廠QC

閆占寬你真的了解微生物嗎年終總結(jié)你真的了解微生物嗎分布不均勻，無處不在，微小不可見，耐受力強(qiáng)微生物很脆弱古細(xì)菌：常生活于熱泉水、缺氧湖底、鹽水湖等極端環(huán)境中的原核生物?，F(xiàn)今最古老的生物群，為地球原始大氣缺氧時(shí)代生存下來的活化石。MDD的困擾微生物標(biāo)準(zhǔn)制定一些考慮PMM的一些建議 微生物特點(diǎn)、影響生長繁殖因素 產(chǎn)品召回中的微生物分析

醫(yī)藥方面相關(guān)微生物微生物特性、影響生長繁殖因素

種類多、分布廣

個(gè)體小，胃口大

繁殖快、轉(zhuǎn)化快

適應(yīng)強(qiáng)、易變異

人體微生物分布種類更衣順序手掌的微生物培養(yǎng)結(jié)果：手掌的微生物培養(yǎng)結(jié)果洗手后一根頭發(fā)的微生物培養(yǎng)結(jié)果消毒后人體微生物分布種類1014活的微生物，是人的一部分。其中皮膚有1012,口腔有1010,腸道1014.皮膚：表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、科室葡萄球菌、棒狀桿菌屬、丙酸桿菌、痤瘡桿菌、微球菌屬?？谇唬和僖烘溓蚓?，血液鏈球菌。毛發(fā)：毛癬菌屬、表皮癬菌屬、小孢子菌屬。腸道：腸桿菌包括腸桿菌屬,埃希菌菌屬，乳酸桿菌，雙歧桿菌，糞桿菌屬，梭菌毛癬菌屬表皮癬菌屬小孢子菌屬腸桿菌屬埃希菌菌屬乳酸桿菌雙歧桿菌糞桿菌屬梭菌唾液鏈球菌血液鏈球菌表皮葡萄球菌頭狀葡萄球菌科氏葡萄球菌棒狀桿菌屬丙酸桿菌痤瘡桿菌微球菌屬口腔皮膚腸道毛發(fā)微生物在空氣中的分布空氣本身缺乏微生物生活所必需的營養(yǎng)物，日光對微生物也具有很強(qiáng)的殺菌作用，空氣般是干燥的，因此空氣不是微生物生活的良（芽孢）空氣中的微生物主要來源于帶有微生物菌體及孢子的灰塵，這類微生物大人和動物通過呼吸道排出的，其中也包含有病原微生物，懸浮在大氣中。

空氣中存在較多的、存活時(shí)間較長的是各種真菌、放線菌的孢子及細(xì)菌芽胞。如果潔凈區(qū)環(huán)境空氣中檢測出來的絕大部分是G+球菌，和普通空氣中的分布是不同的，顯然是人員散發(fā)出來的。微生物特性、影響生長繁殖因素

種類多、分布廣

個(gè)體小，胃口大

繁殖快、轉(zhuǎn)化快

適應(yīng)強(qiáng)、易變異

細(xì)菌的大小圖微生物特性、影響生長繁殖因素

種類多、分布廣

個(gè)體小，胃口大

繁殖快、轉(zhuǎn)化快

適應(yīng)強(qiáng)、易變異

1、原輔料檢測時(shí)間長，導(dǎo)致的采購、生產(chǎn)壓力；2、成品延長放行周期，增加了庫存成本和市場銷售壓力。3、許多非無菌藥品的微生物污染可能性很低，因此測試的價(jià)值不大。為什么想要減少微生物限度測試?水分活性:水分活性是對游離水的測定，不包括對結(jié)合水。降低水分活性對微生物生長的作用：較長的停滯期、較慢的生長速度、較少的穩(wěn)定期的微生物數(shù)量，減少微生物毒素的產(chǎn)生在某個(gè)微生物專有的水分活性以下，該微生物不會生長水分活性下降后，微生物的耐熱性會提高不在低水分活性的產(chǎn)品中增殖，但會存活在產(chǎn)品中水分活性

(Aw)微生物0.97銅綠假單胞菌0.95大腸埃希菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌0.90枯草芽孢桿菌0.86金黃色葡萄球菌0.75嗜鹽菌桿

固體原0.90啤酒酵母

輔料0.77黑曲霉菌（巴西曲霉）（較嗜高溫）0.62魯氏接合酵母

(嗜高滲壓酵母)

0.61嗜干酵母

。USP

<1112>產(chǎn)品水分活度最可能的污建議的測試鼻腔吸入劑0.99革蘭氏陰性菌TAMC，TCYMC，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞洗發(fā)香波0.99革蘭氏陰性菌TAMC，TCYMC，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌抗酸劑0.99革蘭氏陰性菌TAMC，TCYMC，大腸埃希菌，沙門氏菌局部乳劑0.97革蘭氏陰性菌TAMC，TCYMC，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌口服液0.90革蘭氏陽性菌及真菌TAMC，TCYMC口服混懸劑0.87真菌TAMC，TCYMC局部膏劑0.55無減少測試唇用軟膏0.36無減少測試陰道/直腸栓劑0.30無減少測試片劑0.36無減少測試充液膠囊0.30無減少測試USP

<1112>《藥品GMP指南：質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室與物料管理》制劑成品A：檢驗(yàn)數(shù)據(jù)不足以證明其風(fēng)險(xiǎn)水平的產(chǎn)品。新的產(chǎn)品及配方或生產(chǎn)過程發(fā)生重大變化的產(chǎn)品。生產(chǎn)過五批之后，再按照下面B類（高風(fēng)險(xiǎn)）或C類（低風(fēng)險(xiǎn)）來進(jìn)行分類。B：高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品。所有微生物結(jié)果超標(biāo)的產(chǎn)品。C：低風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)品。至少最近五批沒有發(fā)生微生物結(jié)果超標(biāo)。產(chǎn)品類型檢驗(yàn)頻次放行的可行性A頭五批微生物檢查結(jié)果必需為批發(fā)放依據(jù)B每一批或每一階段微生物檢查結(jié)果必需為批發(fā)放依據(jù)C每季度或每五批，取二者頻次最高微生物檢查結(jié)果不需為批發(fā)放依據(jù)產(chǎn)品類型標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)頻次1原料非常關(guān)鍵，要求強(qiáng)檢每批均檢2原料不關(guān)鍵每五批檢一次或每年檢一批3物料的種類及工藝過程決定其受污染的可能性很低無需檢驗(yàn)4新物料初始每批均檢，直至可以評估其風(fēng)險(xiǎn)水平并設(shè)定相應(yīng)檢驗(yàn)頻次原料第一類是藥典中要求強(qiáng)制檢驗(yàn)微生物的原料以及起始原料是植物、動物的原料。第二類（隨機(jī)取樣）在生產(chǎn)過程中經(jīng)過提取且可靠消毒的天然物質(zhì)及合成的物質(zhì)?？梢哉J(rèn)為是低風(fēng)險(xiǎn)類的（如硝酸）?！端幤稧MP指南：質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室與物料管理》否按照協(xié)調(diào)后藥典的附錄制訂微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)是否有科學(xué)證明減少步驟會造成在原輔料中微生物量＜認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)限度（未檢出常見指示菌）

？所監(jiān)控的微生物量/指示菌是否低于規(guī)定限度是抽批檢驗(yàn)微物和指示菌否微生物是否能在原料藥或賦形劑中生長或存活是原輔料/賦形劑的合成工藝相關(guān)步驟本身是否會減少微生物是是提供支持性數(shù)據(jù)，

不需要做微生物限度檢查及不必制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)判斷圖1

原料藥和賦形劑的微生物檢查否否提供支持性資料，

不需要做微生物限度檢查和不必制定認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)按照協(xié)調(diào)后藥典的各論制定微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)不需要進(jìn)一步做微生物限度檢查及不必制訂認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)ICHQ6A逐批檢驗(yàn)微物和指示菌原輔料或賦形劑是否無菌？是否<>進(jìn)行逐批微生物試驗(yàn)是否有科學(xué)依據(jù)證明制劑有抑制微生物生長的特性是不必制訂微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)，

也不必做該項(xiàng)檢查是否每批都符合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)水分活度否是提供科學(xué)依據(jù)可以不進(jìn)行常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)或抽批檢驗(yàn)微生物限度是藥物制劑中是否含有抗微生物防腐劑或本身是否含有抗微生物能力否否制劑是否為干劑型?(如：

固體口服制劑或干混懸劑)制定防腐劑（化學(xué)）

認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)和論證低于或等于制定的最小防腐劑濃度時(shí)是否有效，

并證明制劑本身抗微生物能力根據(jù)協(xié)調(diào)后藥典各論制訂微生物限度認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)判斷圖2非無菌制劑的微生物檢查是否否影響微生物生長繁殖的因素醫(yī)學(xué)微生物研究方面

接近人體溫度范圍的微生物溫度下能夠生長的微生物能感染人體。所以培養(yǎng)溫度的范圍內(nèi)。（這樣的溫度能培養(yǎng)出環(huán)境中的所有微生物？）G-細(xì)菌（可以生長℃的水中）存在于水中，并且是內(nèi)毒素的來源，所以也是研究對象。人體—心環(huán)境EM培養(yǎng)策略細(xì)菌形態(tài)球狀

桿狀弧形或螺旋形在活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，由單個(gè)菌體或聚集成團(tuán)的多個(gè)菌體在固體培養(yǎng)基上生長繁殖所形成的集落，稱為菌落形成單位，以其表達(dá)活菌的數(shù)量什么是一個(gè)CFUCFU，計(jì)數(shù)可以變多也可以變少金黃色葡萄球菌鏈球菌隨著微生物增加，擁擠現(xiàn)象會降低估計(jì)值（爭奪營養(yǎng)、空間）隨著微生物減少，隨機(jī)誤差影響越來越大，導(dǎo)致不準(zhǔn)確的估計(jì)一團(tuán)菌、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、微生物受損平皿計(jì)數(shù)上限

平皿計(jì)數(shù)下限計(jì)數(shù)范圍USP

<1227>1、標(biāo)準(zhǔn)瓊脂平皿上的可計(jì)數(shù)菌落的接受標(biāo)準(zhǔn)對大多數(shù)細(xì)菌和白色念珠菌是25至250。該范圍由食品工業(yè)在計(jì)數(shù)牛奶中的大腸細(xì)菌時(shí)建立2、對黑曲霉菌的建議計(jì)數(shù)范圍是8-80CFU/皿。3、環(huán)境中分離的微生物的計(jì)數(shù)范圍應(yīng)該經(jīng)過驗(yàn)證USP<55>

recommends

a

rangeof30to

300colonies,

but

not

lessthan

6

(50%

to

300%

recovery)ASTM

providescountablerangesof20-80CPU/membrane（膜）,20-200for

spread

plates（涂布）,and

30-300forpour

plates

（注皿）FDA

(BAM)

recommends25-250CPU/plateasacountable

rangeCited：Scott

Sutton,

Accuracy

of

Plate

Counts計(jì)數(shù)上限ASTM大于上限報(bào)告上限結(jié)果，如1:10稀釋，涂布計(jì)數(shù)210CFU，報(bào)告>2,000CFU/mL（無法計(jì)數(shù)）計(jì)數(shù)下限ASTM無菌落生長報(bào)告稀釋級別，有菌落生產(chǎn)但低于可計(jì)數(shù)范圍，報(bào)告估計(jì)值FDA

BAM所有的原始數(shù)據(jù)會被記錄，但是報(bào)告的時(shí)候只需要報(bào)告低于定量限，例如1:100，菌落是18、

12，則報(bào)告低于2500CFU。）平均值計(jì)算USP

andASTM

四舍五入BAM四舍六入五成雙計(jì)數(shù)上限/下限Cited：Scott

Sutton,

Accuracy

of

Plate

CountsG-細(xì)菌細(xì)胞壁薄，主

要成分是LPS，有致熱作用，是細(xì)菌內(nèi)毒素

有效成分。革蘭氏染色呈紅色G+細(xì)菌細(xì)胞壁厚，主

要成分是肽聚

糖，占細(xì)胞干重的50%~80%.革蘭氏染色呈

紫色細(xì)菌結(jié)構(gòu)（染色）天然內(nèi)毒素vs

LPS細(xì)菌生長周期無菌檢查14天，痤瘡桿菌生物指示劑培養(yǎng)時(shí)間酵母菌、霉菌典型的酵母是橢圓形，細(xì)胞壁主要是結(jié)構(gòu)性多糖，葡聚糖占細(xì)胞壁干重50%~60%，甘露糖占15%~23%。葡聚糖主要以β-1,6-葡聚糖、

β-1,3-葡聚糖（內(nèi)毒素檢驗(yàn)假陽性）、

β-1,3-β-1,6-葡聚糖和殼

多糖的混合物。（葡聚糖反應(yīng)激活步驟少，延滯期短，速率低）菌落形態(tài)：大，疏松，絨毛狀，絮狀，蜘蛛網(wǎng)狀，初期無色，后期產(chǎn)生孢子有顏色什么會向潔凈區(qū)引入霉菌霉菌菌落EM結(jié)果沒有霉菌，并不代表環(huán)境中真的沒有?？赡苁怯捎贓M程序中缺少真菌特異性的監(jiān)測。對真菌的警戒限缺乏真正的了解，最終導(dǎo)致污染。1、絲狀真菌更容易漂浮在空氣中而不是附著在表面上，這是它們主要的傳播途徑。2、室內(nèi)或廠房設(shè)備里面被絲狀真菌污染，通常認(rèn)為是曲霉屬。潔凈區(qū)，高枝孢菌和青霉菌常見，曲霉菌較少。3、

回收種類方面、回收數(shù)量方面，SDA最好。實(shí)際環(huán)境監(jiān)測，某些霉菌不能在SDA上生長，并不是說SDA不支持他們生長，可能是在潔凈區(qū)處于亞致死狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)室復(fù)增后，就能夠生長。一些在醫(yī)藥方面有價(jià)值的微生物微生物名稱特征藥用價(jià)值放線菌G+，絲狀桿菌抗生素生產(chǎn)

嗜熱脂肪芽孢桿菌G+,桿菌、需氧，產(chǎn)芽孢濕熱滅菌驗(yàn)證

枯草芽孢桿菌G+，桿菌，需氧，產(chǎn)芽孢濕熱滅菌驗(yàn)證、環(huán)氧乙烷滅菌驗(yàn)證短小芽孢桿菌G+，桿菌，需氧，產(chǎn)芽孢射線滅菌驗(yàn)證0.1um缺陷短波單胞菌G-，微需氧、桿菌0.22um濾芯截留實(shí)驗(yàn)

生孢梭菌G+，桿菌，厭氧，產(chǎn)芽孢確認(rèn)厭氧的生長條件大腸桿菌G-，腸桿菌，兼性厭氧生產(chǎn)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，防腐效力極限測試Julie

Schwedock，Brevundimonas

diminuta

isnot

always

sodiminutive

Growthconditionsaffectsize.（PMF）生物指示劑選擇廣泛存在于環(huán)境中，如水中，人畜的腸道、糞便中 ,所以把大腸埃希菌作為藥品有沒有受到污染的一種指標(biāo)菌幾乎所有的原輔料都需要檢測大腸埃希菌，若檢測出大腸埃希菌，說明藥品很有可能已經(jīng)被污染。大腸埃希菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到?？梢鹁植炕摳腥揪植坑脛刂平瘘S色葡萄球菌，成品、原輔料的控制策略均要檢測金黃色葡萄球菌，純化水也需要檢查金黃色葡萄球菌。G+陽性，耐高滲透壓，甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌金黃色

葡萄球菌在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見的細(xì)菌之一。

各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。經(jīng)常引起術(shù)后傷口感染

，也可引起褥瘡、膿腫、化膿性中

耳炎等對季銨鹽類消毒劑抗性很強(qiáng)，如新潔爾滅（熒光假單胞菌）溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌沙門氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患

病之一部分輔料要求檢查沙門氏菌。例如USP中，硬脂酸鎂就要求每10g樣品中不得檢出沙門氏菌(Ch.p未要求)。動物源類原輔料要檢測，例如膠囊沙門氏菌沙門氏菌非無菌產(chǎn)品（134批）產(chǎn)品召回1998~2006無菌產(chǎn)品(193批)G-細(xì)菌60%G+細(xì)菌4%霉菌酵母菌

23%缺乏無菌保障78%霉菌酵母菌

7%G-細(xì)菌6%G+細(xì)菌1%1998~2006FDA產(chǎn)品召回情況Cited

：LUIS

JIMENEZ

：Microbial

Diversity

in

Pharmaceutical

Product

Recalls

and

Environments

PDA2007洋蔥伯克霍爾德菌，假單胞菌屬、皮氏

羅爾斯頓氏菌占48%R2A培養(yǎng)基比營養(yǎng)瓊脂檢出多（菌落特點(diǎn)，小、透明、反光）有很多菌，在R2A也不能形成肉眼可見的菌落，熒光方法可以。還有很多菌，熒光法也不可以，但16sRNA可以（VBNC微生物）R2A培養(yǎng)基平皿計(jì)數(shù)如何操作？Milliflex?

Quantum–

Detection

of

Microbial

Contaminants

inWaterSamples無菌產(chǎn)品78%缺乏保證，6%G-細(xì)菌，1%G+細(xì)菌。洋蔥伯克霍爾德菌占比

2.2%。霉菌酵母菌占比7%，主要是青霉菌屬和曲霉菌屬。主要是人員操作，環(huán)境缺乏控制，或者設(shè)計(jì)缺陷有關(guān)。

（環(huán)境很少出現(xiàn)霉菌，霉菌召回比卻很高？）從1998到2006.09沒有召回是由于單獨(dú)G+細(xì)菌（人員皮膚如葡萄球菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌）污染造成的。只有1%召回是含有G+菌。無菌制劑1、藥用輔料標(biāo)準(zhǔn)的制定起始原料來源：可分為合成；半合成；來自植物，動物，礦物材料。制造過程：加工過程分輕微加工和高度加工硬脂酸鎂：通過氯化鎂和硬脂酸鈉水溶液作用。原料硬脂酸來自動物脂肪或棉籽油。通過水解脂肪制造，在高溫水逆流，所得的混合物是由真空蒸汽蒸餾純化的餾分，然后用選擇性溶劑分離。硬脂酸也可由棉籽和其他植物油加氫生產(chǎn)；通過加氫和隨后的皂化油脂從乙醇重結(jié)晶；從食用油脂與氫

氧化鈉煮沸，分離甘油，用硫酸或鹽酸分解得到肥皂。冷卻后，硬脂酸與油酸隨后分離?；谥圃爝^程，是極不可能的包含微生物負(fù)載，更不用說沙門和大腸。此外它是疏水的，水分活度0.490，不支持微生物的生長。潤滑成分一般是0.5~2.5%，是一個(gè)次要成分，硬脂酸鎂的微生物要求應(yīng)該取消。）2、新的輔料控制菌標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù)廠家標(biāo)準(zhǔn)制定？微生物標(biāo)準(zhǔn)制定一些考慮cited:ANTHONY

M.

CUNDELL,Ph.D.Managing

the

MicrobiologicalQuality

of

Pharmaceutical

Excipients3、清洗驗(yàn)證中微生物標(biāo)準(zhǔn)的制定清洗后的標(biāo)準(zhǔn)：表面監(jiān)測：計(jì)算出來≥50CFU/cm2或≥1250CFU/g，按照廠房標(biāo)準(zhǔn)：1-2CFU/cm2（非無菌藥品，無菌藥品更容易實(shí)現(xiàn)，否則不符合GMP）沖洗水：水的標(biāo)準(zhǔn)做為合格標(biāo)準(zhǔn)。有害菌：

從以下結(jié)果方面考慮：種類、數(shù)量、劑型（局部用劑、吸入劑）

，用途，患者人群（艾滋病患者）

，給藥途徑，對病人安全的影響，對產(chǎn)品穩(wěn)定性的

影響，容器/密閉的完整性，和活性成分的生物利用度。存放后的標(biāo)準(zhǔn)最主要的預(yù)防措施是保持干燥，NMT

1CFU/cm2

（原標(biāo)準(zhǔn)）和不超過1lg的增加，這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可以聯(lián)合制定標(biāo)準(zhǔn)，以嚴(yán)格的為準(zhǔn)。