《靈芝多糖和三萜類化合物抗腫瘤協(xié)同功效評(píng)價(jià)方法》編制說明一、工作簡(jiǎn)況1、任務(wù)來源根據(jù)2024年全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化工作要點(diǎn)，加強(qiáng)質(zhì)量支撐和標(biāo)準(zhǔn)引領(lǐng)，深入推進(jìn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展綱要各項(xiàng)重點(diǎn)任務(wù)實(shí)施，以標(biāo)準(zhǔn)有力引領(lǐng)現(xiàn)代化產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)，推動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)化更好服務(wù)經(jīng)濟(jì)社會(huì)高質(zhì)量發(fā)展。依據(jù)《中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法和《團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)管理規(guī)定》（國(guó)標(biāo)委聯(lián)[2019]1號(hào)）的相關(guān)要求，中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)立項(xiàng)并聯(lián)合相關(guān)單位共同制定《靈芝多糖和三萜類化合物抗腫瘤協(xié)同功效評(píng)價(jià)方法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)。2、項(xiàng)目背景靈芝作為傳統(tǒng)名貴中藥材，在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，靈芝多糖和三萜類化合物是其主要活性成分，二者在抗腫瘤方面展現(xiàn)出顯著效果。眾多研究證實(shí)，靈芝多糖可通過激活免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，間接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；三萜類化合物則能直接作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡、抑制腫瘤血管生成等。更為關(guān)鍵的是，越來越多的實(shí)驗(yàn)表明，靈芝多糖和三萜類化合物在抗腫瘤過程中存在協(xié)同作用，二者聯(lián)合使用能發(fā)揮比單一成分更強(qiáng)大的抗腫瘤功效。當(dāng)前，隨著人們對(duì)健康的重視以及對(duì)天然抗腫瘤藥物需求的增加，靈芝相關(guān)產(chǎn)品市場(chǎng)發(fā)展迅速。然而，由于缺乏統(tǒng)一的靈芝多糖和三萜類化合物抗腫瘤協(xié)同功效評(píng)價(jià)方法標(biāo)準(zhǔn)，市場(chǎng)上的靈芝產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，相關(guān)研究結(jié)果也缺乏可比性。這不僅誤導(dǎo)了消費(fèi)者，阻礙了靈芝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，也給科研工作帶來諸多不便。在此背景下，制定一套科學(xué)、規(guī)范、統(tǒng)一的靈芝多糖和三萜類化合物抗腫瘤協(xié)同功效評(píng)價(jià)方法標(biāo)準(zhǔn)，明確實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、檢測(cè)指標(biāo)、數(shù)據(jù)分析等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的具體要求，為靈芝相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)量控制以及科研工作提供標(biāo)準(zhǔn)化的操作指南，確保評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可比性。通過統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，能夠有效甄別市場(chǎng)上靈芝產(chǎn)品的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，打擊不良商家以次充好、虛假宣傳等行為，維護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益，促進(jìn)靈芝產(chǎn)品市場(chǎng)的健康、有序發(fā)展。目前靈芝產(chǎn)品種類繁多，包括靈芝子實(shí)體、靈芝孢子粉、靈芝提取物等各類劑型。但由于缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品中靈芝多糖和三萜類化合物的含量及比例差異較大，其抗腫瘤協(xié)同功效難以保證。制定標(biāo)準(zhǔn)可從源頭把控產(chǎn)品質(zhì)量，確保消費(fèi)者使用到有效、安全的靈芝產(chǎn)品。主要工作過程3.1標(biāo)準(zhǔn)研制階段2025年6～7月，起草組通過企業(yè)調(diào)研，了解企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)情況，并組織收集、整理相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化資料、專業(yè)文獻(xiàn)等，經(jīng)成分分析、研討、論證后編寫完成《靈芝多糖和三萜類化合物抗腫瘤協(xié)同功效評(píng)價(jià)方法》立項(xiàng)申請(qǐng)書及標(biāo)準(zhǔn)框架相關(guān)內(nèi)容，并向中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)提出標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)申請(qǐng)。3.2標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)階段2025年8月15日，中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)組織召開《靈芝多糖和三萜類化合物抗腫瘤協(xié)同功效評(píng)價(jià)方法》標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)會(huì)議，會(huì)議對(duì)標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)目的、意義以及標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行了論證，一致同意通過該標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)。2025年8月18日，中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)正式發(fā)布了《靈芝多糖和三萜類化合物抗腫瘤協(xié)同功效評(píng)價(jià)方法》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)通知，并在全國(guó)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)信息平臺(tái)進(jìn)行公示。3.3起草階段2025年9～11月，依據(jù)《中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法》、《國(guó)務(wù)院關(guān)于深化標(biāo)準(zhǔn)化工作改革方案》等文件的要求，按照?qǐng)F(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的制修訂程序組織有關(guān)技術(shù)人員成立標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，通過相關(guān)信息化手段進(jìn)行多次內(nèi)容討論和交流，并向相關(guān)單位和專家咨詢，在廣泛聽取各方意見和充分論證的基礎(chǔ)上，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)初稿進(jìn)行了完善和修改后經(jīng)起草組確認(rèn)，同意作為征求意見稿，公開征求意見。3.4征求意見階段2025年12月，工作組將修改完善后的征求意見稿材料提交中國(guó)食品藥品企業(yè)質(zhì)量安全促進(jìn)會(huì)，等待掛網(wǎng)征求意見。二標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要內(nèi)容及其論據(jù)1、標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》的要求進(jìn)行編寫。與相關(guān)領(lǐng)域法律、法規(guī)和規(guī)章、國(guó)家與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等的兼容性和協(xié)調(diào)一致，符合國(guó)家和行業(yè)的有關(guān)方針、政策。標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容具有規(guī)范性、科學(xué)性、先進(jìn)性、合理性與可行性。適應(yīng)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需要，運(yùn)用統(tǒng)一、簡(jiǎn)化、協(xié)調(diào)、優(yōu)化的原則。兼顧各方利益，廣泛吸納各方意見和建議，協(xié)調(diào)處理好各方意見。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的技術(shù)要求應(yīng)便于實(shí)際實(shí)施，具有較強(qiáng)的可操作性。2、主要內(nèi)容及其依據(jù)2.1評(píng)價(jià)指標(biāo)細(xì)胞增殖抑制率：腫瘤細(xì)胞的異常增殖是腫瘤的重要特征之一，抑制腫瘤細(xì)胞增殖是評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物療效的關(guān)鍵指標(biāo)。若靈芝多糖和三萜類化合物能降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，則表明其具有一定的抗腫瘤作用，且二者聯(lián)合使用時(shí)若能產(chǎn)生更強(qiáng)的增殖抑制效果，可體現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤作用。MTT法是細(xì)胞增殖檢測(cè)的經(jīng)典方法，廣泛應(yīng)用于抗腫瘤藥物篩選與評(píng)價(jià)等研究中，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)采用該方法計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，以評(píng)價(jià)靈芝多糖和三萜類化合物的抗腫瘤協(xié)同作用。細(xì)胞凋亡率：誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的重要機(jī)制之一。靈芝多糖和三萜類化合物若能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可促使腫瘤細(xì)胞死亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。通過檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，能了解二者對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)而判斷其抗腫瘤作用及協(xié)同效應(yīng)。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻等特征，可準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、凋亡早期細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞，是細(xì)胞凋亡檢測(cè)的常用工具，相關(guān)操作流程和檢測(cè)方法在眾多腫瘤研究文獻(xiàn)中均有報(bào)道。細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力：腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤惡化和患者預(yù)后不良的重要因素。抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力是評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物療效的重要方面。通過檢測(cè)靈芝多糖和三萜類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，可全面評(píng)估其抗腫瘤作用。Transwell小室法是檢測(cè)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的經(jīng)典方法，通過在小室中設(shè)置基質(zhì)膠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，可觀察腫瘤細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的能力，該方法在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用。細(xì)胞周期分布：腫瘤細(xì)胞的增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān)，抗腫瘤藥物可通過影響細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞阻滯在特定時(shí)期，從而抑制細(xì)胞增殖。檢測(cè)靈芝多糖和三萜類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響，有助于明確其作用機(jī)制，判斷二者聯(lián)合使用是否能產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞周期阻滯作用，進(jìn)而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。利用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布是細(xì)胞周期研究的常用方法，可根據(jù)DNA含量的變化區(qū)分不同時(shí)期的細(xì)胞，該方法在腫瘤生物學(xué)研究中應(yīng)用普遍。腫瘤體積和抑瘤率：在動(dòng)物腫瘤模型中，腫瘤體積的變化是直觀反映腫瘤生長(zhǎng)情況的指標(biāo)，抑瘤率則能定量評(píng)估藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制程度。通過測(cè)量腫瘤體積和計(jì)算抑瘤率，可直接判斷靈芝多糖和三萜類化合物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，以及聯(lián)合用藥是否具有更好的抑瘤效果。此方法是動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)方法，在大量抗腫瘤藥物研發(fā)和藥效學(xué)評(píng)價(jià)研究中均有應(yīng)用，操作規(guī)范且結(jié)果可靠。免疫功能相關(guān)指標(biāo)（細(xì)胞因子、免疫器官指數(shù)）：機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-2、TNF-α等參與免疫調(diào)節(jié)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。脾臟和胸腺是重要的免疫器官，其重量變化可反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)。靈芝多糖和三萜類化合物可能通過調(diào)節(jié)免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用，檢測(cè)這些指標(biāo)有助于了解其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及抗腫瘤協(xié)同作用。細(xì)胞因子檢測(cè)通常采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法，有商業(yè)化的檢測(cè)試劑盒，操作方便、特異性強(qiáng)。免疫器官指數(shù)通過計(jì)算免疫器官重量與體重的比值獲得，是評(píng)估機(jī)體免疫功能的常用指標(biāo)，在免疫相關(guān)研究中廣泛使用。組織病理學(xué)觀察：通過對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理切片觀察，可從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度直觀了解腫瘤組織的變化，如細(xì)胞排列、核形態(tài)、核分裂象及壞死區(qū)域等，有助于判斷靈芝多糖和三萜類化合物對(duì)腫瘤組織的影響，為其抗腫瘤作用機(jī)制提供形態(tài)學(xué)依據(jù)，同時(shí)可觀察聯(lián)合用藥是否產(chǎn)生更明顯的病理改變，體現(xiàn)協(xié)同作用。HE染色是組織病理學(xué)觀察的經(jīng)典方法，可清晰顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織形態(tài)，廣泛應(yīng)用于腫瘤病理診斷和藥物療效評(píng)估等研究中，具有成熟的操作流程和判斷標(biāo)準(zhǔn)。。2.2評(píng)價(jià)方法細(xì)胞試驗(yàn)：選用符合GB/T29344要求的靈芝子實(shí)體，樣品來源清晰可追溯。采用水提醇沉法，制備靈芝多糖；采用醇提萃取法，制備靈芝三萜類化合物作為樣品，選用人源性腫瘤細(xì)胞系如MCF-7、HCT116等，配制不同濃度的靈芝多糖、三萜類化合物溶液及二者聯(lián)合溶液，分別設(shè)置空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、靈芝多糖單獨(dú)處理組、三萜類化合物單獨(dú)處理組和聯(lián)合處理組。通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例和細(xì)胞周期分布，借助Transwell小室和倒置顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。動(dòng)物試驗(yàn)：選用SPF級(jí)BALB/c裸鼠或C57BL/6小鼠，構(gòu)建腫瘤模型后，分為陽性對(duì)照組、模型對(duì)照組、靈芝多糖單獨(dú)處理組、三萜類化合物單獨(dú)處理組和聯(lián)合處理組。通過測(cè)量腫瘤體積和重量計(jì)算抑瘤率來評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)情況，采用眼眶靜脈叢采血法檢測(cè)細(xì)胞因子以評(píng)估免疫功能，通過測(cè)定脾臟和胸腺重量計(jì)算免疫器官指數(shù)，還通過對(duì)腫瘤組織進(jìn)行HE染色和顯微鏡觀察來進(jìn)行組織病理學(xué)分析。試驗(yàn)材料中對(duì)試劑和儀器的規(guī)格要求，如蒸餾水符合GB/T6682中一級(jí)水的要求，CO?培養(yǎng)箱的溫度和CO?濃度控制精度等，來源于相關(guān)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或儀器設(shè)備的常規(guī)技術(shù)指標(biāo)要求。細(xì)胞培養(yǎng)條件、溶液配制方法、實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置以及指標(biāo)檢測(cè)方法等，來源于《靈芝三萜與靈芝多糖抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展》，該文獻(xiàn)發(fā)表于《中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志》，對(duì)相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行了綜述。MTT法：參考《中華人民共和國(guó)藥典》中MTT法。AnnexinV/PI、細(xì)胞周期：參考CLSI指南H42-A2《FlowCytometricEnumerationofImmunologicallyDefinedCellPopulations》。Transwell侵襲：參考AlbiniA等,1987,CancerResearch經(jīng)典Matrigel侵襲模型，基質(zhì)膠稀釋比例1:8為文獻(xiàn)常用優(yōu)化值。動(dòng)物級(jí)別、飼養(yǎng)環(huán)境：GB14925《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》屏障系統(tǒng)要求。腫瘤接種量1×10?cells/0.2mL：參考NCI推薦皮下移植瘤常規(guī)接種量（1-10×10?）。環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照20mg/kgq2di.p.：參考《抗腫瘤藥物藥效學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（CFDA2012）。劑量設(shè)計(jì)：依據(jù)前期急性毒性LD?和MTD實(shí)驗(yàn)，按體表面積換算等效劑量參考FDA2005年發(fā)布的《EstimatingtheMaximumSafeStartingDoseinInitialClinicalTrialsforTherapeuticsinAdultHealthyVolunteers》中推薦的體表面積換算方法進(jìn)行種間劑量折算。腫瘤體積計(jì)算公式：Tomayko,M.M.,&Reynolds,C.P.(1989).Determinationofsubcutaneoustumorsizeinathymic(nude)mice.CancerChemotherapyandPharmacology,*24*(3),148-154.免疫器官指數(shù)：參考《保健食品功能評(píng)價(jià)程序與檢驗(yàn)方法規(guī)范》（國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局2021版）中“免疫調(diào)節(jié)功能評(píng)價(jià)”。血清細(xì)胞因子ELISA：遵循試劑盒說明書，引用CLSIEP05-A3（定量測(cè)量程序精密度評(píng)估）作為檢測(cè)操作和數(shù)據(jù)精密度的標(biāo)準(zhǔn)化依據(jù)。三、預(yù)期達(dá)到的社會(huì)效益、對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的作用及解決的主要問題等情況癌癥嚴(yán)重威脅人類健康，靈芝多糖和三萜類化合物在抗腫瘤方面的潛在作用備受關(guān)注。當(dāng)前靈芝產(chǎn)品市場(chǎng)存在諸多問題，如產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊、功效宣傳混亂等。本團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)明確了靈芝多糖和三萜類化合物抗腫瘤協(xié)同功效的評(píng)價(jià)方法，企業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)品時(shí)需遵循標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行功效驗(yàn)證和質(zhì)量控制。這促使企業(yè)注重產(chǎn)品研發(fā)與質(zhì)量提升，通過科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明產(chǎn)品功效，淘汰劣質(zhì)產(chǎn)品和虛假宣傳企業(yè)，凈化市場(chǎng)環(huán)境，引導(dǎo)產(chǎn)業(yè)向規(guī)范化、科學(xué)化方向發(fā)展，提升整個(gè)靈芝產(chǎn)業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和信譽(yù)度。此前，不同研究機(jī)構(gòu)、企業(yè)對(duì)靈芝多糖和三萜類化合物抗腫瘤協(xié)同功效的評(píng)價(jià)方法差異大，導(dǎo)致結(jié)果缺乏可比性。如細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)條件、藥物濃度設(shè)置無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇、給藥方案及觀察指標(biāo)不同。通過制定該標(biāo)準(zhǔn)，詳細(xì)規(guī)定體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞增殖抑制、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期檢測(cè)等）和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（腫瘤生長(zhǎng)抑制、免疫功能調(diào)節(jié)、組織病理學(xué)觀察等）各環(huán)節(jié)操作流程、指標(biāo)檢測(cè)方法及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，使評(píng)價(jià)結(jié)果更科學(xué)、可靠且可比。同時(shí)規(guī)范其抗腫瘤協(xié)同功效的評(píng)價(jià)流程，為科研、醫(yī)療及產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。這有助于公眾更準(zhǔn)確了解靈芝相關(guān)產(chǎn)品的真實(shí)功效，避免被不實(shí)宣傳誤導(dǎo)，合