2025年pcr試題庫(kù)及答案一、單項(xiàng)選擇題（每題2分，共30題）1.PCR技術(shù)中，DNA雙鏈解鏈的關(guān)鍵步驟是：A.退火（復(fù)性）B.延伸C.變性D.引物結(jié)合答案：C2.以下哪種酶是PCR反應(yīng)的核心酶？A.逆轉(zhuǎn)錄酶B.TaqDNA聚合酶C.限制性內(nèi)切酶D.DNA連接酶答案：B3.標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中，變性步驟的溫度通常設(shè)定為：A.55-65℃B.72℃C.94-98℃D.37℃答案：C4.引物設(shè)計(jì)時(shí)，為避免引物二聚體形成，應(yīng)重點(diǎn)控制：A.引物長(zhǎng)度B.引物GC含量C.引物3’端互補(bǔ)性D.引物5’端修飾答案：C5.熒光定量PCR（qPCR）中，SYBRGreenⅠ染料的作用是：A.標(biāo)記引物B.特異性結(jié)合雙鏈DNAC.提供熒光淬滅基團(tuán)D.增強(qiáng)Taq酶活性答案：B6.多重PCR的主要優(yōu)勢(shì)是：A.提高擴(kuò)增效率B.同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)C.降低引物二聚體風(fēng)險(xiǎn)D.減少dNTP消耗答案：B7.巢式PCR設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是：A.使用兩對(duì)引物（外引物和內(nèi)引物）B.增加循環(huán)次數(shù)C.提高變性溫度D.降低Mg2+濃度答案：A8.PCR反應(yīng)體系中，dNTPs的主要作用是：A.提供反應(yīng)緩沖環(huán)境B.作為DNA合成的原料C.激活Taq酶活性D.穩(wěn)定引物結(jié)構(gòu)答案：B9.以下哪種情況會(huì)導(dǎo)致PCR產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增？A.引物濃度過(guò)低B.Mg2+濃度過(guò)高C.退火溫度過(guò)高D.循環(huán)次數(shù)過(guò)少答案：B10.數(shù)字PCR（dPCR）與qPCR的主要區(qū)別是：A.dPCR不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線B.qPCR靈敏度更高C.dPCR使用熒光探針D.qPCR基于終點(diǎn)定量答案：A11.PCR反應(yīng)中，延伸步驟的溫度通常設(shè)定為：A.94℃B.55℃C.72℃D.37℃答案：C12.引物的熔解溫度（Tm值）計(jì)算公式為：Tm=4（G+C）+2（A+T），適用于：A.長(zhǎng)度<20nt的引物B.長(zhǎng)度>50nt的引物C.所有長(zhǎng)度的引物D.僅RNA引物答案：A13.為避免PCR污染，實(shí)驗(yàn)中使用UNG酶（尿嘧啶N-糖基化酶）的主要目的是：A.降解引物二聚體B.消化dUTP標(biāo)記的舊擴(kuò)增產(chǎn)物C.增強(qiáng)Taq酶活性D.提高模板純度答案：B14.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的關(guān)鍵步驟是：A.將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNAB.直接擴(kuò)增RNA模板C.提高變性溫度D.減少引物用量答案：A15.以下哪種物質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)？A.牛血清白蛋白（BSA）B.乙二胺四乙酸（EDTA）C.二甲基亞砜（DMSO）D.甘油答案：B16.熒光定量PCR中，Ct值（循環(huán)閾值）的定義是：A.熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)B.擴(kuò)增產(chǎn)物量最大的循環(huán)數(shù)C.引物完全消耗的循環(huán)數(shù)D.熒光信號(hào)開始下降的循環(huán)數(shù)答案：A17.降落PCR（TouchdownPCR）的主要目的是：A.提高擴(kuò)增特異性B.縮短反應(yīng)時(shí)間C.減少dNTP消耗D.降低變性溫度答案：A18.PCR反應(yīng)體系中，模板DNA的最佳濃度范圍通常為：A.0.1-1ng/μLB.10-100ng/μLC.1-5μg/μLD.0.01-0.1pg/μL答案：A19.以下關(guān)于HotStartPCR的描述，錯(cuò)誤的是：A.通過(guò)化學(xué)修飾或抗體封閉Taq酶活性B.減少低溫下非特異性引物結(jié)合C.需在變性步驟中激活酶活性D.無(wú)需優(yōu)化退火溫度答案：D20.微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）中，反應(yīng)體系被分割為數(shù)千個(gè)微滴的主要目的是：A.提高擴(kuò)增速度B.實(shí)現(xiàn)單分子水平絕對(duì)定量C.減少引物二聚體D.降低熒光背景答案：B21.PCR產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)“smearedband（條帶彌散）”，最可能的原因是：A.模板濃度過(guò)低B.引物特異性過(guò)高C.循環(huán)次數(shù)過(guò)多D.退火溫度過(guò)高答案：C22.設(shè)計(jì)定量PCR引物時(shí)，通常要求擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為：A.50-200bpB.500-1000bpC.1000-2000bpD.2000-5000bp答案：A23.以下哪種PCR技術(shù)可用于檢測(cè)基因拷貝數(shù)變異？A.多重PCRB.實(shí)時(shí)熒光定量PCRC.巢式PCRD.逆轉(zhuǎn)錄PCR答案：B24.PCR反應(yīng)中，Mg2+濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致：A.引物結(jié)合特異性降低B.Taq酶失活C.模板降解D.dNTP沉淀答案：A25.為驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性，最可靠的方法是：A.電泳觀察條帶大小B.測(cè)序分析C.熒光定量檢測(cè)D.酶切驗(yàn)證答案：B26.數(shù)字PCR的定量依據(jù)是：A.Ct值與模板濃度的線性關(guān)系B.陽(yáng)性微滴比例與模板濃度的泊松分布C.終點(diǎn)熒光強(qiáng)度D.擴(kuò)增效率答案：B27.以下哪種物質(zhì)可用于提高GC含量高的模板擴(kuò)增效率？A.氯化鉀（KCl）B.甜菜堿（Betaine）C.氯化鈉（NaCl）D.硫酸鎂（MgSO4）答案：B28.逆轉(zhuǎn)錄PCR中，使用oligo(dT)引物的優(yōu)點(diǎn)是：A.特異性擴(kuò)增mRNAB.擴(kuò)增所有RNA（包括rRNA、tRNA）C.提高cDNA合成效率D.減少基因組DNA污染答案：A29.PCR實(shí)驗(yàn)中，“假陰性”結(jié)果最可能的原因是：A.模板中存在PCR抑制劑B.引物濃度過(guò)高C.Mg2+濃度過(guò)高D.循環(huán)次數(shù)過(guò)多答案：A30.多重PCR設(shè)計(jì)時(shí)，引物之間的Tm值差異應(yīng)控制在：A.<2℃B.5-10℃C.10-15℃D.>15℃答案：A二、多項(xiàng)選擇題（每題3分，共15題）1.PCR反應(yīng)體系的基本組成包括：A.模板DNAB.引物C.TaqDNA聚合酶D.dNTPsE.熒光探針（可選）答案：ABCDE2.影響PCR擴(kuò)增效率的因素包括：A.引物設(shè)計(jì)B.Mg2+濃度C.退火溫度D.模板純度E.循環(huán)次數(shù)答案：ABCDE3.熒光定量PCR的常用方法包括：A.SYBRGreenⅠ染料法B.TaqMan探針法C.分子信標(biāo)（MolecularBeacon）D.鎖核酸探針（LNA）E.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）答案：ABCD4.引物設(shè)計(jì)的基本原則包括：A.避免3’端互補(bǔ)B.GC含量40%-60%C.長(zhǎng)度18-25ntD.避免連續(xù)重復(fù)堿基E.5’端可添加酶切位點(diǎn)答案：ABCDE5.PCR污染的主要來(lái)源有：A.實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的氣溶膠B.上一輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物C.模板DNA中的交叉污染D.試劑配制時(shí)的操作污染E.引物自身二聚體答案：ABCD6.數(shù)字PCR的優(yōu)勢(shì)包括：A.無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線B.絕對(duì)定量C.抗抑制劑能力強(qiáng)D.靈敏度高于qPCRE.可檢測(cè)低豐度突變答案：ABCDE7.以下哪些措施可提高PCR特異性？A.使用HotStartTaq酶B.優(yōu)化退火溫度（提高1-2℃）C.降低引物濃度D.減少循環(huán)次數(shù)E.添加BSA答案：ABCD8.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）的關(guān)鍵步驟包括：A.RNA提?。ū苊饨到猓〣.去除基因組DNA污染（如用DNaseⅠ處理）C.選擇合適的逆轉(zhuǎn)錄引物（oligo(dT)、隨機(jī)引物或特異性引物）D.優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件（溫度、時(shí)間）E.PCR擴(kuò)增時(shí)使用高保真酶答案：ABCD9.多重PCR失敗的常見原因有：A.引物之間存在交叉反應(yīng)B.不同靶標(biāo)擴(kuò)增效率差異大C.Mg2+濃度不適用于所有引物對(duì)D.模板濃度過(guò)高或過(guò)低E.循環(huán)次數(shù)不足答案：ABCDE10.PCR產(chǎn)物無(wú)擴(kuò)增條帶的可能原因包括：A.模板降解或濃度過(guò)低B.引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤（如結(jié)合位點(diǎn)突變）C.Taq酶失活D.dNTPs失效E.退火溫度過(guò)高答案：ABCDE11.熒光定量PCR中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的作用是：A.確定擴(kuò)增效率B.計(jì)算未知樣品的模板濃度C.驗(yàn)證引物特異性D.評(píng)估反應(yīng)體系穩(wěn)定性E.排除污染答案：ABD12.以下關(guān)于TaqMan探針的描述，正確的是：A.5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)B.探針需與引物結(jié)合位點(diǎn)重疊C.擴(kuò)增時(shí)被Taq酶的5’→3’外切酶活性切割D.特異性高于SYBRGreenⅠ法E.適用于多重PCR答案：ACDE13.PCR實(shí)驗(yàn)中，使用dUTP替代dTTP的目的是：A.提高擴(kuò)增效率B.配合UNG酶降解舊產(chǎn)物，防止污染C.降低引物二聚體風(fēng)險(xiǎn)D.適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)E.增強(qiáng)產(chǎn)物穩(wěn)定性答案：B14.巢式PCR的優(yōu)勢(shì)包括：A.提高靈敏度（檢測(cè)低豐度模板）B.增強(qiáng)特異性（減少非特異性擴(kuò)增）C.無(wú)需優(yōu)化第一輪PCR條件D.適用于模板降解嚴(yán)重的樣本E.縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間答案：ABD15.以下哪些物質(zhì)可作為PCR反應(yīng)的添加劑？A.DMSO（二甲基亞砜）B.甘油C.甜菜堿D.BSA（牛血清白蛋白）E.吐溫-20（Tween-20）答案：ABCDE三、簡(jiǎn)答題（每題8分，共10題）1.簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的基本原理及三步法的具體溫度和作用。答案：PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）基于DNA半保留復(fù)制原理，通過(guò)高溫變性、低溫退火、適溫延伸的循環(huán)過(guò)程，體外擴(kuò)增特定DNA片段。三步法具體為：（1）變性（94-98℃）：雙鏈DNA解鏈為單鏈；（2）退火（55-65℃）：引物與單鏈模板特異性結(jié)合；（3）延伸（72℃）：Taq酶以dNTPs為原料，從引物3’端延伸合成新鏈。2.引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵參數(shù)有哪些？請(qǐng)列舉5項(xiàng)并說(shuō)明其意義。答案：（1）長(zhǎng)度（18-25nt）：過(guò)短特異性低，過(guò)長(zhǎng)擴(kuò)增效率低；（2）GC含量（40%-60%）：過(guò)高易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，過(guò)低結(jié)合不穩(wěn)定；（3）Tm值（55-65℃）：引物與模板結(jié)合的熔解溫度，需與退火溫度匹配；（4）3’端序列（避免互補(bǔ)、連續(xù)G/C）：防止引物二聚體或錯(cuò)配；（5）特異性（BLAST比對(duì)）：確保引物僅結(jié)合目標(biāo)區(qū)域，避免非特異性擴(kuò)增。3.熒光定量PCR中，Ct值的定義是什么？其與模板初始濃度的關(guān)系如何？答案：Ct值（循環(huán)閾值）是熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。在指數(shù)擴(kuò)增期，Ct值與模板初始濃度的對(duì)數(shù)呈線性負(fù)相關(guān)（模板濃度越高，Ct值越?。?，這是qPCR定量的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)。4.簡(jiǎn)述PCR污染的主要來(lái)源及防控措施。答案：污染來(lái)源：（1）氣溶膠（擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)散）；（2）交叉污染（模板、試劑混用）；（3）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境殘留（如儀器、臺(tái)面）。防控措施：（1）分區(qū)操作（試劑準(zhǔn)備區(qū)、模板處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)）；（2）使用UNG酶+dUTP體系降解舊產(chǎn)物；（3）專用器材（移液器、離心管）；（4）紫外照射或化學(xué)消毒（如次氯酸鈉）；（5）設(shè)立陰性對(duì)照。5.巢式PCR的原理是什么？與普通PCR相比有何優(yōu)勢(shì)？答案：巢式PCR使用兩對(duì)引物（外引物和內(nèi)引物），外引物先擴(kuò)增較長(zhǎng)片段，內(nèi)引物以第一輪產(chǎn)物為模板擴(kuò)增更短的目標(biāo)區(qū)域。優(yōu)勢(shì)：（1）提高靈敏度（低豐度模板經(jīng)兩輪擴(kuò)增富集）；（2）增強(qiáng)特異性（兩輪引物雙重篩選，減少非特異性產(chǎn)物）；（3）適用于模板降解或復(fù)雜樣本（如臨床標(biāo)本）。6.數(shù)字PCR（dPCR）與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）的主要區(qū)別有哪些？答案：（1）定量方式：dPCR基于泊松分布絕對(duì)定量，qPCR依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量；（2）靈敏度：dPCR可檢測(cè)單分子，qPCR受限于Ct值線性范圍；（3）抗干擾性：dPCR分割反應(yīng)體系，降低抑制劑影響；（4）數(shù)據(jù)解讀：dPCR結(jié)果為陽(yáng)性微滴比例，qPCR為Ct值；（5）應(yīng)用場(chǎng)景：dPCR適合低豐度突變、拷貝數(shù)變異，qPCR適合常規(guī)相對(duì)定量。7.PCR實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增（多條條帶），可能的原因及解決方法有哪些？答案：可能原因：（1）引物特異性差（錯(cuò)配）；（2）Mg2+濃度過(guò)高；（3）退火溫度過(guò)低；（4）循環(huán)次數(shù)過(guò)多；（5）模板濃度過(guò)高。解決方法：（1）重新設(shè)計(jì)引物（BLAST比對(duì)）；（2）降低Mg2+濃度（0.5-2.5mM）；（3）提高退火溫度（1-2℃梯度優(yōu)化）；（4）減少循環(huán)次數(shù)（25-35次）；（5）稀釋模板（10-100倍）。8.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）中，如何避免基因組DNA污染對(duì)結(jié)果的干擾？答案：（1）RNA提取時(shí)使用DNaseⅠ處理（消化基因組DNA）；（2）設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的引物（擴(kuò)增cDNA時(shí)跳過(guò)基因組DNA的內(nèi)含子區(qū)域）；（3）設(shè)立無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶的陰性對(duì)照（排除基因組DNA擴(kuò)增）；（4）選擇oligo(dT)或特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（僅擴(kuò)增mRNA，避免rRNA、tRNA干擾）。9.簡(jiǎn)述SYBRGreenⅠ染料法熒光定量PCR的優(yōu)缺點(diǎn)。答案：優(yōu)點(diǎn)：（1）成本低（無(wú)需探針）；（2）操作簡(jiǎn)單（僅需引物）；（3）適用于未知基因的定量。缺點(diǎn)：（1）特異性較低（可能結(jié)合非特異性產(chǎn)物）；（2）需通過(guò)熔解曲線驗(yàn)證產(chǎn)物單一性；（3）對(duì)引物設(shè)計(jì)要求高（避免二聚體或非特異性擴(kuò)增）。10.PCR反應(yīng)中，TaqDNA聚合酶的主要特性有哪些？答案：（1）熱穩(wěn)定性：可耐受94℃以上高溫（半衰期>2小時(shí)）；（2）5’→3’聚合酶活性：催化dNTPs延伸合成DNA；（3）5’→3’外切酶活性（部分Taq酶）：可切割探針（如TaqMan法）；（4）無(wú)3’→5’校正活性：擴(kuò)增錯(cuò)誤率較高（約1×10-4）；（5）依賴Mg2+：需Mg2+激活酶活性（最適濃度1.5-2.5mM）。四、案例分析題（每題15分，共2題）1.某實(shí)驗(yàn)室使用自行設(shè)計(jì)的引物對(duì)臨床樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目標(biāo)片段長(zhǎng)度為300bp，但電泳結(jié)果顯示：（1）陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)清晰條帶；（2）部分樣本無(wú)條帶；（3）部分樣本出現(xiàn)多條彌散條帶。請(qǐng)分析可能原因及解決措施。答案：可能原因及解決措施：（1）樣本無(wú)條帶：①模板降解（如樣本保存不當(dāng)）：優(yōu)化樣本保存條件（-80℃凍存），提取RNA/DNA時(shí)檢測(cè)濃度（OD260/280=1.8-2.0）；②模板中存在抑制劑（如血液中的血紅蛋白、組織中的酚類物質(zhì)）：增加純化步驟（柱純化或磁珠法），添加BSA（0.1-0.5mg/mL）中和抑制劑；③引物結(jié)合位點(diǎn)突變（臨床樣本基因變異）：通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證引物結(jié)合區(qū)域，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物或重新設(shè)計(jì)引