溶瘤病毒基因治療產(chǎn)品質(zhì)量控制要點(diǎn)演講人01溶瘤病毒基因治療產(chǎn)品質(zhì)量控制要點(diǎn)02引言：溶瘤病毒基因治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制核心地位03研發(fā)階段的質(zhì)量控制：奠定產(chǎn)品質(zhì)控基礎(chǔ)04生產(chǎn)階段的質(zhì)量控制：確保工藝穩(wěn)定與產(chǎn)品均一05成品放行質(zhì)量控制：保障安全有效的最后一道防線06質(zhì)量體系與法規(guī)符合性：構(gòu)建持續(xù)改進(jìn)的質(zhì)控生態(tài)07總結(jié)與展望：以質(zhì)控為基石，推動溶瘤病毒治療高質(zhì)量發(fā)展目錄01溶瘤病毒基因治療產(chǎn)品質(zhì)量控制要點(diǎn)02引言：溶瘤病毒基因治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制核心地位引言：溶瘤病毒基因治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制核心地位溶瘤病毒基因治療產(chǎn)品（OncolyticVirusGeneTherapyProducts,OV-GTPs）作為腫瘤免疫治療的前沿領(lǐng)域，通過選擇性裂解腫瘤細(xì)胞、激活抗腫瘤免疫應(yīng)答，為晚期癌癥患者提供了新的治療希望。與傳統(tǒng)的化學(xué)藥物或單克隆抗體相比，OV-GTPs具有“雙重靶向性”（靶向腫瘤細(xì)胞+激活免疫系統(tǒng)）和“自放大效應(yīng)”（在腫瘤內(nèi)復(fù)制擴(kuò)散）的獨(dú)特優(yōu)勢，但其質(zhì)量控制（QualityControl,QC）也面臨更為復(fù)雜的挑戰(zhàn)——病毒作為活體載體，其生物學(xué)特性、生產(chǎn)工藝、基因修飾穩(wěn)定性等因素均直接影響產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量均一性。在十余年的溶瘤病毒研發(fā)與生產(chǎn)實(shí)踐中，我深刻體會到：質(zhì)量控制不是簡單的“檢測達(dá)標(biāo)”，而是貫穿產(chǎn)品全生命周期的“系統(tǒng)性工程”。從研發(fā)階段的細(xì)胞模型構(gòu)建，到生產(chǎn)過程的工藝參數(shù)控制，再到放行檢測的全指標(biāo)覆蓋，引言：溶瘤病毒基因治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制核心地位每一個環(huán)節(jié)的疏漏都可能導(dǎo)致臨床風(fēng)險或療效失敗。例如，某早期溶瘤腺病毒產(chǎn)品因生產(chǎn)中RCV（復(fù)制competentvirus，復(fù)制competentvirus）污染，引發(fā)患者急性炎癥反應(yīng)；另一則案例因病毒滴度檢測方法學(xué)不嚴(yán)謹(jǐn)，導(dǎo)致臨床給藥劑量不足，療效顯著低于預(yù)期。這些教訓(xùn)反復(fù)印證：OV-GTPs的質(zhì)量控制必須以“患者安全”為底線，以“臨床療效”為核心，建立“全生命周期、全鏈條覆蓋”的質(zhì)控體系。本文將結(jié)合國內(nèi)外法規(guī)要求與行業(yè)實(shí)踐，從研發(fā)源頭、生產(chǎn)過程、放行檢測到質(zhì)量體系，系統(tǒng)梳理OV-GTPs的質(zhì)量控制要點(diǎn)，旨在為從業(yè)者提供一套科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、可操作的質(zhì)控框架，推動溶瘤病毒從“實(shí)驗(yàn)室研究”向“產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用”的跨越。03研發(fā)階段的質(zhì)量控制：奠定產(chǎn)品質(zhì)控基礎(chǔ)研發(fā)階段的質(zhì)量控制：奠定產(chǎn)品質(zhì)控基礎(chǔ)研發(fā)階段是OV-GTPs質(zhì)量控制的“源頭”，此階段的決策直接影響后續(xù)生產(chǎn)可行性與產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性。質(zhì)量控制需聚焦“設(shè)計(jì)質(zhì)量”（QualitybyDesign,QbD），通過明確的靶點(diǎn)選擇、病毒載體設(shè)計(jì)、細(xì)胞模型建立，為產(chǎn)品設(shè)定清晰的質(zhì)量屬性（CriticalQualityAttributes,CQAs）。病毒載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建的質(zhì)量控制病毒載體是OV-GTPs的核心組分，其設(shè)計(jì)需兼顧“腫瘤特異性”“復(fù)制能力”和“安全性”三大要素，并在構(gòu)建過程中嚴(yán)格控制基因序列的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性。病毒載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建的質(zhì)量控制靶點(diǎn)選擇與基因修飾的合理性驗(yàn)證溶瘤病毒的腫瘤靶向性依賴于病毒表面蛋白與腫瘤細(xì)胞受體的結(jié)合（如腺病毒與CD46結(jié)合）、或腫瘤特異性啟動子（如hTERT、Survivin）驅(qū)動的病毒復(fù)制。在設(shè)計(jì)中需通過：01-體外靶點(diǎn)驗(yàn)證：采用免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)等方法，確認(rèn)目標(biāo)受體在腫瘤組織中的高表達(dá)（陽性率≥80%）與正常組織中的低表達(dá)（避免脫靶毒性）；02-啟動子活性驗(yàn)證：通過熒光報(bào)告基因系統(tǒng)（如GFP、Luciferase），檢測啟動子在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中的活性差異（比值≥10倍）；03-基因修飾功能驗(yàn)證：若插入免疫刺激基因（如GM-CSF、IL-12），需通過ELISA檢測基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性（如GM-CSF活性需達(dá)到≥1×10?IU/10?病毒顆粒）。04病毒載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建的質(zhì)量控制病毒基因序列的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性控制病毒載體的基因序列（尤其是刪除的毒力相關(guān)基因、插入的外源基因）必須通過全基因組測序（WholeGenomeSequencing,WGS）確認(rèn)，確保與設(shè)計(jì)序列完全一致（測序覆蓋率≥100X，堿基準(zhǔn)確率≥99.99%）。同時，需通過連續(xù)傳代（至少10代）評估基因序列穩(wěn)定性，避免傳代過程中發(fā)生基因突變、重組或插入/缺失（Indel），導(dǎo)致腫瘤靶向性喪失或安全性風(fēng)險。例如，某型溶瘤皰疹病毒在傳至第5代時，發(fā)現(xiàn)TK基因（胸苷激酶基因）發(fā)生點(diǎn)突變，導(dǎo)致病毒復(fù)制能力下降，最終需重新篩選穩(wěn)定克隆。病毒載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建的質(zhì)量控制重組病毒RCV污染的預(yù)防與檢測RCV是溶瘤病毒生產(chǎn)中最嚴(yán)重的安全風(fēng)險，可能由同源重組（如病毒載體與細(xì)胞基因組中的病毒序列重組）或輔助病毒殘留導(dǎo)致。在設(shè)計(jì)階段需：-刪除病毒復(fù)制必需基因：如腺病毒E1A/E1B基因、皰疹病毒ICP34.5基因，確保病毒只能在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制（因腫瘤細(xì)胞存在p53缺陷或PKR通路異常）；-采用“輔助病毒依賴系統(tǒng)”：如三質(zhì)粒系統(tǒng)（腺病毒）、BAC系統(tǒng)（皰疹病毒），降低RCV產(chǎn)生概率；-建立靈敏的RCV檢測方法：如終點(diǎn)稀釋法結(jié)合細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）觀察，或PCR檢測病毒復(fù)制必需基因（靈敏度需達(dá)到1RCU/10?病毒顆粒）。3214細(xì)胞模型與工藝開發(fā)的質(zhì)控關(guān)聯(lián)研發(fā)階段的細(xì)胞模型不僅是病毒擴(kuò)增的“工具”，更是后續(xù)生產(chǎn)工藝放大的“基礎(chǔ)”，其質(zhì)量直接影響生產(chǎn)過程的穩(wěn)定性與產(chǎn)品批間一致性。細(xì)胞模型與工藝開發(fā)的質(zhì)控關(guān)聯(lián)生產(chǎn)用細(xì)胞庫的建立與鑒定生產(chǎn)細(xì)胞（如HEK293、A549、Vero細(xì)胞）需建立主細(xì)胞庫（MasterCellBank,MCB）和工作細(xì)胞庫（WorkingCellBank,WCB），并嚴(yán)格按照《生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行鑒定：-細(xì)胞鑒別：STR分型（與原始細(xì)胞株一致，匹配度≥99%）、同工酶檢測（如G6PD）；-外源因子檢測：細(xì)菌、真菌、支原體（靈敏度≤10CFU/mL）、病毒（如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒）檢測；-致瘤性：采用裸鼠致瘤試驗(yàn)，確保細(xì)胞無致瘤風(fēng)險（觀察期≥3個月）。細(xì)胞模型與工藝開發(fā)的質(zhì)控關(guān)聯(lián)工藝參數(shù)的優(yōu)化與CQAs關(guān)聯(lián)通過QbD理念，明確影響病毒質(zhì)量的關(guān)鍵工藝參數(shù)（CriticalProcessParameters,CPPs），如感染復(fù)數(shù)（MOI）、培養(yǎng)溫度、pH、溶氧量、收獲時間等，并與CQAs（如病毒滴度、純度、RCV殘留）建立關(guān)聯(lián)模型。例如：-MOI優(yōu)化：MOI過高可能導(dǎo)致細(xì)胞過早裂解、病毒釋放不完全；MOI過低則延長生產(chǎn)周期、增加污染風(fēng)險。需通過實(shí)驗(yàn)確定最佳MOI（通常0.1-10之間），使病毒滴度達(dá)到峰值（如≥1×101?VP/mL）；-收獲時間控制：需通過動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞活力（如臺盼藍(lán)拒染法）、病毒滴度（如TCID50），確定最佳收獲時間（通常為細(xì)胞病變率達(dá)到80%-90%時），避免過度收獲導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留增加。細(xì)胞模型與工藝開發(fā)的質(zhì)控關(guān)聯(lián)分析方法的建立與驗(yàn)證研發(fā)階段需建立全套質(zhì)控分析方法，并在后續(xù)生產(chǎn)中進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證（包括specificity,accuracy,precision,linearity,range,detectionlimit,quantificationlimit,robustness）。例如：-病毒滴度檢測：根據(jù)病毒類型選擇合適方法，如腺病毒可采用TCID50（50%組織培養(yǎng)感染劑量）、qPCR（檢測病毒基因組拷貝數(shù)，VP/mL）、或熒光灶單位（FFU）；-純度檢測：HCP殘留（ELISA法，靈敏度≤1ng/mg蛋白）、宿主細(xì)胞DNA殘留（qPCR法，限度≤10ng/dose）、牛血清白蛋白（BSA，若使用血清培養(yǎng)，限度≤50ng/dose）；細(xì)胞模型與工藝開發(fā)的質(zhì)控關(guān)聯(lián)分析方法的建立與驗(yàn)證-生物學(xué)活性檢測：如溶瘤病毒的腫瘤細(xì)胞殺傷活性（MTT法，EC??值需在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)）、免疫刺激活性（如樹突狀細(xì)胞活化率，需較對照組提高≥2倍）。04生產(chǎn)階段的質(zhì)量控制：確保工藝穩(wěn)定與產(chǎn)品均一生產(chǎn)階段的質(zhì)量控制：確保工藝穩(wěn)定與產(chǎn)品均一生產(chǎn)階段是OV-GTPs質(zhì)量控制的“核心環(huán)節(jié)”，需通過嚴(yán)格的工藝控制、中間體質(zhì)控與過程監(jiān)控，確保每一批次產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定一致。原輔料與包材的質(zhì)量控制原輔料與包材的質(zhì)量直接關(guān)系到生產(chǎn)過程的順利與產(chǎn)品的安全性，需建立嚴(yán)格的供應(yīng)商審計(jì)與入廠檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。原輔料與包材的質(zhì)量控制生產(chǎn)用關(guān)鍵原輔料的質(zhì)量控制-細(xì)胞培養(yǎng)基：需選用無血清、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基（如CD293、EXPI293），檢測滲透壓、pH、內(nèi)毒素（≤0.25EU/mL）、生長因子活性，并需通過細(xì)胞生長曲線驗(yàn)證（細(xì)胞倍增時間≤24小時）；-病毒種子批：需建立主病毒種子庫（MasterVirusSeedBank,MVSB）和工作病毒種子庫（WorkingVirusSeedBank,WVSB），進(jìn)行鑒別（基因測序）、滴度（≥1×1011VP/mL）、RCV（≤1RCU/10?VP）、外源因子（細(xì)菌、真菌、支原體）檢測；-酶類試劑：如胰蛋白酶（用于細(xì)胞消化）、DNaseI（用于消化細(xì)胞DNA），需檢測酶活性、殘留宿主DNA（≤10ng/mg）及微生物限度。原輔料與包材的質(zhì)量控制直接接觸藥品的包材質(zhì)量控制-生物反應(yīng)器/培養(yǎng)袋：需進(jìn)行生物相容性測試（細(xì)胞毒性≤2級，致敏反應(yīng)≤1級），并檢測析出物（如塑化劑、重金屬，需符合ICHQ3D指導(dǎo)原則）；-儲存與運(yùn)輸容器：如凍存管、輸液袋，需進(jìn)行密封性測試（如真空衰減法，靈敏度≤1×10?3mbarL/s）、低溫儲存驗(yàn)證（-80±5℃下，病毒滴度下降≤1log)。生產(chǎn)過程的工藝控制生產(chǎn)過程需嚴(yán)格按照生產(chǎn)工藝規(guī)程（SOP）執(zhí)行，對關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，確保CPPs在預(yù)設(shè)范圍內(nèi)。生產(chǎn)過程的工藝控制細(xì)胞復(fù)蘇與擴(kuò)增階段控制-復(fù)蘇操作：嚴(yán)格控制復(fù)蘇溫度（37℃水浴，避免過熱）、離心轉(zhuǎn)速（1000rpm，5分鐘，避免細(xì)胞損傷），復(fù)蘇后細(xì)胞活力需≥90%（臺盼藍(lán)拒染法）；-擴(kuò)增過程：采用逐級放大策略（如從T-flask→生物反應(yīng)器→2000L生物反應(yīng)器），監(jiān)控細(xì)胞密度（控制在2×10?-8×10?cells/mL）、細(xì)胞活力（≥85%）、葡萄糖消耗速率（避免代謝產(chǎn)物積累抑制生長）。生產(chǎn)過程的工藝控制病毒感染與擴(kuò)增階段控制-感染時機(jī)：需在細(xì)胞對數(shù)生長期（細(xì)胞密度達(dá)3×10?-5×10?cells/mL）進(jìn)行感染，此時細(xì)胞代謝旺盛，病毒復(fù)制效率最高；-感染過程控制：采用均勻感染方式（如微載體培養(yǎng)需確保攪拌速度適中，避免剪切力損傷細(xì)胞；懸浮培養(yǎng)需控制MOI均勻性），感染后每2小時監(jiān)測細(xì)胞pH（7.0-7.4）、溶氧量（30%-70%飽和度），避免代謝廢物（如乳酸）積累導(dǎo)致細(xì)胞死亡過快。生產(chǎn)過程的工藝控制病毒收獲與純化階段控制-收獲時機(jī)：通過CPE觀察（細(xì)胞變圓、脫落率≥80%）和病毒滴度檢測（如qPCR檢測基因組拷貝數(shù)不再上升）確定收獲時間，通常感染后48-72小時；-純化工藝：多采用“澄清-層析-超濾/滲濾”組合工藝，如：-澄清：0.45μm+0.22μm濾膜過濾，去除細(xì)胞碎片；-層析：陰離子交換層析（如QSepharose）去除HCP和DNA，親和層析（如His-tag純化）去除雜質(zhì)，層析過程需監(jiān)測電導(dǎo)率、pH（確保與平衡條件一致，偏差≤±0.2）；-超濾/滲濾：采用切向流超濾（TangentialFlowFiltration,TFF）濃縮病毒并置換緩沖液（如置換至含5%甘露醇的PBS），控制超濾壓力（≤3psi）避免病毒顆粒破壞。生產(chǎn)過程的工藝控制制劑與灌裝階段控制-制劑配方：需優(yōu)化穩(wěn)定劑（如蔗糖、甘露醇）、pH調(diào)節(jié)劑（如Tris-HCl）、凍干保護(hù)劑（如海藻糖）的配方，通過加速穩(wěn)定性試驗(yàn)（40±2℃）確定最佳配方，確保產(chǎn)品在儲存期內(nèi)（通常2-3年，-80℃或液氮）病毒滴度下降≤1log；-灌裝過程：采用無菌灌裝技術(shù)（如A級背景下的B級環(huán)境），灌裝量需均勻（每支裝量差異≤±5%），灌裝后立即冷凍（凍干產(chǎn)品需控制預(yù)凍溫度-40℃，真空干燥時間≥24小時），并進(jìn)行密封性測試（100%檢漏）。中間產(chǎn)品質(zhì)量控制中間產(chǎn)品是連接生產(chǎn)過程與成品放行的“橋梁”，需設(shè)置關(guān)鍵質(zhì)控節(jié)點(diǎn)，確保不合格中間產(chǎn)品不流入下一環(huán)節(jié)。中間產(chǎn)品質(zhì)量控制細(xì)胞庫中間產(chǎn)品質(zhì)控-MCB/WCB：除前述細(xì)胞庫鑒定項(xiàng)目外，需進(jìn)行染色體核型分析（染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常率≤5%），確保細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性；-復(fù)蘇后細(xì)胞：需進(jìn)行支原體檢測（每周1次）、細(xì)胞活力檢測（≥90%），避免污染或細(xì)胞狀態(tài)不佳影響病毒擴(kuò)增。中間產(chǎn)品質(zhì)量控制病毒收獲液中間產(chǎn)品質(zhì)控-病毒滴度：采用TCID50或qPCR檢測，滴度需達(dá)到工藝預(yù)設(shè)值（如≥1×101?VP/mL）；-雜質(zhì)含量：HCP（≤1000ng/mg蛋白）、宿主DNA（≤100ng/mL），若未達(dá)標(biāo)，需調(diào)整純化工藝參數(shù)（如增加層析柱載量或優(yōu)化洗脫梯度）。中間產(chǎn)品質(zhì)量控制純化后中間產(chǎn)品質(zhì)控-病毒顆粒完整性：采用動態(tài)光散射（DLS）檢測粒徑分布（如腺病毒粒徑約90-100nm，PDI≤0.2），電鏡觀察病毒形態(tài)（需具有完整衣殼，無破裂或聚集）；-RCV檢測：采用終點(diǎn)稀釋法+細(xì)胞病變觀察，檢測靈敏度需達(dá)到1RCU/10?VP，若檢出RCV，需對整批產(chǎn)品銷毀，并排查生產(chǎn)過程（如細(xì)胞庫污染、交叉污染）。05成品放行質(zhì)量控制：保障安全有效的最后一道防線成品放行質(zhì)量控制：保障安全有效的最后一道防線成品放行是質(zhì)量控制“最后一公里”，需通過全面、嚴(yán)格的檢測，確保產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（QualitySpecification,QS）后，方可用于臨床或上市。成品的理化性質(zhì)檢測外觀與裝量-凍干產(chǎn)品：應(yīng)為白色或類白色疏松體，無融化、萎縮、異物，復(fù)溶后應(yīng)為澄清或輕微乳光溶液，無肉眼可見的不溶性顆粒；-液體產(chǎn)品：應(yīng)為無色或淡黃色澄清液體，無沉淀、絮狀物，裝量差異需符合《中國藥典》規(guī)定（≥標(biāo)示裝量的98%）。成品的理化性質(zhì)檢測pH值與滲透壓-pH值：通?？刂圃?.0-8.0（如腺病毒產(chǎn)品），偏差≤±0.5，避免注射后刺激組織；-滲透壓：需與血漿等滲（280-320mOsm/kg），采用冰點(diǎn)滲透壓計(jì)檢測，偏差≤±10%，避免溶血或細(xì)胞損傷。成品的理化性質(zhì)檢測純度與雜質(zhì)檢測-病毒顆粒（VP）與感染單位（IU）比值：反映病毒顆粒的感染能力，通常VP/IU≤100（如腺病毒理想比值≤50），比值過高表明存在大量無感染能力的病毒顆粒；-宿主細(xì)胞蛋白（HCP）：采用ELISA法檢測，限度≤100ng/mg蛋白（根據(jù)病毒類型調(diào)整，如Vero細(xì)胞生產(chǎn)的HCP限度可適當(dāng)放寬）；-宿主細(xì)胞DNA：采用qPCR法檢測，限度≤10ng/dose（需結(jié)合給藥途徑，靜脈注射產(chǎn)品要求更嚴(yán)格）；-外源因子：細(xì)菌、真菌（需符合無菌檢查要求）、支原體（≤10CFU/mL）、病毒（如逆轉(zhuǎn)錄病毒，采用PCR或體外培養(yǎng)法檢測，靈敏度≤1×10??IU/mL）。成品的生物學(xué)活性檢測生物學(xué)活性是OV-GTPs“有效性”的直接體現(xiàn)，需建立與臨床療效相關(guān)的功能檢測方法。成品的生物學(xué)活性檢測體外溶瘤活性-腫瘤細(xì)胞殺傷試驗(yàn)：采用MTT或CCK-8法，檢測病毒對腫瘤細(xì)胞（如A549、HepG2）的殺傷率（MOI=1時，72小時殺傷率≥80%），并計(jì)算EC??值（需在工藝驗(yàn)證確定的范圍內(nèi)）；-復(fù)制能力驗(yàn)證：通過有限稀釋法，檢測病毒在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中的復(fù)制能力差異（如腫瘤細(xì)胞中病毒滴度較正常細(xì)胞高≥100倍），確保腫瘤靶向性。成品的生物學(xué)活性檢測免疫刺激活性-細(xì)胞因子誘導(dǎo)：將病毒與外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）共培養(yǎng)，通過ELISA檢測IFN-α、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子水平（較對照組提高≥2倍）；-免疫細(xì)胞活化：流式細(xì)胞術(shù)檢測樹突細(xì)胞（DCs）表面標(biāo)志物（如CD80、CD86、HLA-DR）的表達(dá)率（較對照組提高≥50%），反映病毒激活抗原提呈細(xì)胞的能力。成品的生物學(xué)活性檢測體內(nèi)有效性（非臨床）-動物模型試驗(yàn)：采用人源腫瘤異種移植（PDX）模型，觀察腫瘤生長抑制率（TGI≥50%，與陽性對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）、生存期延長（中位生存期較對照組提高≥30%），為臨床劑量提供依據(jù)。成品的穩(wěn)定性研究穩(wěn)定性研究是確定產(chǎn)品有效期、儲存條件的依據(jù)，需包括實(shí)時穩(wěn)定性、加速穩(wěn)定性、強(qiáng)制降解試驗(yàn)。成品的穩(wěn)定性研究實(shí)時穩(wěn)定性03-接受標(biāo)準(zhǔn)：病毒滴度下降≤1log，純度（HCP、DNA）不升高，生物學(xué)活性保持≥80%。02-檢測時間點(diǎn)：0、1、3、6、12、18、24、36個月，檢測指標(biāo)包括病毒滴度、純度、生物學(xué)活性、外觀、pH值等；01-儲存條件：根據(jù)產(chǎn)品特性確定，如凍干產(chǎn)品通常為-20℃或-80℃，液體產(chǎn)品為-80℃或液氮；成品的穩(wěn)定性研究加速穩(wěn)定性-條件：40±2℃、75±5%RH，用于預(yù)測產(chǎn)品有效期（通常預(yù)測有效期≤12個月）；-檢測時間點(diǎn)：0、1、2、3、6個月，指標(biāo)同實(shí)時穩(wěn)定性，若6個月內(nèi)病毒滴度下降≤1log，可初步支持12個月有效期。成品的穩(wěn)定性研究強(qiáng)制降解試驗(yàn)-目的：驗(yàn)證產(chǎn)品對光照、溫度、pH變化的敏感性，為運(yùn)輸、儲存條件提供依據(jù)；-方法：高溫（50℃）、光照（4500Lux）、強(qiáng)酸（pH3.0）、強(qiáng)堿（pH10.0）處理，檢測病毒滴度下降程度，確定產(chǎn)品耐受范圍（如光照24小時后滴度下降≤2log）。成品的微生物限度與無菌檢查-無菌檢查：需按《中國藥典》薄膜過濾法，接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（需氧菌、厭氧菌）和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（霉菌、酵母菌），培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長；-微生物限度：采用平板計(jì)數(shù)法，需氧菌總數(shù)≤10CFU/g（mL）、霉菌和酵母菌總數(shù)≤10CFU/g（mL）、控制菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌等）不得檢出。06質(zhì)量體系與法規(guī)符合性：構(gòu)建持續(xù)改進(jìn)的質(zhì)控生態(tài)質(zhì)量體系與法規(guī)符合性：構(gòu)建持續(xù)改進(jìn)的質(zhì)控生態(tài)質(zhì)量控制不僅是“檢測標(biāo)準(zhǔn)”，更是“體系保障”，需通過完善的質(zhì)量管理體系（QMS）與法規(guī)符合性，確保質(zhì)控工作的系統(tǒng)性與可持續(xù)性。質(zhì)量管理體系（QMS）的建立與運(yùn)行質(zhì)量風(fēng)險管理（QRM）的應(yīng)用采用ICHQ9指南，對產(chǎn)品全生命周期進(jìn)行風(fēng)險識別、評估、控制、溝通與審核。例如：-風(fēng)險識別：通過FMEA（失效模式與影響分析）識別生產(chǎn)過程中的高風(fēng)險環(huán)節(jié)（如病毒純化層析步驟可能導(dǎo)致病毒聚集）；-風(fēng)險評估：采用風(fēng)險優(yōu)先數(shù)（RPN，RPN=嚴(yán)重度×發(fā)生度×可檢測度），RPN≥64為高風(fēng)險項(xiàng)；-風(fēng)險控制：針對高風(fēng)險項(xiàng)制定控制措施（如優(yōu)化層析緩沖液pH，減少病毒聚集），并驗(yàn)證控制效果。質(zhì)量管理體系（QMS）的建立與運(yùn)行偏差管理、變更控制與CAPA-偏差管理：對任何偏離SOP或質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的事件（如病毒滴度下降20%），需進(jìn)行偏差調(diào)查（根本原因分析，如細(xì)胞狀態(tài)不佳、感染MOI偏差），制定糾正措施（如優(yōu)化細(xì)胞復(fù)蘇程序），并記錄偏差報(bào)告（DR）；01-變更控制：對生產(chǎn)工藝、設(shè)備、原輔料等的變更，需評估對產(chǎn)品質(zhì)量的影響（如更換層析柱供應(yīng)商，需進(jìn)行工藝等效性驗(yàn)證），經(jīng)質(zhì)量部門批準(zhǔn)后方可實(shí)施；02-糾正與預(yù)防措施（CAPA）：對偏差或投訴事件，制定糾正措施（解決已發(fā)生問題）和預(yù)防措施（防止問題再次發(fā)生），并跟蹤C(jī)APA的執(zhí)行效果。03質(zhì)量管理體系（QMS）的建立與運(yùn)行數(shù)據(jù)完整性與可靠性嚴(yán)格遵循ALCOA+原則（Attributable,Legible,Contemporaneous,Original,Accurate,Complete,Consistent,Enduring,Available），確保從研發(fā)到生產(chǎn)的所有數(shù)據(jù)真實(shí)、完整、可追溯。例如：-電子數(shù)據(jù)管理：采用實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS）和制造執(zhí)行系統(tǒng)（MES），實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)自動采集、審計(jì)追蹤（記錄誰、何時、做了什么修改）；-紙質(zhì)數(shù)據(jù)管理：原始記錄需使用防涂改筆，修改處需簽名并注明日期，禁止數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)錄錯誤（如病毒滴度記錄需直接打印儀器輸出，手抄無效）。法規(guī)符合性：國內(nèi)外指導(dǎo)原則的落地OV-GTPs的質(zhì)控需同時符合中國NMPA、美國FDA、歐盟EMA的法規(guī)要求，確保產(chǎn)品在國內(nèi)臨床研究與國際申報(bào)中的合規(guī)性。法規(guī)符合性：國內(nèi)外指導(dǎo)原則的落地國內(nèi)法規(guī)要求21-《人用基因治療產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2023年）：明確溶瘤病毒生產(chǎn)中的細(xì)胞庫管理、工藝控制、污染控制等要求；-《生物制品批簽發(fā)管理辦法》：對上市的溶瘤病毒產(chǎn)品，需通過批簽發(fā)檢驗(yàn)（由中國食品藥品檢定研究院執(zhí)行）。-《溶瘤病毒產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（2022年）：規(guī)定溶瘤病毒的安全性評價（如RCV檢測、生物分布）、有效性評價（如腫瘤生長抑制）要求；3法規(guī)符合性：國內(nèi)外指導(dǎo)原則的落地國際法規(guī)要求-FDA《OncolyticVirusesfortheTreatmentofCancerGuidanceforIndustry》（2020年）：強(qiáng)調(diào)RCV檢測的靈敏度、病毒基因穩(wěn)定性、生產(chǎn)工藝一致性；01-EMA《Guidelineonthequality,non-clinicalandclinicalaspectsofoncolyticviruses》（2018年）：要求建立病毒載體插入位點(diǎn)的分析方法（如LAM-PCR），防止插入突變導(dǎo)致的安全風(fēng)險；02-ICHQ5A（R1）《ViralSafetyEvaluationofBiotechnologyProductsDerivedfromCellLinesofHumanorAnimalOrigin》：明確外源病毒檢測的方法與標(biāo)準(zhǔn)。03法規(guī)符合性：國內(nèi)外指導(dǎo)