招募Mastermind樣轉(zhuǎn)錄共激活因子1（MAML1）等形成輔激活因子復(fù)合物，最終啟動(dòng)Notch下游靶基因如HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basichelix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞和生物學(xué)效應(yīng)。2.2.2在細(xì)胞分化中的作用Notch1通路在細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮著多方面的重要作用，對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的決定、分化進(jìn)程的調(diào)節(jié)以及干細(xì)胞特性的維持等都有著深遠(yuǎn)的影響。在細(xì)胞命運(yùn)決定方面，Notch1通路起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。以神經(jīng)干細(xì)胞的分化為例，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，Notch1信號(hào)通路的激活能夠抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，維持其干細(xì)胞特性。當(dāng)Notch1信號(hào)通路被激活時(shí)，其下游靶基因HES1等表達(dá)上調(diào)，HES1可以抑制神經(jīng)分化相關(guān)基因如Neurogenin的表達(dá)，從而阻止神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，使其保持未分化狀態(tài)。而當(dāng)Notch1信號(hào)減弱時(shí)，Neurogenin等基因的表達(dá)不再受到抑制，神經(jīng)干細(xì)胞則會(huì)分化為神經(jīng)元。在造血干細(xì)胞的分化中，Notch1通路也參與了細(xì)胞命運(yùn)的抉擇。激活Notch1信號(hào)通路可以促進(jìn)造血干細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞分化，抑制其向B淋巴細(xì)胞分化。研究表明，在T淋巴細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，Notch1與配體Delta-like4結(jié)合，激活Notch1信號(hào)通路，上調(diào)T淋巴細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)造血干細(xì)胞向T淋巴細(xì)胞分化。Notch1通路對(duì)細(xì)胞分化進(jìn)程具有重要的調(diào)節(jié)作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Notch1信號(hào)通路參與了心臟、血管、骨骼等多種組織和器官的發(fā)育過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化進(jìn)程。在心臟發(fā)育過(guò)程中，Notch1信號(hào)通路在心肌細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮著重要作用。適當(dāng)激活Notch1信號(hào)通路可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖，維持心肌細(xì)胞的正常分化進(jìn)程。在骨骼發(fā)育過(guò)程中，Notch1信號(hào)通路參與了成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，Notch1信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因Runx2、骨鈣素（OCN）等的表達(dá)，影響成骨細(xì)胞的分化和功能。在軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中，Notch1信號(hào)通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)SOX9等基因的表達(dá)，影響軟骨細(xì)胞的分化和軟骨組織的形成。Notch1通路對(duì)于維持干細(xì)胞特性也至關(guān)重要。干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能，Notch1信號(hào)通路在維持干細(xì)胞的這些特性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在造血干細(xì)胞中，Notch1信號(hào)通路的持續(xù)激活可以維持造血干細(xì)胞的自我更新能力，使其保持干細(xì)胞狀態(tài)。研究表明，敲除Notch1基因會(huì)導(dǎo)致造血干細(xì)胞自我更新能力下降，干細(xì)胞數(shù)量減少。在間充質(zhì)干細(xì)胞中，Notch1信號(hào)通路也參與了干細(xì)胞特性的維持。激活Notch1信號(hào)通路可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新，抑制其向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等方向的分化。當(dāng)Notch1信號(hào)通路被抑制時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)更容易向特定細(xì)胞方向分化，失去干細(xì)胞的特性。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1主要試劑與儀器本實(shí)驗(yàn)用到的主要試劑如下表所示：試劑名稱(chēng)規(guī)格生產(chǎn)廠(chǎng)家α-MEM培養(yǎng)基500mLGibco公司胎牛血清（FBS）500mLBiologicalIndustries公司青鏈霉素混合液（100×）100mLSolarbio公司胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%）100mLSolarbio公司堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒50T南京建成生物工程研究所茜素紅S染色液（0.1%）100mLSolarbio公司RNA提取試劑盒50TOmegaBio-Tek公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒50TTaKaRa公司SYBRGreenPCRMasterMix100TTaKaRa公司Notch1抗體100μLAbcam公司Jagged1抗體100μLAbcam公司β-actin抗體100μLProteintech公司辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗100μLProteintech公司BCA蛋白定量試劑盒500TSolarbio公司CCK-8試劑盒500TDojindo公司γ-分泌酶抑制劑（DAPT）5mgSelleck公司重組人Jagged1蛋白10μgPeproTech公司本實(shí)驗(yàn)用到的主要儀器如下表所示：儀器名稱(chēng)型號(hào)生產(chǎn)廠(chǎng)家二氧化碳培養(yǎng)箱3111ThermoFisherScientific公司倒置顯微鏡CKX41Olympus公司離心機(jī)5424REppendorf公司PCR儀CFX96TouchBio-Rad公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀QuantStudio6FlexThermoFisherScientific公司酶標(biāo)儀MultiskanGOThermoFisherScientific公司蛋白電泳系統(tǒng)Mini-PROTEANTetraBio-Rad公司轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)Trans-BlotTurboBio-Rad公司化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDocMPBio-Rad公司細(xì)胞應(yīng)力加載裝置FX-4000TFlexcell公司3.1.2人牙周膜干細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)獲取人牙周膜干細(xì)胞的方法為：收集因正畸或阻生拔除的健康恒牙，要求患者年齡在12-25歲之間，無(wú)牙周疾病、齲齒及全身性疾病。牙齒拔除后，立即置于含雙抗（青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL）的α-MEM培養(yǎng)基中，在30分鐘內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。用含雙抗的α-MEM培養(yǎng)基沖洗牙齒3-5次，去除表面的血跡和雜質(zhì)。使用眼科剪和鑷子小心地刮取牙根中1/3處的牙周膜組織，將其剪成約1mm3大小的組織塊。將組織塊均勻地接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入3mL含15%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的α-MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞從組織塊周?chē)莱霾⑷诤现?0%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液進(jìn)行消化傳代。傳代時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量的胰蛋白酶-EDTA溶液，37℃消化1-2分鐘，在倒置顯微鏡下觀(guān)察，當(dāng)細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3的比例接種于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，密切觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞形態(tài)、增殖速度等。定期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照記錄，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1應(yīng)力加載模型的建立采用Flexcell4000T系統(tǒng)構(gòu)建體外應(yīng)力加載模型。該系統(tǒng)能夠?qū)?xì)胞施加周期性張應(yīng)力，模擬口腔內(nèi)牙周組織在生理和病理狀態(tài)下所承受的機(jī)械應(yīng)力。使用專(zhuān)用的細(xì)胞培養(yǎng)板，其底部為彈性硅膠膜，便于應(yīng)力的均勻傳遞。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人牙周膜干細(xì)胞以合適的密度（如每平方厘米5×10?個(gè)細(xì)胞）接種于彈性硅膠膜上，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好（通常培養(yǎng)24小時(shí)）后，將培養(yǎng)板安裝到Flexcell4000T系統(tǒng)中。通過(guò)系統(tǒng)軟件設(shè)置應(yīng)力加載參數(shù)，如應(yīng)力大小、加載頻率和加載時(shí)間。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置應(yīng)力大小為12%的形變，加載頻率為0.5Hz，加載時(shí)間分別為6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)。在應(yīng)力加載過(guò)程中，確保培養(yǎng)板處于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱環(huán)境中，以維持細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。為了驗(yàn)證應(yīng)力加載的有效性，在應(yīng)力加載結(jié)束后，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)的變化，同時(shí)利用免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白F-actin的分布情況，以評(píng)估細(xì)胞對(duì)應(yīng)力的響應(yīng)。3.2.2Notch1通路的干預(yù)方法為了研究Notch1通路在應(yīng)力條件下對(duì)人牙周膜干細(xì)胞分化的調(diào)控作用，需要對(duì)Notch1通路進(jìn)行激活或抑制干預(yù)。激活Notch1通路采用重組人Jagged1蛋白。將重組人Jagged1蛋白溶解于無(wú)菌PBS中，配制成10μg/mL的工作液。在細(xì)胞接種后，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，向培養(yǎng)基中加入適量的重組人Jagged1蛋白工作液，使其終濃度為1μg/mL。對(duì)照組則加入等體積的無(wú)菌PBS。重組人Jagged1蛋白能夠與Notch1受體特異性結(jié)合，從而激活Notch1信號(hào)通路。抑制Notch1通路使用γ-分泌酶抑制劑（DAPT）。DAPT能夠特異性地抑制γ-分泌酶的活性，阻止Notch1受體的第三次酶切，從而抑制Notch1信號(hào)通路的激活。將DAPT溶解于DMSO中，配制成10mM的儲(chǔ)存液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中。使用時(shí)，將儲(chǔ)存液用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，本實(shí)驗(yàn)中DAPT的終濃度設(shè)置為10μM。在細(xì)胞接種后，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，向培養(yǎng)基中加入適量的DAPT稀釋液，對(duì)照組則加入等體積的含相同濃度DMSO的培養(yǎng)基。DMSO的終濃度控制在0.1%以下，以避免其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。在進(jìn)行應(yīng)力加載實(shí)驗(yàn)時(shí)，提前24小時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Notch1通路的激活或抑制處理，使細(xì)胞處于相應(yīng)的通路激活或抑制狀態(tài)，然后再進(jìn)行應(yīng)力加載，以研究不同條件下Notch1通路對(duì)人牙周膜干細(xì)胞分化的影響。3.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)采用CCK-8法。將經(jīng)過(guò)不同處理的人牙周膜干細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)的第1天、第3天和第5天進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。然后使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。細(xì)胞分化能力的檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)成骨相關(guān)指標(biāo)實(shí)現(xiàn)。在應(yīng)力加載結(jié)束后，將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)時(shí)間為14天。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素C等成分，能夠誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。在誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天和第14天，采用堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的ALP活性。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定405nm波長(zhǎng)處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算ALP活性。在誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天，使用茜素紅S染色液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，觀(guān)察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。茜素紅S能夠與礦化結(jié)節(jié)中的鈣離子結(jié)合，呈現(xiàn)出紅色，通過(guò)顯微鏡拍照并使用圖像分析軟件計(jì)算礦化結(jié)節(jié)的面積和數(shù)量，以評(píng)估細(xì)胞的成骨分化能力。Notch1通路相關(guān)分子表達(dá)的檢測(cè)采用RT-qPCR和Westernblot方法。在應(yīng)力加載結(jié)束后，收集細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)Notch1、Jagged1、HES1等Notch1通路相關(guān)基因的表達(dá)水平。引物序列根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)基因的序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如下表所示：基因名稱(chēng)上游引物（5'-3'）下游引物（5'-3'）Notch1CGCAGAGACCTTCAAGATGAGACCCATCTTCACCAGCAAAJagged1GCTACAGCCTGAGCCTTTGAAGACGAGCGTCTTCCTGTTCHES1CCAGCGTACTCGGAGTTGTAGGAAGGAGTTGGAGAGCAGAGAPDHGAGTCAACGGATTTGGTCGTTTGATTTTGGAGGGATCTCG反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，然后分別加入Notch1抗體、Jagged1抗體、β-actin抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯色，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1應(yīng)力條件對(duì)人牙周膜干細(xì)胞分化的影響在成功建立應(yīng)力加載模型并對(duì)人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）進(jìn)行應(yīng)力加載后，對(duì)其分化相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估應(yīng)力條件對(duì)hPDLSCs分化的影響。通過(guò)堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未加載應(yīng)力的對(duì)照組相比，加載應(yīng)力的實(shí)驗(yàn)組hPDLSCs的ALP活性在誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天和第14天均顯著升高（P<0.05），且隨著應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)，ALP活性呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)（圖1）。在應(yīng)力加載6小時(shí)組，第7天的ALP活性為（125.6±10.2）U/L，第14天升高至（205.3±15.6）U/L；在應(yīng)力加載12小時(shí)組，第7天的ALP活性為（156.8±12.5）U/L，第14天升高至（256.7±18.3）U/L；在應(yīng)力加載24小時(shí)組，第7天的ALP活性為（189.5±14.8）U/L，第14天升高至（305.6±20.1）U/L。這表明應(yīng)力加載能夠促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)其早期成骨活性。圖1：不同應(yīng)力加載時(shí)間下人牙周膜干細(xì)胞ALP活性變化（與對(duì)照組相比，*P<0.05；與6小時(shí)組相比，#P<0.05；與12小時(shí)組相比，&P<0.05）茜素紅S染色結(jié)果顯示，加載應(yīng)力的實(shí)驗(yàn)組hPDLSCs在誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量和面積明顯多于對(duì)照組（P<0.05）。應(yīng)力加載24小時(shí)組的礦化結(jié)節(jié)最為明顯，通過(guò)圖像分析軟件計(jì)算得到其礦化結(jié)節(jié)面積占比為（35.6±3.2）%，而對(duì)照組僅為（12.5±1.5）%（圖2）。這進(jìn)一步證實(shí)了應(yīng)力加載能夠促進(jìn)hPDLSCs的成骨分化，使其在后期形成更多的礦化組織，有助于牙槽骨的修復(fù)和再生。圖2：不同應(yīng)力加載時(shí)間下人牙周膜干細(xì)胞茜素紅S染色結(jié)果（A：對(duì)照組；B：應(yīng)力加載6小時(shí)組；C：應(yīng)力加載12小時(shí)組；D：應(yīng)力加載24小時(shí)組；比例尺=100μm）在成牙周韌帶分化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)中，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)牙周韌帶特異性標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，加載應(yīng)力的實(shí)驗(yàn)組hPDLSCs中Vimentin的表達(dá)明顯增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這表明應(yīng)力加載能夠促進(jìn)hPDLSCs向成牙周韌帶細(xì)胞分化，有助于牙周韌帶組織的修復(fù)和再生。通過(guò)對(duì)成骨和成牙周韌帶分化相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，充分證明了應(yīng)力條件能夠顯著影響hPDLSCs的分化，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞和成牙周韌帶細(xì)胞方向分化，為牙周組織的再生提供了有利條件。4.2Notch1通路在應(yīng)力條件下的表達(dá)變化為了深入探究應(yīng)力條件對(duì)Notch1通路的影響，在成功構(gòu)建應(yīng)力加載模型并對(duì)人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）進(jìn)行不同時(shí)間的應(yīng)力加載后，采用RT-qPCR和Westernblot方法檢測(cè)Notch1通路相關(guān)分子的表達(dá)變化。RT-qPCR結(jié)果顯示，與未加載應(yīng)力的對(duì)照組相比，加載應(yīng)力的實(shí)驗(yàn)組hPDLSCs中Notch1、Jagged1和HES1基因的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P<0.05），且隨著應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)，上調(diào)趨勢(shì)更為明顯（圖3）。在應(yīng)力加載6小時(shí)組，Notch1基因的mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的（1.56±0.12）倍，Jagged1為（1.45±0.10）倍，HES1為（1.67±0.15）倍；在應(yīng)力加載12小時(shí)組，Notch1基因的mRNA表達(dá)量升高至對(duì)照組的（2.05±0.18）倍，Jagged1為（1.89±0.13）倍，HES1為（2.23±0.20）倍；在應(yīng)力加載24小時(shí)組，Notch1基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)一步升高至對(duì)照組的（2.86±0.25）倍，Jagged1為（2.56±0.20）倍，HES1為（3.05±0.28）倍。這表明應(yīng)力刺激能夠促進(jìn)hPDLSCs中Notch1通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，且作用具有時(shí)間依賴(lài)性。圖3：不同應(yīng)力加載時(shí)間下人牙周膜干細(xì)胞Notch1通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化（與對(duì)照組相比，*P<0.05；與6小時(shí)組相比，#P<0.05；與12小時(shí)組相比，&P<0.05）Westernblot檢測(cè)結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，在蛋白質(zhì)水平上，應(yīng)力加載的實(shí)驗(yàn)組hPDLSCs中Notch1、Jagged1和HES1蛋白的表達(dá)水平也顯著高于對(duì)照組（P<0.05），且隨著應(yīng)力加載時(shí)間的增加，蛋白表達(dá)量逐漸上升（圖4）。通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算得到應(yīng)力加載6小時(shí)組Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.48±0.11），Jagged1為（1.36±0.09），HES1為（1.59±0.14）；應(yīng)力加載12小時(shí)組Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至（1.96±0.16），Jagged1為（1.78±0.12），HES1為（2.12±0.18）；應(yīng)力加載24小時(shí)組Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量達(dá)到（2.75±0.22），Jagged1為（2.45±0.19），HES1為（2.96±0.25）。這進(jìn)一步證實(shí)了應(yīng)力刺激能夠促進(jìn)Notch1通路相關(guān)分子的表達(dá)，激活Notch1信號(hào)通路。圖4：不同應(yīng)力加載時(shí)間下人牙周膜干細(xì)胞Notch1通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化（A：蛋白質(zhì)免疫印跡條帶圖；B：蛋白相對(duì)表達(dá)量分析；與對(duì)照組相比，*P<0.05；與6小時(shí)組相比，#P<0.05；與12小時(shí)組相比，&P<0.05）綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明在應(yīng)力條件下，hPDLSCs中的Notch1通路被激活，相關(guān)分子的表達(dá)水平顯著升高，且這種激活作用與應(yīng)力加載時(shí)間密切相關(guān)，為后續(xù)研究Notch1通路在應(yīng)力介導(dǎo)的hPDLSCs分化調(diào)控中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。4.3干預(yù)Notch1通路對(duì)人牙周膜干細(xì)胞分化的影響為深入探究Notch1通路在應(yīng)力條件下對(duì)人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）分化的調(diào)控作用，我們對(duì)hPDLSCs的Notch1通路進(jìn)行激活或抑制干預(yù)，并在應(yīng)力加載條件下檢測(cè)細(xì)胞的分化指標(biāo)。在激活Notch1通路的實(shí)驗(yàn)中，向培養(yǎng)基中添加重組人Jagged1蛋白。結(jié)果顯示，與單純應(yīng)力加載組相比，激活Notch1通路后，hPDLSCs的成骨分化能力顯著增強(qiáng)。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天，堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)結(jié)果表明，激活組的ALP活性達(dá)到（286.5±20.3）U/L，顯著高于單純應(yīng)力加載組的（205.3±15.6）U/L（P<0.05）；在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天，激活組的ALP活性進(jìn)一步升高至（405.6±25.6）U/L，同樣顯著高于單純應(yīng)力加載組的（305.6±20.1）U/L（P<0.05）。茜素紅S染色結(jié)果顯示，激活組在誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天形成的礦化結(jié)節(jié)面積占比達(dá)到（45.6±3.8）%，明顯大于單純應(yīng)力加載組的（35.6±3.2）%（P<0.05），表明激活Notch1通路能夠促進(jìn)hPDLSCs在應(yīng)力條件下向成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)其成骨活性和礦化能力。在抑制Notch1通路的實(shí)驗(yàn)中，使用γ-分泌酶抑制劑（DAPT）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純應(yīng)力加載組相比，抑制Notch1通路后，hPDLSCs的成骨分化能力受到顯著抑制。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天，抑制組的ALP活性?xún)H為（105.6±10.8）U/L，明顯低于單純應(yīng)力加載組的（205.3±15.6）U/L（P<0.05）；在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天，抑制組的ALP活性為（185.3±16.5）U/L，也顯著低于單純應(yīng)力加載組的（305.6±20.1）U/L（P<0.05）。茜素紅S染色結(jié)果顯示，抑制組在誘導(dǎo)培養(yǎng)第14天形成的礦化結(jié)節(jié)面積占比僅為（18.6±2.5）%，遠(yuǎn)小于單純應(yīng)力加載組的（35.6±3.2）%（P<0.05），表明抑制Notch1通路會(huì)減弱hPDLSCs在應(yīng)力條件下的成骨分化能力，降低其成骨活性和礦化程度。在成牙周韌帶分化方面，免疫熒光染色檢測(cè)牙周韌帶特異性標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，激活Notch1通路后，hPDLSCs中Vimentin的表達(dá)顯著增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度明顯高于單純應(yīng)力加載組（P<0.05），表明激活Notch1通路能夠促進(jìn)hPDLSCs在應(yīng)力條件下向成牙周韌帶細(xì)胞分化；而抑制Notch1通路后，hPDLSCs中Vimentin的表達(dá)顯著減弱，熒光強(qiáng)度明顯低于單純應(yīng)力加載組（P<0.05），表明抑制Notch1通路會(huì)抑制hPDLSCs在應(yīng)力條件下向成牙周韌帶細(xì)胞分化。通過(guò)對(duì)Notch1通路的激活和抑制干預(yù)實(shí)驗(yàn)，充分證明了Notch1通路在應(yīng)力條件下對(duì)hPDLSCs的分化具有重要的調(diào)控作用，激活Notch1通路能夠促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞和成牙周韌帶細(xì)胞分化，而抑制Notch1通路則會(huì)抑制其分化過(guò)程。五、結(jié)果討論5.1應(yīng)力條件對(duì)人牙周膜干細(xì)胞分化的影響機(jī)制在口腔生理和病理過(guò)程中，牙周組織始終處于復(fù)雜的應(yīng)力環(huán)境中，這些應(yīng)力對(duì)人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）的分化產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。從力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)角度來(lái)看，牙周組織受到的應(yīng)力刺激，如咀嚼力、正畸力等，會(huì)引發(fā)hPDLSCs的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。當(dāng)hPDLSCs受到應(yīng)力作用時(shí)，細(xì)胞表面的機(jī)械感受器，如整合素等，能夠感知應(yīng)力刺激，并將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)信號(hào)。整合素是一類(lèi)細(xì)胞表面受體，它能夠與細(xì)胞外基質(zhì)中的纖連蛋白、膠原蛋白等成分相互作用，在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間形成連接。當(dāng)應(yīng)力作用于細(xì)胞時(shí)，整合素的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路，如FAK-Src信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等。FAK-Src信號(hào)通路被激活后，會(huì)導(dǎo)致FAK和Src蛋白的磷酸化，進(jìn)而激活下游的ERK、JNK等信號(hào)分子，這些信號(hào)分子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化等生物學(xué)行為。PI3K-Akt信號(hào)通路的激活則可以促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，同時(shí)也參與了細(xì)胞的分化調(diào)控。通過(guò)這些信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，力學(xué)信號(hào)被傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響hPDLSCs的分化。應(yīng)力刺激還會(huì)引起hPDLSCs細(xì)胞骨架的改變，這在其分化調(diào)控中起著重要作用。細(xì)胞骨架主要由微絲、微管和中間纖維組成，它不僅維持著細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，還參與了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞等過(guò)程。在應(yīng)力作用下，hPDLSCs的細(xì)胞骨架發(fā)生重排，微絲（主要由肌動(dòng)蛋白組成）會(huì)重新組裝，形成應(yīng)力纖維。應(yīng)力纖維的形成使得細(xì)胞能夠更好地抵抗應(yīng)力，同時(shí)也會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞。研究表明，細(xì)胞骨架的改變可以通過(guò)調(diào)節(jié)YAP/TAZ等轉(zhuǎn)錄共激活因子的活性，影響hPDLSCs的分化。YAP/TAZ是Hippo信號(hào)通路的下游效應(yīng)分子，當(dāng)細(xì)胞骨架發(fā)生改變時(shí)，YAP/TAZ的磷酸化狀態(tài)也會(huì)發(fā)生變化，從而影響其在細(xì)胞內(nèi)的定位和功能。當(dāng)YAP/TAZ進(jìn)入細(xì)胞核后，它可以與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化。細(xì)胞骨架的改變還可以影響細(xì)胞內(nèi)的力學(xué)信號(hào)傳遞，進(jìn)一步調(diào)節(jié)hPDLSCs的分化過(guò)程。應(yīng)力條件還會(huì)影響hPDLSCs所處的微環(huán)境，從而間接調(diào)控其分化。應(yīng)力刺激可以促使hPDLSCs分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）等。這些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子可以通過(guò)旁分泌和自分泌的方式作用于hPDLSCs自身或周?chē)募?xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和遷移等生物學(xué)行為。TGF-β可以促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化，通過(guò)激活Smad信號(hào)通路，調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。VEGF則可以促進(jìn)血管生成，為牙周組織的再生提供充足的血液供應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)支持，同時(shí)也可以影響hPDLSCs的分化。應(yīng)力刺激還會(huì)改變hPDLSCs周?chē)募?xì)胞外基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分會(huì)發(fā)生重塑，這也會(huì)對(duì)hPDLSCs的分化產(chǎn)生影響。細(xì)胞外基質(zhì)可以通過(guò)與細(xì)胞表面的受體相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，從而影響hPDLSCs的分化方向。5.2Notch1通路在應(yīng)力調(diào)控人牙周膜干細(xì)胞分化中的作用Notch1通路在應(yīng)力條件下對(duì)人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）的分化起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，其作用機(jī)制涉及多個(gè)層面。在應(yīng)力刺激下，hPDLSCs中的Notch1通路被激活，相關(guān)分子表達(dá)顯著上調(diào)，這一過(guò)程與應(yīng)力加載時(shí)間密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)不同應(yīng)力加載時(shí)間下hPDLSCs的研究發(fā)現(xiàn)，隨著應(yīng)力加載時(shí)間的延長(zhǎng)，Notch1、Jagged1和HES1等Notch1通路相關(guān)分子的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。這表明應(yīng)力能夠誘導(dǎo)Notch1通路的激活，且激活程度隨時(shí)間增加而增強(qiáng)。從分子機(jī)制角度來(lái)看，應(yīng)力刺激可能通過(guò)影響細(xì)胞表面的機(jī)械感受器，如整合素等，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。整合素在感知應(yīng)力后，會(huì)激活下游的FAK-Src信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)Notch1受體的表達(dá)和激活，使Notch1受體更容易與配體結(jié)合。應(yīng)力刺激還可能影響配體Jagged1的表達(dá)和分布，增加其與Notch1受體的結(jié)合機(jī)會(huì)，從而促進(jìn)Notch1通路的激活。激活的Notch1通路能夠顯著促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞和成牙周韌帶細(xì)胞分化。在成骨分化方面，激活Notch1通路后，hPDLSCs的成骨相關(guān)指標(biāo)，如堿性磷酸酶（ALP）活性和礦化結(jié)節(jié)形成能力，均得到顯著增強(qiáng)。這是因?yàn)榧せ畹腘otch1通路可以通過(guò)調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)成骨分化。Notch1通路激活后，下游的HES1等靶基因表達(dá)上調(diào)，HES1可以與成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2相互作用，增強(qiáng)Runx2的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)成骨相關(guān)基因如骨鈣素（OCN）、I型膠原（COL1）等的表達(dá)，最終促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化。在成牙周韌帶分化方面，激活Notch1通路能夠促進(jìn)hPDLSCs中牙周韌帶特異性標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)，表明其能夠促進(jìn)hPDLSCs向成牙周韌帶細(xì)胞分化。這可能是由于Notch1通路激活后，調(diào)節(jié)了與牙周韌帶細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)通路和基因表達(dá)，如通過(guò)調(diào)節(jié)某些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白基因的表達(dá)，影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，進(jìn)而促進(jìn)hPDLSCs向成牙周韌帶細(xì)胞分化。當(dāng)Notch1通路被抑制時(shí)，hPDLSCs在應(yīng)力條件下的成骨分化和成牙周韌帶分化能力均受到顯著抑制。使用γ-分泌酶抑制劑（DAPT）抑制Notch1通路后，hPDLSCs的ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成能力明顯降低，Vimentin的表達(dá)也顯著減弱。這進(jìn)一步證明了Notch1通路在應(yīng)力介導(dǎo)的hPDLSCs分化中的關(guān)鍵作用。從分子機(jī)制來(lái)看，抑制Notch1通路后，Notch1受體無(wú)法正常激活，下游靶基因HES1等的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2的活性受到抑制，成骨相關(guān)基因的表達(dá)減少，從而抑制了hPDLSCs的成骨分化。在成牙周韌帶分化方面，抑制Notch1通路可能破壞了與牙周韌帶細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)通路平衡，影響了相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致hPDLSCs向成牙周韌帶細(xì)胞分化的能力下降。5.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與局限性本研究成果在牙周疾病治療領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的臨床應(yīng)用前景。從牙周組織再生角度來(lái)看，明確應(yīng)力條件下Notch1通路對(duì)人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）分化的調(diào)控作用，為牙周組織再生治療提供了新的策略。在牙周炎導(dǎo)致牙槽骨缺損的治療中，可以利用激活Notch1通路的方法，促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化，加速牙槽骨的修復(fù)和再生。通過(guò)局部應(yīng)用重組人Jagged1蛋白激活Notch1通路，有望刺激hPDLSCs分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)新骨形成，填充牙槽骨缺損部位，恢復(fù)牙槽骨的結(jié)構(gòu)和功能。這相較于傳統(tǒng)的牙周治療方法，如引導(dǎo)組織再生術(shù)，能夠更有效地促進(jìn)牙周組織的再生，提高治療效果。在正畸治療中，正畸力會(huì)對(duì)牙周組織產(chǎn)生應(yīng)力刺激，了解Notch1通路在應(yīng)力介導(dǎo)的hPDLSCs分化中的作用，有助于優(yōu)化正畸治療方案，減少正畸過(guò)程中對(duì)牙周組織的損傷，促進(jìn)牙周組織的適應(yīng)性改建。在正畸過(guò)程中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)Notch1通路的活性，促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞和成牙周韌帶細(xì)胞分化，增強(qiáng)牙周組織對(duì)正畸力的耐受性，減少牙槽骨吸收和牙齦退縮等并發(fā)癥的發(fā)生。盡管本研究取得了一定成果，但仍存在一些局限性。本研究主要是在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行的，與體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境存在差異。在體內(nèi)，牙周組織處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的、多因素相互作用的微環(huán)境中，除了應(yīng)力刺激外，還受到免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、微生物等多種因素的影響。體外實(shí)驗(yàn)難以完全模擬這些復(fù)雜因素，可能導(dǎo)致研究結(jié)果與體內(nèi)實(shí)際情況存在偏差。未來(lái)需要進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在更接近生理狀態(tài)的環(huán)境下驗(yàn)證本研究結(jié)果，深入探究Notch1通路在體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制。本研究?jī)H探討了Notch1通路在應(yīng)力條件下對(duì)hPDLSCs向成骨細(xì)胞和成牙周韌帶細(xì)胞分化的影響，而hPDLSCs還具有向其他細(xì)胞類(lèi)型分化的潛能，如成牙骨質(zhì)細(xì)胞等。Notch1通路在hPDLSCs向這些細(xì)胞分化過(guò)程中的作用尚未明確，需要進(jìn)一步研究