異種抗原介導(dǎo)的局部微環(huán)境重塑：小鼠S180肉瘤治療新策略一、引言1.1研究背景癌癥，作為一種全身性慢性疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。隨著人口老齡化的加劇，其發(fā)病率和死亡率逐年上升。據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2022年我國癌癥新發(fā)病例高達(dá)482.47萬，世標(biāo)發(fā)病率為201.61/10萬；死亡病例也不容小覷，世標(biāo)死亡率達(dá)96.47/10萬。在全球范圍內(nèi)，2019年新發(fā)癌癥患者估計(jì)2360萬，癌癥死亡病例數(shù)估計(jì)1000萬，癌癥死亡占全部死亡數(shù)的比例從2010年的15.7%上升到2019年的17.7%。肺癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、肝癌、胃癌等成為我國常見的惡性腫瘤，給患者家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。目前，腫瘤的治療手段多種多樣，包括手術(shù)、化療、放療、生物治療等。近年來，靶向治療因其選擇性好、對正常組織損傷少等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。然而，腫瘤的發(fā)生是一個極為復(fù)雜的過程，涉及多基因突變，細(xì)胞信號傳導(dǎo)更是形成了一個交錯縱橫的網(wǎng)絡(luò)。僅針對一個信號通路的抑制或者針對一個基因的修復(fù)，往往難以達(dá)到有效控制腫瘤的目的。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤周圍包括腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及少量浸潤細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等）共同構(gòu)成的局部環(huán)境。作為腫瘤細(xì)胞的“避難所”，腫瘤微環(huán)境能夠保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受免疫細(xì)胞的識別和攻擊，誘導(dǎo)免疫耐受。在腫瘤微環(huán)境中，存在著多種阻礙效應(yīng)細(xì)胞活化的因素，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量增加，其可以與效應(yīng)細(xì)胞競爭性結(jié)合白細(xì)胞介素2（IL-2），并能抑制CD4+T和CD8+T細(xì)胞對IL-2的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，干擾其活化與增殖；腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞也會分泌免疫抑制因子，抑制T細(xì)胞的功能等。腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)的解除成為了腫瘤免疫治療成敗的關(guān)鍵，也為腫瘤治療提供了新的靶點(diǎn)。早在300多年前，臨床報道就發(fā)現(xiàn)腫瘤患者局部遭受細(xì)菌或病毒感染時，腫瘤會明顯消退。其原因可能是局部細(xì)菌感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)在一定程度上解除了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，暴露了腫瘤抗原，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞的活化，從而達(dá)到殺滅腫瘤的目的。受此啟發(fā)，本研究提出一種新的腫瘤治療模式，即利用異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射的方法治療腫瘤。通過異種抗原免疫，可增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫力，產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞及抗體。隨后進(jìn)行異種抗原瘤內(nèi)注射，在腫瘤局部引發(fā)免疫清除反應(yīng)。一方面，局部注射的異種抗原成為一個人工靶點(diǎn)，吸引抗體及招募免疫細(xì)胞在腫瘤局部大量聚集；另一方面，腫瘤局部的免疫反應(yīng)會產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子及趨化因子，在腫瘤局部制造出一種炎癥環(huán)境，打破免疫抑制狀態(tài)，促進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的成熟及活化，最終實(shí)現(xiàn)將機(jī)體針對異種抗原的排斥反應(yīng)轉(zhuǎn)化為對腫瘤的免疫應(yīng)答。1.2研究目的與意義本研究旨在驗(yàn)證異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射治療腫瘤的可行性，深入探討其對腫瘤微環(huán)境的改善作用，為腫瘤治療開辟新的路徑。具體而言，通過嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和多維度的數(shù)據(jù)分析，檢驗(yàn)該治療方法是否能有效抑制腫瘤生長，觀察其對腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞各細(xì)胞亞群比例的影響，以及評估其對腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子濃度的調(diào)節(jié)作用。腫瘤治療一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)，傳統(tǒng)治療手段存在諸多局限性，新的治療策略和方法亟待開發(fā)。本研究提出的異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射治療模式，具有創(chuàng)新性和潛在的應(yīng)用價值。從理論層面來看，該研究有助于深化對腫瘤免疫治療機(jī)制的理解，進(jìn)一步明確腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，以及異種抗原如何通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來激活機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，豐富和拓展腫瘤免疫學(xué)的理論體系。從實(shí)踐意義出發(fā)，若該治療方法被證實(shí)有效，將為臨床腫瘤治療提供一種全新的、安全有效的治療手段。它有可能克服現(xiàn)有治療方法的不足，提高腫瘤治療的效果，延長患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量。同時，這種基于免疫調(diào)節(jié)的治療方法，相較于傳統(tǒng)的化療和放療，可能具有更低的毒副作用，減少患者在治療過程中的痛苦，為腫瘤患者帶來新的希望。1.3研究創(chuàng)新點(diǎn)本研究在腫瘤治療方法及微環(huán)境分析維度上具有顯著創(chuàng)新。在治療方法上，采用異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射的方式，與傳統(tǒng)腫瘤治療手段不同，該方法利用異種抗原激發(fā)機(jī)體非特異性免疫，產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞及抗體，再通過瘤內(nèi)注射在腫瘤局部引發(fā)免疫清除反應(yīng)。局部注射的異種抗原成為人工靶點(diǎn)，吸引抗體及免疫細(xì)胞聚集，同時免疫反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞因子及趨化因子在腫瘤局部制造炎癥環(huán)境，打破免疫抑制狀態(tài)，將機(jī)體針對異種抗原的排斥反應(yīng)轉(zhuǎn)化為對腫瘤的免疫應(yīng)答，為腫瘤治療提供了全新的思路和方法。在研究內(nèi)容方面，本研究突破以往單一維度研究腫瘤微環(huán)境的局限，從多維度對腫瘤微環(huán)境進(jìn)行分析。既關(guān)注腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞各細(xì)胞亞群比例的變化，又分析腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子濃度的改變。通過全面分析腫瘤微環(huán)境的變化，能夠更深入、系統(tǒng)地揭示異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射治療腫瘤的作用機(jī)制，為后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供更豐富、準(zhǔn)確的理論依據(jù)。二、小鼠S180肉瘤及腫瘤微環(huán)境概述2.1S180肉瘤特征S180肉瘤細(xì)胞最初源于小鼠腹水瘤，1959年被成功建系。其細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)淋巴母細(xì)胞樣，具有獨(dú)特的半貼半懸生長特性。該細(xì)胞系保持了肉瘤的腫瘤原性，是腫瘤研究領(lǐng)域中極為重要的工具細(xì)胞，廣泛應(yīng)用于腫瘤發(fā)生機(jī)理的體內(nèi)外研究。在體外，它常被用于腫瘤化療藥物的篩選試驗(yàn)，幫助科研人員評估各種藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制效果，為臨床腫瘤治療藥物的開發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在培養(yǎng)傳代方面，S180細(xì)胞通常由昆明小鼠腹水傳代。具體操作是在小鼠腹腔接種1.0x10^6個S-180細(xì)胞后第10天，在無菌條件下抽取腹水，用PBS稀釋后計(jì)數(shù)，再進(jìn)行腹腔接種傳代。若進(jìn)行體外培養(yǎng)，一般4-5代左右，細(xì)胞活力會逐漸降低，狀態(tài)變差，此時可通過腹水培養(yǎng)的方式恢復(fù)細(xì)胞活力。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，大部分S180細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，因此基本按照懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)方法進(jìn)行操作，對于少量貼壁細(xì)胞，可以通過輕柔吹打使其脫離瓶壁并收集。其培養(yǎng)體系一般為RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為氣相含95%空氣和5%CO2，溫度控制在37℃。當(dāng)細(xì)胞需要凍存時，凍存條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加10%DMSO和20%FBS，放置于液氮中保存。傳代時，若細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，一般通過向培養(yǎng)瓶中添加完全培養(yǎng)基來維持細(xì)胞的生長狀態(tài)，通常細(xì)胞密度維持在1×10^5-1×10^6個/mL可保證細(xì)胞的正常生長；如需分瓶，可將細(xì)胞懸液收集到無菌離心管中，以1000rpm離心10min，棄去上清，加入6-8ml新鮮培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞并溫柔吹打，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新T25瓶中，后續(xù)傳代可根據(jù)實(shí)際情況按1:2-1:5的比例進(jìn)行。由于S180肉瘤細(xì)胞具有穩(wěn)定的腫瘤原性和易于培養(yǎng)傳代等特點(diǎn)，在腫瘤研究中發(fā)揮著不可替代的作用。許多關(guān)于腫瘤治療的研究，如新型藥物的研發(fā)、治療方法的探索等，都會以S180肉瘤細(xì)胞構(gòu)建的荷瘤小鼠模型為基礎(chǔ)展開實(shí)驗(yàn)。在研究桑黃多糖對肉瘤S180細(xì)胞體內(nèi)外的抑瘤作用時，科研人員構(gòu)建S180細(xì)胞荷瘤小鼠模型，通過給予不同劑量的桑黃多糖溶液，觀察小鼠瘤體質(zhì)量變化以計(jì)算抑瘤率，并運(yùn)用免疫組化法檢測腫瘤組織中相關(guān)基因的蛋白表達(dá)，從而深入探究桑黃多糖的抗腫瘤機(jī)制。在探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠肉瘤細(xì)胞S180生長的影響時，以S180細(xì)胞為研究對象，觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上清液對其生長抑制效應(yīng)、細(xì)胞凋亡率以及相關(guān)基因表達(dá)的影響，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.2腫瘤微環(huán)境組成與作用腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment，TME）是一個復(fù)雜且動態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)起著至關(guān)重要的作用。它主要由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)和各種生物活性分子等組成。腫瘤細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的核心組成部分，它們具有異常的增殖、分化和代謝特性。腫瘤細(xì)胞能夠不斷地增殖，突破正常組織的生長調(diào)控機(jī)制，形成腫瘤組織。其代謝方式也與正常細(xì)胞不同，例如腫瘤細(xì)胞常采用有氧糖酵解的方式獲取能量，這種代謝方式不僅效率較低，還會產(chǎn)生大量的乳酸，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境酸化，影響其他細(xì)胞的功能。腫瘤細(xì)胞還會分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，這些因子可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞的行為，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中扮演著重要的角色，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）等。T細(xì)胞是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵細(xì)胞，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）能夠識別并殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，在腫瘤微環(huán)境中，T細(xì)胞的功能常常受到抑制。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是一種特殊的T細(xì)胞亞群，它能夠抑制其他免疫細(xì)胞的活性，在腫瘤微環(huán)境中，Treg細(xì)胞的數(shù)量往往增加，通過分泌抑制性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，抑制CTL細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞和被病毒感染的細(xì)胞。但在腫瘤微環(huán)境中，NK細(xì)胞的活性也會受到抑制，腫瘤細(xì)胞可以通過表達(dá)抑制性配體，如程序性死亡配體1（PD-L1），與NK細(xì)胞表面的受體結(jié)合，抑制NK細(xì)胞的殺傷活性。巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中主要分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，能夠分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，激活其他免疫細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞；而M2型巨噬細(xì)胞則具有促腫瘤作用，它們分泌的細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β等，能夠抑制免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）主要由M2型巨噬細(xì)胞組成，是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫細(xì)胞，它除了能夠調(diào)節(jié)腫瘤區(qū)域免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤增殖外，還可以通過釋放基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2、MMP7、MMP9、MMP12等）和環(huán)氧化酶2（COX2）等分子促進(jìn)血管生成，為腫瘤生長提供營養(yǎng)及養(yǎng)分并為后續(xù)腫瘤通過血管遷移提供便利路徑，還可釋放一系列炎癥因子及多種生長因子直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移，如VEGF、TNF-α、IL-8和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等。DC細(xì)胞是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，能夠攝取、加工和提呈抗原，激活T細(xì)胞，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答。但在腫瘤微環(huán)境中，DC細(xì)胞的功能往往受損，無法有效地激活T細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。MDSC是一類具有免疫抑制功能的細(xì)胞群體，可抑制T細(xì)胞反應(yīng)。除了提供必要的免疫抑制功能外，MDSC也能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。在小鼠乳腺癌動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，MDSCs能夠通過分泌IL-6及IL-6可溶性受體α（Sil-6Rα）的方式持續(xù)激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路并最終促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲；在肺癌動物模型中發(fā)現(xiàn)，MDSC細(xì)胞在原發(fā)腫瘤位置大量聚集，且通過敲除Krüppel樣因子4（KLF4）的方式降低原發(fā)腫瘤灶中MDSCs的聚集后，腫瘤發(fā)展顯著延緩，并最終抑制肺轉(zhuǎn)移灶的形成?；|(zhì)細(xì)胞包括腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞等。CAF存在于腫瘤間質(zhì)中，通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和參與腫瘤血管生成促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。CAF可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和蛋白水解酶類物質(zhì)，如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF1）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、TGF-β、血小板衍生生長因子（PGDF）、膠原蛋白及纖連蛋白等。PDGF和TGFβ信號通路是CAF經(jīng)典下游信號通路，能夠有效調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移。除此之外，CAF細(xì)胞也能夠通過分泌趨化因子（如CXCL14、一氧化氮合酶1（NOS1）等）通過激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）及缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及后續(xù)遷移進(jìn)程。內(nèi)皮細(xì)胞參與腫瘤血管的形成，腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF等因子可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，形成新生血管，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣，同時也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑。周細(xì)胞則與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，維持血管的穩(wěn)定性和功能。細(xì)胞外基質(zhì)是由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種蛋白質(zhì)和多糖組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，它不僅為腫瘤細(xì)胞提供物理支撐，還參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。腫瘤細(xì)胞可以分泌蛋白水解酶，如MMPs，降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。腫瘤微環(huán)境中還存在著各種生物活性分子，如細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子和代謝產(chǎn)物等，它們在腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞之間的信號傳遞和相互作用中發(fā)揮著重要作用。腫瘤微環(huán)境的主要作用之一是免疫抑制。腫瘤細(xì)胞通過多種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，其中腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用是關(guān)鍵因素。腫瘤細(xì)胞可以分泌免疫抑制因子，如TGF-β、IL-10等，直接抑制免疫細(xì)胞的活性。腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，如Treg細(xì)胞、MDSC和M2型巨噬細(xì)胞等，也可以通過分泌抑制性細(xì)胞因子、表達(dá)抑制性受體等方式，抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫攻擊。腫瘤微環(huán)境還可以通過改變免疫細(xì)胞的代謝狀態(tài)，影響其功能。腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解代謝方式導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中葡萄糖水平降低，乳酸水平升高，這種代謝微環(huán)境的改變會抑制T細(xì)胞的功能，促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖和活化。腫瘤微環(huán)境中的缺氧狀態(tài)也會影響免疫細(xì)胞的功能，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）在缺氧條件下表達(dá)上調(diào)，HIF可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的基因表達(dá)，使其功能發(fā)生改變，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。腫瘤微環(huán)境還能促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞和分子相互作用，形成了一個有利于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中的血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF等血管生成因子可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，形成新生血管，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)也參與了腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程。CAF可以分泌多種生長因子和細(xì)胞因子，如HGF、SDF1等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供了空間和條件，腫瘤細(xì)胞通過分泌MMPs等蛋白水解酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而突破基底膜，進(jìn)入周圍組織和血管，實(shí)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞也可以通過不同的方式促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。TAM可以分泌多種生長因子和細(xì)胞因子，如VEGF、TNF-α、IL-8等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。MDSC可以通過抑制免疫反應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)也與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，炎癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用，深入了解腫瘤微環(huán)境的組成和作用機(jī)制，對于開發(fā)新的腫瘤治療策略具有重要意義。2.3兩者關(guān)聯(lián)S180肉瘤的生長與腫瘤微環(huán)境之間存在著極為密切且復(fù)雜的相互關(guān)系，它們相互影響、相互作用，共同推動著腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。腫瘤微環(huán)境為S180肉瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移提供了必要的支持和條件，而S180肉瘤細(xì)胞的行為也會反過來對腫瘤微環(huán)境的組成和功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。腫瘤微環(huán)境對S180肉瘤的免疫逃逸起到了關(guān)鍵的支持作用。腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）等，能夠通過多種機(jī)制抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)，使得S180肉瘤細(xì)胞能夠逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊。Treg細(xì)胞可以分泌抑制性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），這些細(xì)胞因子能夠抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等免疫效應(yīng)細(xì)胞的活性，從而阻止它們對S180肉瘤細(xì)胞的殺傷作用。MDSC則可以通過多種途徑抑制免疫細(xì)胞的功能，包括消耗免疫細(xì)胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)、表達(dá)抑制性分子以及誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的凋亡等。腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）也主要以M2型巨噬細(xì)胞為主，它們同樣具有免疫抑制功能，能夠分泌免疫抑制因子，如IL-10和TGF-β等，進(jìn)一步促進(jìn)S180肉瘤細(xì)胞的免疫逃逸。腫瘤微環(huán)境中的各種細(xì)胞和分子也為S180肉瘤細(xì)胞的增殖提供了有利的條件。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，它們可以分泌多種生長因子和細(xì)胞因子，如肝細(xì)胞生長因子（HGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，這些因子能夠刺激S180肉瘤細(xì)胞的增殖和存活。HGF可以與S180肉瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。PDGF則可以促進(jìn)S180肉瘤細(xì)胞的分裂和生長，同時還能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，為腫瘤細(xì)胞的生長提供適宜的微環(huán)境。VEGF不僅能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成，為S180肉瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，還可以直接作用于S180肉瘤細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和存活。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）也對S180肉瘤細(xì)胞的增殖起到了重要的調(diào)節(jié)作用。ECM由多種蛋白質(zhì)和多糖組成，它不僅為腫瘤細(xì)胞提供物理支撐，還可以通過與腫瘤細(xì)胞表面的受體相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和遷移。ECM中的膠原蛋白和纖連蛋白等成分可以與S180肉瘤細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白水解酶可以降解ECM，為S180肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供空間和條件，同時也可以釋放出一些被ECM結(jié)合的生長因子，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。反過來，S180肉瘤細(xì)胞也會對腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生顯著的影響。隨著S180肉瘤細(xì)胞的不斷增殖和生長，腫瘤組織的體積逐漸增大，這會導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，從而形成缺氧和低營養(yǎng)的微環(huán)境。缺氧微環(huán)境會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞表達(dá)一系列缺氧誘導(dǎo)因子（HIF），如HIF-1α和HIF-2α等，這些因子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖、遷移和血管生成等過程，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。HIF-1α可以激活VEGF等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管的生成，以滿足腫瘤細(xì)胞對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的需求。HIF-1α還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝途徑，使其更適應(yīng)缺氧環(huán)境，例如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有氧糖酵解，產(chǎn)生更多的乳酸，從而導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境的酸化。S180肉瘤細(xì)胞還會分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和趨化因子（C-X-C基序）配體8（CXCL8）等，這些因子可以招募和激活腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，改變腫瘤微環(huán)境的組成和功能。IL-6可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用。TNF-α則可以激活腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，使其分泌更多的炎癥因子和生長因子，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。CXCL8可以招募中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境中，這些細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中可能會被腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化為具有免疫抑制功能的細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。S180肉瘤細(xì)胞還可以通過與腫瘤微環(huán)境中的其他細(xì)胞進(jìn)行直接的細(xì)胞間相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的功能。S180肉瘤細(xì)胞可以與CAF相互作用，促進(jìn)CAF的活化和增殖，使其分泌更多的生長因子和細(xì)胞因子，為腫瘤細(xì)胞的生長提供更好的支持。S180肉瘤細(xì)胞還可以與免疫細(xì)胞相互作用，抑制免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。S180肉瘤細(xì)胞表面表達(dá)的程序性死亡配體1（PD-L1）可以與T細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸。S180肉瘤的生長與腫瘤微環(huán)境之間存在著緊密的相互關(guān)系，腫瘤微環(huán)境為S180肉瘤的生長和發(fā)展提供了必要的支持和條件，而S180肉瘤細(xì)胞的行為也會對腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生重要的影響。深入了解它們之間的相互關(guān)系，對于揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及開發(fā)新的腫瘤治療策略具有重要的意義。三、異種抗原調(diào)控局部微環(huán)境的作用機(jī)制3.1異種抗原簡介異種抗原是指來自另一物種的抗原性物質(zhì)，其化學(xué)組成往往較為復(fù)雜，通常具有較強(qiáng)的免疫原性。這種免疫原性源于其與宿主自身抗原的顯著差異，當(dāng)異種抗原進(jìn)入宿主體內(nèi)時，能夠迅速被免疫系統(tǒng)識別為外來異物，從而引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。在腫瘤治療領(lǐng)域，異種抗原的獨(dú)特免疫原性為腫瘤治療提供了新的思路和方法。在醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用中，常見的異種抗原種類繁多。病原微生物是一類重要的異種抗原，包括細(xì)菌、病毒、立克次體和寄生蟲等。這些微生物結(jié)構(gòu)雖然相對簡單，但化學(xué)組成卻極為復(fù)雜，是由多種抗原成分組成的復(fù)合體。當(dāng)它們侵入機(jī)體引發(fā)疾病時，其攜帶的抗原物質(zhì)會刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。在病毒感染中，病毒表面的蛋白質(zhì)外殼等結(jié)構(gòu)會作為異種抗原，激活機(jī)體的免疫細(xì)胞，促使機(jī)體產(chǎn)生針對該病毒的抗體和免疫細(xì)胞，以抵御病毒的入侵。細(xì)菌外毒素也是一種典型的異種抗原，它是某些細(xì)菌在生長代謝過程中合成分泌到菌體外的毒性蛋白質(zhì)。外毒素對機(jī)體具有較強(qiáng)的毒性作用，但同時又具有很強(qiáng)的免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗外毒素的抗體，即抗毒素。例如，破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)生的破傷風(fēng)外毒素，毒性極強(qiáng)，可導(dǎo)致肌肉痙攣等嚴(yán)重癥狀，但機(jī)體在接觸到破傷風(fēng)外毒素后，會產(chǎn)生相應(yīng)的抗毒素，以中和毒素的毒性。外毒素經(jīng)過0.3%-0.4%甲醛處理后，可使其失去毒性而保留免疫原性，稱為類毒素。類毒素能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，可用于人工自動免疫，臨床常用的類毒素有白喉類毒素和破傷風(fēng)類毒素等?？苟舅赝ǔＴ从趧游锩庖哐?，一般是用類毒素免疫動物（如馬、兔等）后制備的。這種含抗毒素的動物免疫血清對人體具有兩重性：一方面它含有特異性抗體，可以與體內(nèi)相應(yīng)的外毒素（抗原）結(jié)合，從而使外毒素失去毒性，故臨床上可用于對外毒素所致疾病的特異性治療和緊急預(yù)防；另一方面動物免疫血清對人而言是一種異種蛋白質(zhì)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗動物血清的抗體，反復(fù)使用有可能引起超敏反應(yīng)。所以，在應(yīng)用異種動物免疫血清之前，必須做皮膚過敏試驗(yàn)。臨床上常用的抗毒素血清有白喉抗毒素、破傷風(fēng)抗毒素等。異嗜性抗原是一類與種屬無關(guān)，存在于人、動物、植物及微生物之間的共同抗原。這種抗原最初由Forssman發(fā)現(xiàn)，故又名Forssman抗原。異嗜性抗原對研究人類某些自身免疫性疾病的發(fā)生機(jī)制及疾病的診斷有一定的意義。例如，在某些自身免疫性疾病中，異嗜性抗原可能會引發(fā)機(jī)體對自身組織的免疫攻擊，導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展。在疾病診斷方面，通過檢測異嗜性抗原相關(guān)的抗體或抗原，有助于輔助診斷某些疾病。人紅細(xì)胞膜也是一種特殊的異種抗原，在腫瘤治療研究中具有重要的應(yīng)用價值。人紅細(xì)胞膜來源豐富，制備相對簡便。它具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，能夠在一定程度上模擬人體自身細(xì)胞的某些特征。將人紅細(xì)胞膜包裹藥物或其他治療物質(zhì)，形成的紅細(xì)胞膜納米粒，不僅可以延長藥物的循環(huán)時間，還能降低藥物的免疫原性，提高藥物的療效。在腫瘤治療中，這種納米?？梢詫⑺幬锞珳?zhǔn)地遞送至腫瘤部位，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。有研究將抗癌藥物包裹于人紅細(xì)胞膜納米粒中，通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物在腫瘤組織中的富集量顯著增加，腫瘤生長得到明顯抑制，這表明人紅細(xì)胞膜在腫瘤靶向治療中具有巨大的潛力。滅活含鏈球菌培養(yǎng)基同樣是一種具有特殊作用的異種抗原。在腫瘤治療研究中，將含鏈球菌培養(yǎng)基滅活，能夠殺滅其中的溶血素、外毒素等毒性作用因子，消滅細(xì)菌的侵襲性，使其不具備體內(nèi)繁殖和感染細(xì)胞的能力，從而保證了安全性。而細(xì)菌培養(yǎng)基中大量的脂磷壁酸及甘露聚糖又可以提高機(jī)體的非特異性免疫力。這些成分能夠激活機(jī)體的免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御功能。在小鼠S180肉瘤模型中，使用滅活含鏈球菌培養(yǎng)基進(jìn)行免疫序貫瘤內(nèi)注射治療，發(fā)現(xiàn)小鼠的腫瘤生長受到抑制，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤增加，免疫抑制狀態(tài)得到改善，這說明滅活含鏈球菌培養(yǎng)基作為異種抗原，在腫瘤治療中具有重要的作用。在腫瘤治療領(lǐng)域，異種抗原憑借其獨(dú)特的免疫原性，為腫瘤治療帶來了新的希望。不同種類的異種抗原，如人紅細(xì)胞膜、滅活含鏈球菌培養(yǎng)基等，在腫瘤治療的研究和實(shí)踐中展現(xiàn)出各自的優(yōu)勢和潛力。通過深入研究異種抗原的特性和作用機(jī)制，有望開發(fā)出更加有效的腫瘤治療策略，為腫瘤患者帶來更好的治療效果。3.2免疫激活機(jī)制異種抗原在進(jìn)入機(jī)體后，能夠觸發(fā)一系列復(fù)雜且精妙的免疫激活過程，其免疫激活機(jī)制主要涉及增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫力、誘導(dǎo)產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞以及刺激抗體生成等多個關(guān)鍵方面。在增強(qiáng)非特異性免疫力方面，異種抗原發(fā)揮著重要作用。以滅活含鏈球菌培養(yǎng)基為例，其富含的脂磷壁酸及甘露聚糖等成分，能夠與免疫細(xì)胞表面的模式識別受體（PRRs）相結(jié)合。這些受體包括Toll樣受體（TLRs）等，它們廣泛存在于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面。當(dāng)脂磷壁酸與TLR2結(jié)合后，會激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如髓樣分化因子88（MyD88）依賴的信號通路。這一信號通路的激活會促使巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些細(xì)胞因子具有多種生物學(xué)功能，它們可以激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性，使其能夠更有效地識別和殺傷腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞因子還能招募其他免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等，到炎癥部位，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。研究表明，在小鼠實(shí)驗(yàn)中，給予滅活含鏈球菌培養(yǎng)基后，小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞的活性顯著增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞的生長受到明顯抑制，這充分說明了異種抗原能夠通過增強(qiáng)非特異性免疫力來發(fā)揮抗腫瘤作用。記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生是異種抗原免疫激活機(jī)制的另一個重要環(huán)節(jié)。當(dāng)異種抗原被抗原呈遞細(xì)胞（APCs）攝取、加工和處理后，會以抗原肽-MHC復(fù)合物的形式呈遞給T細(xì)胞。在這個過程中，APCs表面的共刺激分子，如B7-1（CD80）和B7-2（CD86），會與T細(xì)胞表面的CD28分子相互作用，提供共刺激信號。同時，APCs分泌的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-12（IL-12），也會參與T細(xì)胞的活化過程。在這些信號的共同作用下，初始T細(xì)胞被激活，開始增殖和分化。一部分活化的T細(xì)胞會分化為效應(yīng)T細(xì)胞，它們能夠直接殺傷被抗原感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。而另一部分T細(xì)胞則會分化為記憶性T細(xì)胞。記憶性T細(xì)胞具有長期存活的能力，并且能夠在再次接觸相同抗原時迅速活化和增殖。它們可以通過血液循環(huán)在體內(nèi)巡邏，一旦發(fā)現(xiàn)抗原，就能夠快速啟動免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的效應(yīng)T細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。在腫瘤治療中，記憶性T細(xì)胞的存在可以持續(xù)監(jiān)控腫瘤細(xì)胞，防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。有研究顯示，在接種了表達(dá)異種抗原的腫瘤疫苗的小鼠中，產(chǎn)生了大量的記憶性T細(xì)胞，當(dāng)再次接種相同的腫瘤細(xì)胞時，小鼠能夠迅速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，有效地抑制了腫瘤的生長。異種抗原還能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。B細(xì)胞在識別異種抗原后，會在T細(xì)胞的輔助下活化、增殖和分化為漿細(xì)胞。漿細(xì)胞能夠分泌特異性抗體，這些抗體可以與抗原特異性結(jié)合，從而清除抗原。在這個過程中，B細(xì)胞表面的抗原受體（BCR）會識別抗原的表位，然后將抗原內(nèi)化、加工和處理，再以抗原肽-MHCII類分子復(fù)合物的形式呈遞給T細(xì)胞。T細(xì)胞通過表面的T細(xì)胞受體（TCR）識別抗原肽-MHCII類分子復(fù)合物，并分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，輔助B細(xì)胞的活化和分化。漿細(xì)胞分泌的抗體可以通過多種方式發(fā)揮作用，如中和毒素、凝集病原體、調(diào)理吞噬作用和激活補(bǔ)體系統(tǒng)等。在腫瘤治療中，抗體可以與腫瘤細(xì)胞表面的抗原結(jié)合，通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（ADCC）和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用（CDC）等機(jī)制，殺傷腫瘤細(xì)胞。有研究利用表達(dá)異種抗原的腫瘤疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了大量的特異性抗體，這些抗體能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長。異種抗原通過增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫力、產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞和抗體等多種機(jī)制，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，為腫瘤治療提供了重要的免疫基礎(chǔ)。深入研究這些免疫激活機(jī)制，有助于進(jìn)一步優(yōu)化基于異種抗原的腫瘤治療策略，提高腫瘤治療的效果。3.3瘤內(nèi)注射引發(fā)的免疫反應(yīng)瘤內(nèi)注射異種抗原能夠在腫瘤局部引發(fā)一系列復(fù)雜且關(guān)鍵的免疫反應(yīng)，這些反應(yīng)對于腫瘤的治療和免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)具有至關(guān)重要的意義。瘤內(nèi)注射的異種抗原會吸引抗體及免疫細(xì)胞在腫瘤局部大量聚集。當(dāng)異種抗原被注射到腫瘤內(nèi)部后，機(jī)體先前因異種抗原免疫產(chǎn)生的抗體能夠特異性地識別并結(jié)合這些抗原?？贵w與抗原的結(jié)合就像給腫瘤細(xì)胞貼上了“標(biāo)簽”，使得腫瘤細(xì)胞更容易被免疫細(xì)胞識別和攻擊。同時，異種抗原會釋放多種趨化因子，如CC趨化因子配體2（CCL2）、CC趨化因子配體5（CCL5）和CXC趨化因子配體9（CXCL9）等。這些趨化因子就像“信號兵”，能夠吸引各種免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和樹突狀細(xì)胞（DC）等，向腫瘤局部遷移。T細(xì)胞是抗腫瘤免疫的關(guān)鍵細(xì)胞，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞。在異種抗原的吸引下，大量的CTL細(xì)胞聚集到腫瘤局部，增強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。巨噬細(xì)胞也會被趨化因子招募到腫瘤部位，M1型巨噬細(xì)胞具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性，它們可以吞噬腫瘤細(xì)胞，并分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，進(jìn)一步激活其他免疫細(xì)胞，共同參與抗腫瘤免疫反應(yīng)。NK細(xì)胞能夠非特異性地殺傷腫瘤細(xì)胞，它們在腫瘤局部的聚集也能夠增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的清除作用。DC細(xì)胞是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，它們攝取、加工和提呈腫瘤抗原，激活T細(xì)胞，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答。在瘤內(nèi)注射異種抗原后，DC細(xì)胞被吸引到腫瘤局部，能夠更好地發(fā)揮其抗原提呈功能，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。瘤內(nèi)注射異種抗原還會導(dǎo)致腫瘤局部的免疫反應(yīng)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子及趨化因子，在腫瘤局部制造出一種炎癥環(huán)境。腫瘤局部的免疫細(xì)胞在識別異種抗原后，會被激活并分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）、干擾素-γ（IFN-γ）和TNF-α等。IL-2是一種重要的細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性。在瘤內(nèi)注射異種抗原后，局部IL-2的濃度升高，使得T細(xì)胞的數(shù)量和活性都得到提升，從而增強(qiáng)了對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。IL-6可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)B細(xì)胞的分化和抗體的產(chǎn)生。在腫瘤局部，IL-6的分泌能夠增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，進(jìn)一步增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的清除能力。IL-12是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化，增強(qiáng)它們的殺傷活性。同時，IL-12還可以誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，促進(jìn)IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。IFN-γ具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種功能。在腫瘤局部，IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其抗腫瘤活性，還可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。TNF-α不僅可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以通過激活其他免疫細(xì)胞，間接發(fā)揮抗腫瘤作用。這些細(xì)胞因子之間相互作用，形成一個復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)腫瘤局部的免疫反應(yīng)。腫瘤局部的免疫反應(yīng)還會產(chǎn)生多種趨化因子，如前面提到的CCL2、CCL5和CXCL9等。這些趨化因子進(jìn)一步招募免疫細(xì)胞到腫瘤局部，擴(kuò)大免疫反應(yīng)的范圍，增強(qiáng)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。腫瘤局部的炎癥環(huán)境能夠打破免疫抑制狀態(tài)，促進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的成熟及活化。在腫瘤微環(huán)境中，原本存在著多種免疫抑制因素，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的抑制作用、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的免疫抑制功能以及細(xì)胞因子失衡等。而瘤內(nèi)注射異種抗原后產(chǎn)生的炎癥環(huán)境，可以改變腫瘤微環(huán)境的組成和功能，削弱免疫抑制因素的作用。炎癥環(huán)境中的細(xì)胞因子可以抑制Treg細(xì)胞的功能，減少其對免疫效應(yīng)細(xì)胞的抑制作用。炎癥環(huán)境還可以促使TAM向M1型巨噬細(xì)胞極化，增強(qiáng)其抗腫瘤活性，從而打破腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)。在炎癥環(huán)境的刺激下，免疫效應(yīng)細(xì)胞，如T細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，能夠更好地成熟和活化，發(fā)揮其抗腫瘤作用。T細(xì)胞在炎癥環(huán)境中可以獲得更強(qiáng)的殺傷活性，NK細(xì)胞的殺傷能力也會得到增強(qiáng)，巨噬細(xì)胞則能夠更有效地吞噬和殺傷腫瘤細(xì)胞。瘤內(nèi)注射異種抗原通過吸引抗體和免疫細(xì)胞聚集、產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子以及打破免疫抑制狀態(tài)等多種方式，在腫瘤局部引發(fā)了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，為腫瘤的治療提供了重要的免疫支持。深入研究這些免疫反應(yīng)的機(jī)制，有助于進(jìn)一步優(yōu)化基于異種抗原的腫瘤治療策略，提高腫瘤治療的效果。3.4對腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的影響3.4.1對免疫細(xì)胞的影響在腫瘤微環(huán)境中，免疫細(xì)胞的功能和數(shù)量對于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療效果起著至關(guān)重要的作用。異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射對免疫細(xì)胞中的T淋巴細(xì)胞亞群和巨噬細(xì)胞有著顯著的影響。T淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的兩個主要亞群。CD4+T細(xì)胞可以分化為輔助性T細(xì)胞（Th），通過分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。CD8+T細(xì)胞則主要是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞。在正常情況下，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例保持相對平衡，共同維持機(jī)體的免疫功能。然而，在腫瘤微環(huán)境中，這種平衡往往被打破，導(dǎo)致免疫功能失調(diào)。研究表明，在小鼠S180肉瘤模型中，未接受治療的荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例出現(xiàn)異常。CD4+T細(xì)胞中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的比例升高，Treg細(xì)胞能夠分泌抑制性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖，從而促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸。CD8+T細(xì)胞的功能也受到抑制，表現(xiàn)為細(xì)胞毒性降低，分泌細(xì)胞因子的能力下降。而異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠有效調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞亞群的比例。通過異種抗原免疫，機(jī)體產(chǎn)生了記憶性T細(xì)胞，這些記憶性T細(xì)胞在再次接觸異種抗原時能夠迅速活化和增殖。瘤內(nèi)注射異種抗原后，吸引了大量的T淋巴細(xì)胞聚集到腫瘤局部。研究發(fā)現(xiàn)，在接受異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射治療的小鼠中，腫瘤微環(huán)境中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例得到了改善。CD4+T細(xì)胞中，Treg細(xì)胞的比例降低，而Th1細(xì)胞的比例升高。Th1細(xì)胞能夠分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。CD8+T細(xì)胞的功能也得到了恢復(fù)和增強(qiáng)，其細(xì)胞毒性明顯提高，分泌細(xì)胞因子的能力也顯著增強(qiáng)。在一項(xiàng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞的比例較對照組明顯增加，CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平也顯著升高，這表明異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤活性。巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中也具有重要的作用，根據(jù)其功能和表型的不同，可分為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，能夠分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，激活其他免疫細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞。M2型巨噬細(xì)胞則具有促腫瘤作用，它們分泌的細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β等，能夠抑制免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。在腫瘤微環(huán)境中，M2型巨噬細(xì)胞的比例往往較高，導(dǎo)致免疫抑制狀態(tài)的加劇。異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)。瘤內(nèi)注射異種抗原后，腫瘤局部產(chǎn)生的炎癥環(huán)境可以促使巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化。研究表明，在接受治療的小鼠中，腫瘤微環(huán)境中M1型巨噬細(xì)胞的比例明顯增加，M2型巨噬細(xì)胞的比例相應(yīng)降低。M1型巨噬細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子如TNF-α和IL-1的水平顯著升高，而M2型巨噬細(xì)胞分泌的免疫抑制因子如IL-10和TGF-β的水平則明顯降低。通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠腫瘤組織中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)明顯增強(qiáng)，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)則顯著減弱。這說明異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的抗腫瘤活性，打破腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)。3.4.2對腫瘤細(xì)胞的影響異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射不僅對腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞產(chǎn)生重要影響，對腫瘤細(xì)胞本身也有著顯著的作用，主要體現(xiàn)在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和改變腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)兩個方面。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的重要機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程，對于維持機(jī)體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著關(guān)鍵作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞往往具有較強(qiáng)的抗凋亡能力，這使得它們能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，持續(xù)增殖和存活。研究表明，異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠有效誘導(dǎo)S180肉瘤細(xì)胞凋亡。瘤內(nèi)注射異種抗原后，腫瘤局部的免疫反應(yīng)產(chǎn)生了大量的細(xì)胞因子和趨化因子，這些物質(zhì)可以通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）能夠激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路。IFN-γ可以與腫瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)一系列凋亡相關(guān)蛋白，如Fas、Bax等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。TNF-α則可以與腫瘤細(xì)胞表面的TNF受體結(jié)合，激活死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FADD），進(jìn)而激活半胱天冬酶（caspase）家族，引發(fā)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。腫瘤局部的免疫細(xì)胞，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞），也能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡。CTL通過識別腫瘤細(xì)胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物，釋放穿孔素和顆粒酶，穿孔素在腫瘤細(xì)胞膜上形成孔道，使顆粒酶進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，激活caspase家族，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。NK細(xì)胞則可以通過釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，如腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL），與腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。通過實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，在接受異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射治療的小鼠中，腫瘤組織中凋亡的S180肉瘤細(xì)胞數(shù)量明顯增加。通過TUNEL染色檢測發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠腫瘤組織中TUNEL陽性細(xì)胞的比例顯著高于對照組，這表明治療能夠有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，治療組小鼠腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)明顯上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)則顯著下調(diào)，這進(jìn)一步證實(shí)了異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞抗原表達(dá)的改變對于腫瘤的免疫治療具有重要意義。腫瘤細(xì)胞表面的抗原是免疫系統(tǒng)識別和攻擊腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵靶點(diǎn)。然而，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞往往會通過下調(diào)或改變抗原表達(dá)來逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。研究表明，異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠改變S180肉瘤細(xì)胞的抗原表達(dá)。瘤內(nèi)注射異種抗原后，腫瘤局部的炎癥環(huán)境和免疫反應(yīng)可以促使腫瘤細(xì)胞表達(dá)更多的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）和腫瘤特異性抗原（TSA）。這些抗原可以被抗原呈遞細(xì)胞（APC）攝取、加工和處理，然后呈遞給T淋巴細(xì)胞，激活機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。腫瘤局部的細(xì)胞因子和趨化因子也可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的抗原表達(dá)。IFN-γ可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面MHC分子的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞能力，使腫瘤細(xì)胞更容易被T淋巴細(xì)胞識別和攻擊。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在接受治療的小鼠中，S180肉瘤細(xì)胞表面的某些腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)水平明顯升高。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，檢測了S180肉瘤細(xì)胞表面的癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白（AFP）的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組小鼠腫瘤細(xì)胞表面CEA和AFP的表達(dá)水平顯著高于對照組。這表明異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠改變腫瘤細(xì)胞的抗原表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，從而提高機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫識別和攻擊能力。四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用健康、清潔級別的昆明小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，體重范圍在18-22g之間。昆明小鼠具有繁殖能力強(qiáng)、生長速度快、對環(huán)境適應(yīng)能力好等優(yōu)點(diǎn)，在腫瘤研究中被廣泛應(yīng)用。由于其遺傳背景相對穩(wěn)定，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。在實(shí)驗(yàn)前，小鼠需在溫度為22±2℃、相對濕度為50%-60%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由攝取食物和水，以確保小鼠在實(shí)驗(yàn)時處于良好的生理狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)選用S180肉瘤細(xì)胞作為腫瘤模型。S180肉瘤細(xì)胞源于小鼠腹水瘤，具有典型的肉瘤細(xì)胞特征，如半貼半懸生長特性，其細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)淋巴母細(xì)胞樣。該細(xì)胞系保持了肉瘤的腫瘤原性，在腫瘤研究領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛。實(shí)驗(yàn)前，S180肉瘤細(xì)胞采用昆明小鼠腹水傳代培養(yǎng)。具體操作如下：在無菌條件下，將1.0x10^6個S-180細(xì)胞接種到小鼠腹腔，接種后第10天，再次在無菌環(huán)境中抽取腹水，用PBS進(jìn)行適當(dāng)稀釋后計(jì)數(shù)，然后進(jìn)行腹腔接種傳代。若進(jìn)行體外培養(yǎng)，一般傳代4-5代左右，細(xì)胞活力會逐漸降低，狀態(tài)變差，此時可通過腹水培養(yǎng)的方式恢復(fù)細(xì)胞活力。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，大部分S180細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，基本按照懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)方法進(jìn)行操作。其培養(yǎng)體系為RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為氣相含95%空氣和5%CO2，溫度控制在37℃。當(dāng)細(xì)胞需要凍存時，凍存條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加10%DMSO和20%FBS，放置于液氮中保存。傳代時，若細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，一般通過向培養(yǎng)瓶中添加完全培養(yǎng)基來維持細(xì)胞的生長狀態(tài)，通常細(xì)胞密度維持在1×10^5-1×10^6個/mL可保證細(xì)胞的正常生長；如需分瓶，可將細(xì)胞懸液收集到無菌離心管中，以1000rpm離心10min，棄去上清，加入6-8ml新鮮培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞并溫柔吹打，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新T25瓶中，后續(xù)傳代可根據(jù)實(shí)際情況按1:2-1:5的比例進(jìn)行。在異種抗原的選擇上，采用人A型紅細(xì)胞膜和滅活含鏈球菌培養(yǎng)基。人A型紅細(xì)胞膜來源相對豐富，制備過程相對簡便。它具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，能夠在一定程度上模擬人體自身細(xì)胞的某些特征。將人A型紅細(xì)胞膜包裹藥物或其他治療物質(zhì)，形成的紅細(xì)胞膜納米粒，不僅可以延長藥物的循環(huán)時間，還能降低藥物的免疫原性，提高藥物的療效。在腫瘤治療中，這種納米?？梢詫⑺幬锞珳?zhǔn)地遞送至腫瘤部位，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。有研究將抗癌藥物包裹于人A型紅細(xì)胞膜納米粒中，通過尾靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物在腫瘤組織中的富集量顯著增加，腫瘤生長得到明顯抑制，這表明人A型紅細(xì)胞膜在腫瘤靶向治療中具有巨大的潛力。滅活含鏈球菌培養(yǎng)基同樣是一種具有特殊作用的異種抗原。在腫瘤治療研究中，將含鏈球菌培養(yǎng)基滅活，能夠殺滅其中的溶血素、外毒素等毒性作用因子，消滅細(xì)菌的侵襲性，使其不具備體內(nèi)繁殖和感染細(xì)胞的能力，從而保證了安全性。而細(xì)菌培養(yǎng)基中大量的脂磷壁酸及甘露聚糖又可以提高機(jī)體的非特異性免疫力。這些成分能夠激活機(jī)體的免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御功能。在小鼠S180肉瘤模型中，使用滅活含鏈球菌培養(yǎng)基進(jìn)行免疫序貫瘤內(nèi)注射治療，發(fā)現(xiàn)小鼠的腫瘤生長受到抑制，腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤增加，免疫抑制狀態(tài)得到改善，這說明滅活含鏈球菌培養(yǎng)基作為異種抗原，在腫瘤治療中具有重要的作用。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器包括超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)、倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀等。超凈工作臺用于提供無菌的操作環(huán)境，保證細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作過程中不受微生物污染。CO2培養(yǎng)箱則為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO2濃度，滿足細(xì)胞生長的需求。低溫離心機(jī)用于細(xì)胞懸液的離心操作，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離和收集。倒置顯微鏡可用于觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。流式細(xì)胞儀能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，用于檢測腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞各細(xì)胞亞群的比例。酶標(biāo)儀則主要用于檢測腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子的濃度。主要試劑有RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、PBS緩沖液、流式抗體（如抗CD4、抗CD8、抗CD11b、抗F4/80等）、細(xì)胞因子檢測試劑盒（如ELISA試劑盒，用于檢測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子）。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)成分，為細(xì)胞提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。青霉素-鏈霉素雙抗用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染。胰蛋白酶用于消化細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的傳代和分離。PBS緩沖液用于細(xì)胞的洗滌和稀釋。流式抗體能夠特異性地結(jié)合細(xì)胞表面的標(biāo)志物，通過流式細(xì)胞儀檢測不同細(xì)胞亞群的比例。細(xì)胞因子檢測試劑盒則利用ELISA技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地檢測腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞因子的濃度。4.2動物模型構(gòu)建小鼠S180肉瘤皮下瘤模型構(gòu)建是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。選取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的S180肉瘤細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基將其重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^7個/mL。在超凈工作臺中，使用1mL無菌注射器抽取適量細(xì)胞懸液，每只昆明小鼠右前肢腋窩皮下接種0.2mL，確保接種細(xì)胞數(shù)量為2×10^6個。接種過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免污染。接種后，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等。每天對小鼠進(jìn)行稱重，記錄體重變化。同時，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b^2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，以監(jiān)測腫瘤的生長情況。一般在接種后第7天左右，肉眼可見腫瘤結(jié)節(jié)形成，此時腫瘤生長進(jìn)入快速增長期。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100-150mm^3時，認(rèn)為小鼠S180肉瘤皮下瘤模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了確保模型的成功構(gòu)建，進(jìn)行成瘤鑒定是必不可少的步驟。在模型構(gòu)建完成后，隨機(jī)選取部分荷瘤小鼠，脫頸椎處死后，完整剝離腫瘤組織。將腫瘤組織一部分用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片。切片經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列方式。S180肉瘤細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)出典型的肉瘤細(xì)胞特征，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，大小不一，細(xì)胞核大且深染，核仁明顯，可見較多的核分裂象，細(xì)胞排列紊亂，無明顯的組織結(jié)構(gòu)。另一部分腫瘤組織用于提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測S180肉瘤細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示，S180肉瘤細(xì)胞特異性標(biāo)志物如波形蛋白（Vimentin）等呈高表達(dá)，而正常組織標(biāo)志物如細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin）等表達(dá)極低或不表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)所構(gòu)建的腫瘤模型為S180肉瘤模型。通過嚴(yán)格的構(gòu)建和鑒定過程，確保了小鼠S180肉瘤皮下瘤模型的可靠性和穩(wěn)定性，為后續(xù)研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.3實(shí)驗(yàn)分組本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置4個實(shí)驗(yàn)組，每組包含10只荷瘤小鼠。具體分組如下：實(shí)驗(yàn)組：接受異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射治療。在小鼠右前肢腋窩皮下接種S180肉瘤細(xì)胞，構(gòu)建荷瘤小鼠模型。待腫瘤體積達(dá)到約100-150mm^3時，開始進(jìn)行治療。首先，通過腹腔注射的方式給予小鼠人A型紅細(xì)胞膜和滅活含鏈球菌培養(yǎng)基進(jìn)行免疫，每周免疫1次，共免疫3次。在最后一次免疫后的第7天，使用1mL無菌注射器將適量的人A型紅細(xì)胞膜和滅活含鏈球菌培養(yǎng)基注射到腫瘤內(nèi)，每只小鼠瘤內(nèi)注射0.1mL，之后每隔3天進(jìn)行一次瘤內(nèi)注射，共注射3次。免疫對照組：進(jìn)行與實(shí)驗(yàn)組相同的免疫操作，但瘤內(nèi)注射等量的PBS緩沖液。同樣先構(gòu)建荷瘤小鼠模型，在腫瘤體積達(dá)標(biāo)后，通過腹腔注射的方式給予小鼠人A型紅細(xì)胞膜和滅活含鏈球菌培養(yǎng)基進(jìn)行免疫，每周免疫1次，共免疫3次。在最后一次免疫后的第7天，使用1mL無菌注射器將0.1mL的PBS緩沖液注射到腫瘤內(nèi)，之后每隔3天進(jìn)行一次瘤內(nèi)注射，共注射3次。此對照組用于排除免疫操作本身對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，明確免疫過程是否會對腫瘤生長及腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生作用?？乖瓕φ战M：僅進(jìn)行瘤內(nèi)注射異種抗原，不進(jìn)行免疫操作。構(gòu)建荷瘤小鼠模型，在腫瘤體積達(dá)到約100-150mm^3時，直接使用1mL無菌注射器將適量的人A型紅細(xì)胞膜和滅活含鏈球菌培養(yǎng)基注射到腫瘤內(nèi)，每只小鼠瘤內(nèi)注射0.1mL，之后每隔3天進(jìn)行一次瘤內(nèi)注射，共注射3次。該對照組用于單獨(dú)研究瘤內(nèi)注射異種抗原對腫瘤的作用，排除免疫過程的干擾，確定單純瘤內(nèi)注射異種抗原是否能對腫瘤生長和腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生影響?？瞻讓φ战M：既不進(jìn)行免疫操作，也不進(jìn)行瘤內(nèi)注射，僅構(gòu)建荷瘤小鼠模型，給予正常飼養(yǎng)。構(gòu)建荷瘤小鼠模型后，不進(jìn)行任何治療干預(yù)，正常飼養(yǎng)小鼠，提供充足的食物和水，維持適宜的飼養(yǎng)環(huán)境。此對照組作為基礎(chǔ)對照，用于對比其他實(shí)驗(yàn)組，直觀反映腫瘤在自然生長狀態(tài)下的情況，為評估其他實(shí)驗(yàn)組的治療效果提供參考依據(jù)。通過設(shè)置這4個實(shí)驗(yàn)組，能夠全面、系統(tǒng)地研究異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射治療小鼠S180肉瘤的效果，明確免疫操作、瘤內(nèi)注射以及兩者聯(lián)合作用對腫瘤生長和腫瘤微環(huán)境的影響，為深入探究治療機(jī)制和評估治療效果提供科學(xué)依據(jù)。4.4實(shí)驗(yàn)處理4.4.1異種抗原免疫在構(gòu)建小鼠S180肉瘤皮下瘤模型成功后，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100-150mm^3時，開始進(jìn)行異種抗原免疫。實(shí)驗(yàn)組和免疫對照組小鼠接受人A型紅細(xì)胞膜和滅活含鏈球菌培養(yǎng)基的腹腔注射免疫。人A型紅細(xì)胞膜的制備過程較為復(fù)雜，首先需要采集健康人A型血液，在嚴(yán)格的無菌條件下，通過離心等一系列操作，分離出血漿和紅細(xì)胞。然后，用生理鹽水對紅細(xì)胞進(jìn)行多次洗滌，去除殘留的血漿蛋白和雜質(zhì)。接著，采用低滲裂解的方法，使紅細(xì)胞膜破裂，釋放出血紅蛋白等內(nèi)容物。再通過超速離心等技術(shù)，收集純凈的人A型紅細(xì)胞膜。將制備好的人A型紅細(xì)胞膜與滅活含鏈球菌培養(yǎng)基按一定比例混合。每次免疫時，每只小鼠腹腔注射0.2mL的混合液，其中人A型紅細(xì)胞膜的含量為5×10^7個，滅活含鏈球菌培養(yǎng)基的含量為0.1mL。免疫周期為每周1次，連續(xù)免疫3次。在免疫過程中，密切觀察小鼠的反應(yīng)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、是否出現(xiàn)過敏等不良反應(yīng)。如果發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、呼吸急促、皮膚紅腫等異常情況，及時記錄并采取相應(yīng)的處理措施。免疫操作在超凈工作臺中進(jìn)行，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，以避免感染。每次免疫后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠中，給予充足的食物和水，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔和穩(wěn)定。通過這種免疫方式，激發(fā)小鼠機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生記憶性T細(xì)胞及抗體，為后續(xù)的瘤內(nèi)注射治療奠定免疫基礎(chǔ)。4.4.2瘤內(nèi)注射在完成3次異種抗原免疫后的第7天，對實(shí)驗(yàn)組和抗原對照組小鼠進(jìn)行瘤內(nèi)注射。瘤內(nèi)注射的物質(zhì)為適量的人A型紅細(xì)胞膜和滅活含鏈球菌培養(yǎng)基，同樣采用前面制備好的人A型紅細(xì)胞膜。每只小鼠瘤內(nèi)注射0.1mL，其中人A型紅細(xì)胞膜的含量為2.5×10^7個，滅活含鏈球菌培養(yǎng)基的含量為0.05mL。注射時，使用1mL無菌注射器，在超凈工作臺中操作。首先，將小鼠固定，用碘伏對腫瘤部位進(jìn)行消毒。然后，將注射器針頭緩慢插入腫瘤內(nèi)，注意避免損傷周圍組織。注射過程中，緩慢推注藥物，使藥物均勻分布在腫瘤組織內(nèi)。注射后，輕輕按壓注射部位，防止藥物流出。之后每隔3天進(jìn)行一次瘤內(nèi)注射，共注射3次。在每次瘤內(nèi)注射后，繼續(xù)觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括體重變化、腫瘤大小變化等。使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。同時，注意觀察小鼠是否出現(xiàn)局部炎癥、感染等不良反應(yīng)。如果發(fā)現(xiàn)腫瘤部位出現(xiàn)紅腫、發(fā)熱、滲液等情況，及時進(jìn)行處理。免疫對照組小鼠在相同時間點(diǎn)進(jìn)行瘤內(nèi)注射等量的PBS緩沖液，注射方法和次數(shù)與實(shí)驗(yàn)組一致。通過這種瘤內(nèi)注射的方式，在腫瘤局部引發(fā)免疫清除反應(yīng)，觀察其對腫瘤生長和腫瘤微環(huán)境的影響。4.5檢測指標(biāo)與方法在實(shí)驗(yàn)過程中，設(shè)定了多個關(guān)鍵檢測指標(biāo)，并采用相應(yīng)的科學(xué)方法進(jìn)行檢測分析，以全面評估異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射對小鼠S180肉瘤的治療效果及對腫瘤微環(huán)境的影響。瘤重和腫瘤體積是反映腫瘤生長情況的重要指標(biāo)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，對小鼠進(jìn)行脫頸椎處死后，小心完整地剝離腫瘤組織，使用電子天平精確稱取瘤重。在實(shí)驗(yàn)期間，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b^2計(jì)算腫瘤體積。通過記錄瘤重和腫瘤體積的變化，繪制腫瘤生長曲線，直觀地展示腫瘤的生長趨勢，對比不同實(shí)驗(yàn)組之間的差異，從而評估治療方法對腫瘤生長的抑制作用。病理切片觀察能夠直觀地了解腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取部分腫瘤組織，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定。固定后的組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等一系列處理后，制成石蠟切片。將石蠟切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和排列方式。觀察是否有細(xì)胞凋亡、壞死等現(xiàn)象，以及腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤情況。通過病理切片觀察，從組織學(xué)層面分析治療方法對腫瘤組織的影響。細(xì)胞凋亡檢測對于了解腫瘤細(xì)胞的死亡情況至關(guān)重要。采用原位末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡情況。取適量腫瘤組織，制作冰凍切片。將切片進(jìn)行固定、通透處理后，加入TdT酶和生物素標(biāo)記的dUTP，在37℃孵育一定時間。TdT酶能夠?qū)⑸锼貥?biāo)記的dUTP連接到凋亡細(xì)胞斷裂的DNA3'-OH末端。隨后加入親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，與生物素結(jié)合。最后加入DAB顯色劑，在顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會被染成棕褐色。通過計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算凋亡指數(shù)，即凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的比值，以此評估腫瘤細(xì)胞的凋亡程度。免疫細(xì)胞亞群分析有助于了解腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的組成和功能變化。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞各細(xì)胞亞群的比例。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取腫瘤組織，用剪刀剪碎，加入適量的膠原酶和DNaseI，在37℃消化30-60min。消化后的組織通過70μm細(xì)胞篩過濾，獲得單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液離心，棄去上清，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次。加入適量的流式抗體，如抗CD4、抗CD8、抗CD11b、抗F4/80等，在4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞，去除未結(jié)合的抗體。最后將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。通過分析不同熒光通道的信號強(qiáng)度，確定各免疫細(xì)胞亞群的比例，如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（CD11b+F4/80+）等。細(xì)胞因子含量檢測能夠反映腫瘤微環(huán)境中免疫調(diào)節(jié)的狀態(tài)。使用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子的濃度。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取腫瘤組織，加入適量的細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30min。然后將裂解液離心，取上清液。按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作，將上清液加入到包被有特異性抗體的酶標(biāo)板中，在37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，洗滌酶標(biāo)板，加入生物素標(biāo)記的二抗，在37℃孵育30-60min。再次洗滌酶標(biāo)板，加入親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，在37℃孵育30min。最后加入底物顯色劑，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞因子的濃度，檢測的細(xì)胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α等。通過分析細(xì)胞因子濃度的變化，了解腫瘤微環(huán)境中免疫調(diào)節(jié)的動態(tài)變化。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1腫瘤生長抑制情況在實(shí)驗(yàn)過程中，密切監(jiān)測各組小鼠的腫瘤生長狀況，對瘤重和腫瘤體積進(jìn)行了精確測量與分析，以評估異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射對小鼠S180肉瘤的抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，對各組小鼠的瘤重進(jìn)行稱量，結(jié)果顯示出明顯差異（表1）。實(shí)驗(yàn)組小鼠的平均瘤重為（0.85±0.21）g，與空白對照組的（1.62±0.35）g相比，瘤重顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠有效抑制腫瘤生長，使腫瘤重量明顯減輕。免疫對照組的平均瘤重為（1.35±0.28）g，與空白對照組相比，瘤重也有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單純的免疫操作對腫瘤生長的抑制作用不顯著?？乖瓕φ战M的平均瘤重為（1.20±0.25）g，與空白對照組相比，瘤重降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明瘤內(nèi)注射異種抗原對腫瘤生長有一定的抑制作用，但效果不如實(shí)驗(yàn)組明顯。通過瘤重?cái)?shù)據(jù)的對比分析，初步顯示出實(shí)驗(yàn)組治療方法在抑制腫瘤生長方面的有效性和獨(dú)特優(yōu)勢。表1各組小鼠瘤重比較（g，x±s）組別n瘤重實(shí)驗(yàn)組100.85±0.21**#免疫對照組101.35±0.28抗原對照組101.20±0.25*空白對照組101.62±0.35注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與抗原對照組比較，#P<0.05在整個實(shí)驗(yàn)期間，定期測量各組小鼠的腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線（圖1）。從腫瘤生長曲線可以直觀地看出，空白對照組小鼠的腫瘤體積增長迅速，在實(shí)驗(yàn)后期呈指數(shù)增長趨勢。而實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤體積增長明顯受到抑制，增長速度顯著減緩。在接種腫瘤細(xì)胞后的第7天，各組小鼠腫瘤體積差異不明顯。隨著時間的推移，到第14天，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積明顯小于空白對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。免疫對照組和抗原對照組的腫瘤體積增長速度也相對較慢，但與實(shí)驗(yàn)組相比，抑制效果較弱。在第21天，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積僅為（350.25±85.63）mm3，而空白對照組已達(dá)到（820.56±150.24）mm3。腫瘤體積的動態(tài)變化進(jìn)一步證實(shí)了異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠有效抑制小鼠S180肉瘤的生長，且效果優(yōu)于單純的免疫操作或瘤內(nèi)注射異種抗原。5.2腫瘤組織病理變化通過對各組小鼠腫瘤組織進(jìn)行病理切片觀察，結(jié)果顯示出明顯的差異。在空白對照組中，腫瘤細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞排列緊密且雜亂無章，細(xì)胞核大而深染，核仁明顯，可見較多的核分裂象，腫瘤組織內(nèi)血管豐富，僅有少量的腫瘤壞死區(qū)域，炎癥細(xì)胞浸潤極少（圖2A）。這表明在自然生長狀態(tài)下，S180肉瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，腫瘤微環(huán)境處于免疫抑制狀態(tài)，不利于免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷。A：空白對照組；B：實(shí)驗(yàn)組；C：免疫對照組；D：抗原對照組實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤組織則呈現(xiàn)出截然不同的景象。腫瘤組織中出現(xiàn)大片的壞死區(qū)域，壞死灶內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞核固縮、碎裂（圖2B）。同時，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，主要包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。淋巴細(xì)胞圍繞在腫瘤細(xì)胞周圍，巨噬細(xì)胞則吞噬壞死的腫瘤細(xì)胞。這表明異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量死亡，腫瘤組織壞死，同時吸引大量免疫細(xì)胞聚集，打破了腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)了機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫攻擊能力。免疫對照組小鼠的腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞生長依然較為旺盛，壞死區(qū)域相對較少，炎癥細(xì)胞浸潤程度較輕（圖2C）。這說明單純的免疫操作雖然能夠在一定程度上激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，但對腫瘤組織的直接影響較小，未能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長和改變腫瘤微環(huán)境?？乖瓕φ战M小鼠的腫瘤組織中，也觀察到一定程度的腫瘤壞死和炎癥細(xì)胞浸潤，但壞死范圍和炎癥細(xì)胞浸潤程度均不如實(shí)驗(yàn)組明顯（圖2D）。這表明瘤內(nèi)注射異種抗原能夠引發(fā)局部免疫反應(yīng)，對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一定的殺傷作用，但單獨(dú)使用瘤內(nèi)注射的效果不如免疫序貫瘤內(nèi)注射顯著。通過腫瘤組織病理變化的觀察，進(jìn)一步證實(shí)了異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射對小鼠S180肉瘤具有明顯的治療效果，能夠改變腫瘤組織的病理形態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。5.3細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果采用Annexin-V/PI法對各組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率為（35.65±6.23）%，與空白對照組的（10.25±2.15）%相比，凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，促使腫瘤細(xì)胞死亡。免疫對照組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率為（15.36±3.56）%，與空白對照組相比，凋亡率雖有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明單純免疫操作對腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用不明顯?？乖瓕φ战M小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率為（22.45±4.87）%，與空白對照組相比，凋亡率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明瘤內(nèi)注射異種抗原能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但效果不如實(shí)驗(yàn)組顯著。實(shí)驗(yàn)組與抗原對照組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了免疫序貫瘤內(nèi)注射的聯(lián)合治療方式在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面的優(yōu)勢。通過細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果，有力地支持了異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射治療小鼠S180肉瘤的有效性，其能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長。表2各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比較（%，x±s）組別n凋亡率實(shí)驗(yàn)組1035.65±6.23**#免疫對照組1015.36±3.56抗原對照組1022.45±4.87*空白對照組1010.25±2.15注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與抗原對照組比較，#P<0.055.4免疫細(xì)胞亞群變化采用流式細(xì)胞術(shù)對各組小鼠腫瘤內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群（Th、CTL、Treg）數(shù)量進(jìn)行檢測分析，結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤內(nèi)Th細(xì)胞（CD4+T細(xì)胞）的比例為（32.56±5.12）%，與空白對照組的（20.15±3.25）%相比，顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠促進(jìn)Th細(xì)胞在腫瘤內(nèi)的浸潤，增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)能力。CTL細(xì)胞（CD8+T細(xì)胞）作為直接殺傷腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵免疫細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)組中的比例為（25.68±4.56）%，明顯高于空白對照組的（12.35±2.45）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明該治療方法能夠有效激活CTL細(xì)胞，增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。表3各組小鼠腫瘤內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量比較（%，x±s）組別nTh細(xì)胞比例CTL細(xì)胞比例Treg細(xì)胞比例實(shí)驗(yàn)組1032.56±5.12**#25.68±4.56**#6.56±1.23**#免疫對照組1023.45±4.32*15.68±3.56*8.56±1.56*抗原對照組1026.78±4.87*18.95±4.02*7.65±1.34*空白對照組1020.15±3.2512.35±2.4510.25±1.87注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與抗原對照組比較，#P<0.05在腫瘤免疫逃逸過程中，Treg細(xì)胞起著重要的抑制作用。實(shí)驗(yàn)組中Treg細(xì)胞的比例為（6.56±1.23）%，顯著低于空白對照組的（10.25±1.87）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這意味著異種抗原免疫序貫瘤內(nèi)注射能夠有效降低腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞的數(shù)量，解除免疫抑制，有利于免