霉立解在豬飼料中的應(yīng)用—防治玉米赤霉烯酮中毒報告人：計成單位：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)2012.10.25一、玉米赤霉烯酮污染概況二、母豬玉米赤霉烯酮中毒三、飼料霉菌毒素污染的防治

四、微生物降解玉米赤霉烯酮的研究

五、霉菌毒素生物降解前景展望目錄聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）估計,全世界谷物每年平均25%受霉菌毒素污染，平均有2%的糧食由于霉變不能食用，造成巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計,畜禽食用霉菌毒素污染的飼料,畜牧業(yè)每年遭受14.4億美元的經(jīng)濟損失。我國華南、華東乃至華北地區(qū)收獲季節(jié)雨量較多，農(nóng)作物在田間就會受到霉菌的污染。解決糧食霉菌毒素污染是一個世界性問題，是解決食品安全和人類健康的大問題。一、玉米赤霉烯酮污染概況北美Afla8%;ZON52%;DON87%;FUM49%OTA12%南美Afla22%;ZON57%;DON27%;FUM88%;OTA6%南歐Afla50%;DON41%;ZON19%;

FUM83%.;OTA29%中東Afla8%;ZON29%;DON40%;FUM65%;OTA22%東北亞Afla13%;DON71%;

ZON56%;

FUM44%;OTA22%東南亞Afla65%;DON41%;

ZON49%;

FUM57%;OTA32%南亞Afla88%;DON30%;

ZON30%;

FUM58%;OTA71%大洋洲Afla11%;ZON18%;DON26%;FUM9%;OTA15%中歐Afla14%;DON60%;ZON26%;FUM32%;OTA28%北歐Afla0%;DON；62%;ZON53%;

FUM40%;OTA25%圖1地理環(huán)境對糧食和飼料霉菌毒素污染的影響霉菌毒素樣品數(shù)平均含量ng/kg最高值ng/kg陽性率(％)

黃曲霉毒素33424.81719.496.1T-2毒素34936.7252.198.3玉米赤霉烯酮420223.07772.387.9煙曲霉毒素30929.8240.499.7赭曲霉毒素383750.08400.085.4去氧瓜萎蓮菌醇412970.010900.099.0表1亞洲地區(qū)配合飼料和飼料原料中霉菌毒素的分布（2007）

表2中國玉米霉菌毒素污染抽樣檢查概況（2007）霉菌毒素樣本數(shù)檢出率(％)超標(biāo)率(％)含量黃曲霉毒素431007.02.1～54.7μg/kgT-2毒素7210027.812.5～1129.9mg/kg玉米赤霉烯酮4797.946.84.4～3613.6μg/kg嘔吐毒素409532.50.01～2.3mg/kg煙曲霉毒素757642.70.1～10.0mg/kg赭曲霉毒素7566.726.70.3～89.2μg/kg項目樣品數(shù)檢出率（%）超標(biāo)率（%）含量范圍（μg/kg）陽性樣品平均值（μg/kg）輕污染率（%）中度污染率（%）嚴(yán)重污染率（%）玉米1410006.25-321.47109.08±161.55B10000豆粕1154.4500-35.409.19±191.14B10000糠麩類1310000-44.4014.92±182.25B10000DDGS1710041.1848.89-2957.87882.68±146.4A58.8223.5317.657表3北京地區(qū)豬主要飼料原料中玉米赤霉烯酮檢測結(jié)果（計成等2011）項目樣品數(shù)陽性樣品數(shù)檢出率（%）超標(biāo)率（%）含量范圍（μg/kg）陽性樣品平均值（μg/kg）輕污染率（%）乳豬料7710004.69-106.8639.11±17.04

100仔豬料14141000<1-114.5953.60±13.02100中豬料141410007.59-131.6966.97±13.02100大豬料181810007.08-149.7659.01±12.51100懷孕母豬料101010009.23-149.1162.94±13.59100哺乳豬料131310007.35-231.5975.60±13.02100合計76761000<1-231.5958.88±5.361008表4豬全價配合飼料玉米赤霉烯酮含量檢測結(jié)果（計成等2011）霉菌毒素檢測設(shè)備檢測方法：參照GB/T23504-2009《食品中玉米赤霉烯酮的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》對照組(培養(yǎng)基+ZEN）（ZEN含量62ppb)試驗組(菌液+ZEN）（ZEN含量11.3ppb)ZEN標(biāo)準(zhǔn)品(100ppb)動物一旦攝食含有霉菌毒素的飼料，將會造成不同程度

的傷害，統(tǒng)稱為霉菌毒素中毒癥。由霉菌毒素引發(fā)的慢性中毒，例如免疫抑制、對疾病抵抗

力下降、不孕和消化機能紊亂；急性中毒造成子宮/直腸脫出、流產(chǎn)和死胎，甚至死亡。玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEA）是一類2，4-二羥基苯甲酸的內(nèi)酯化合物，具有類似雌激素的作用，可與子宮內(nèi)雌激素受體不可逆結(jié)合，從而影響動物的生殖生理。

二、母豬玉米赤霉烯酮中毒產(chǎn)生玉米赤霉烯酮的鐮刀霉菌

(電鏡掃描)圖2.玉米赤霉烯酮的分子結(jié)構(gòu)各種動物對玉米赤霉烯酮的敏感程度依次是:豬、大鼠、牛和禽。青年母豬對玉米赤霉烯酮的敏感性最強，飼料中含0.1～0.15mg/kg的玉米赤霉烯酮即可引起陰門紅腫，子宮的體積和重量增加。

圖3.玉米赤霉烯酮對母豬子宮的影響（CemlynMartin，2003）子宮水腫充血子宮水腫輕度充血正常子宮雷元培，2012圖4.玉米赤霉烯酮導(dǎo)致陰門紅腫ZEN導(dǎo)致直腸和陰道脫垂（計成等，2012）

圖5胚胎死亡仔豬畸形后備和經(jīng)產(chǎn)母豬玉米赤霉烯酮中毒現(xiàn)象在豬場時有出現(xiàn)，嚴(yán)重的影響母豬的繁殖性能。主要的飼料原料玉米、小麥含有較高玉米赤霉烯酮。近幾年隨著原料價格的不斷攀升，糧食副產(chǎn)物被大量使用DDGS、麩皮等含有更多的玉米赤霉烯酮。應(yīng)用這些飼料原料配合的全價飼料，玉米赤霉烯酮的含量經(jīng)常超過國家標(biāo)準(zhǔn)，引起中毒出現(xiàn)。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）于1995年建議將危害分析與關(guān)鍵控制點（HACCP）系統(tǒng)應(yīng)用于霉菌毒素管理，通過加強作物生長、成熟、收獲和貯存等各個環(huán)節(jié)的控制來最大限度的減少食品和飼料中的霉菌毒素。飼料在貯存過程中不可避免霉變：

1）嚴(yán)格控制原料的含水量2）使用優(yōu)質(zhì)防霉劑（丙酸及其鹽類）三、飼料霉菌毒素污染的防治方法分類具體技術(shù)優(yōu)缺點1.上世紀(jì)50年代傳統(tǒng)物理化學(xué)法堿處理、氧化處理、高溫處理、原料稀釋等①降低飼料的營養(yǎng)價值；②影響飼料的感官品質(zhì)；③有些方法去毒不徹底。2.上世紀(jì)90年代吸附劑吸附法硅鋁酸鹽類等無機吸附劑、酯化甘露聚糖等有機吸附劑

①影響維生素和微量元素等吸收；②在消化道內(nèi)吸附效果不穩(wěn)定；③造成環(huán)境蓄積性污染。3.本世紀(jì)初微生物發(fā)酵處理法芽孢桿菌、白腐真菌、假密環(huán)菌等①芽孢桿菌可以直接添加；②次級代謝產(chǎn)物可能有毒害作用。4.本世紀(jì)近10年純化降解酶降解法

白腐真菌、假密環(huán)菌、粘細菌、芽孢桿菌等所產(chǎn)解毒酶①特異性強；②不影響飼料的營養(yǎng)價值；③避免毒素的蓄積性污染環(huán)境；④避免次級代謝產(chǎn)物的毒害作用。霉菌毒素解毒方法研究進展

電鏡下的吸附劑吸附劑吸附效果CommercialProducts圖5.部分粘土類礦物質(zhì)僅能吸附黃曲霉毒素圖6.DON不易被吸附劑吸附-ByZehra

MoluBekcl(2011)andBocarovStancic(2011)圖7.玉米赤霉烯酮不易被吸附劑吸附樣品名稱樣品稱樣量g蒙脫石稱樣量gVB6結(jié)果（g/kg）平均數(shù)吸附率%九聯(lián)肉雞多維0.4099

13.2513.04

0.4247

12.83九聯(lián)肉雞+蒙脫石0.43480.54447.276.9446.780.42120.54096.60大龍仔豬多維0.4331

16.5116.60

0.4117

16.70大龍仔豬+蒙脫石0.42230.54359.808.9146.330.41820.54358.02吸附劑對維生素B6的吸附作用瘤胃內(nèi)容物含水量為84%-94%全消化道中67%的內(nèi)容物在瘤胃中。消化道食糜在瘤胃內(nèi)停留20-48小時，相當(dāng)于整個消化過程的一半時間。瘤胃中被吸附的黃曲霉毒素會解吸附。反芻動物吸附劑應(yīng)用的問題霉菌毒素傳統(tǒng)的物理和化學(xué)去毒方法存在效果不穩(wěn)定、營養(yǎng)成分損失大、影響飼料適口性，且難以規(guī)?；a(chǎn)等缺點而不能被廣泛應(yīng)用到實際生產(chǎn)中。微生物及生物酶解毒因具有解毒效率高、特異性強、對飼料和環(huán)境沒有污染等特點和優(yōu)勢，備受研究者的關(guān)注。霉菌毒素生物降解指微生物、植物及其代謝產(chǎn)生的酶與毒素作用，使其分子結(jié)構(gòu)中毒性基團被破壞而生成無毒降解產(chǎn)物的過程。生物降解法的發(fā)展四、微生物降解玉米赤霉烯酮的研究

國內(nèi)外生物降解玉米赤霉烯酮的研究

Orsolya

等（2004）從白蟻尾腸分離到酵母菌株Trichosporon，可以有效降解飼料中的玉米赤霉烯酮，能將ZEA分子中的內(nèi)酯環(huán)打開生成非雌激素化合物。本實驗室從動物腸道食糜中分離出能夠高效降解玉米赤霉烯酮的菌株，已經(jīng)申請專利進行保護，申請?zhí)枮镃N301010620651.2，目前正在研究其作用機理及其降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。在保存的菌株和雞、魚、鼠和牛的腸道內(nèi)容物等72個樣品進行了篩選。最終在動物腸道食糜中分離出能夠高效降解玉米赤霉烯酮的菌株。經(jīng)過初篩和復(fù)篩，篩選得到對玉米赤霉烯酮降解率達到80%的細菌2株，其中一株是枯草芽孢桿菌（實驗室命名—霉立解01G），該菌已經(jīng)授權(quán)國家發(fā)明專利，專利號：ZL201010920651.2。玉米赤霉烯酮降解菌的篩選CompanyLogo取該菌株的上清液800μl進行熱處理（100℃加熱10min）后與200μl玉米赤霉烯酮（500ppb）反應(yīng)，另取800μl上清液加入蛋白酶K（0.01g蛋白酶K）反應(yīng)兩小時后，向混合液中加入200μl玉米赤霉烯酮，反應(yīng)72小時后檢測。降解率%圖8.ZEN降解活性物質(zhì)性質(zhì)研究目前正在研究霉立解01G菌降解ZEN的作用機理及其降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。同時進行霉立解01G菌降解酶的分離純化、氨基酸序列測定及降解酶的基因克隆。1.豬玉米赤霉烯酮中毒情況調(diào)查及霉立解對該中毒癥的改善和緩解效果2012年6月河北某豬場調(diào)查目標(biāo)：飼喂相同飼料并出現(xiàn)玉米赤霉烯酮中毒現(xiàn)象的同一豬舍母豬豬品種：長白豬和大白豬豬只總數(shù)：120頭調(diào)查豬只月齡：6個月（80kg左右）飼料中玉米赤霉烯酮含量：兩種后備母豬飼料中玉米赤霉烯酮含量分別為414ug/kg和517ug/kg飼喂時間：30天調(diào)查時間：2012年6月6日1）河北某豬場豬玉米赤霉烯酮中毒情況調(diào)查圖1.ZEN中毒的豬，陰門紅腫34中毒癥狀：豬只出現(xiàn)外陰紅腫，從輕微到嚴(yán)重情況不一，基本飼喂同一種飼料的母豬均出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，個別中毒母豬還出現(xiàn)脫肛現(xiàn)象中毒豬只占總豬數(shù)比例：幾乎達到100%出現(xiàn)嚴(yán)重中毒癥狀的豬只約占總豬數(shù)比例：30%在日糧中添加一定量的霉立解01G菌，觀察其對豬中毒癥狀的緩解效果觀察時間：2012年7月4日2）霉立解對豬玉米赤霉烯酮中毒癥的改善和緩解效果目前癥狀：嚴(yán)重中毒豬只外陰紅腫現(xiàn)象正在恢復(fù)，輕微中毒的基本已恢復(fù)正常。癥狀減輕和恢復(fù)比例：100%恢復(fù)正常的豬只比例：20%圖3.腫大的子宮圖4.恢復(fù)到正常的子宮2.霉立解對青年母豬玉米赤霉烯酮中毒癥的改善和緩解效果2012年7月河南某公司豬場試驗?zāi)康模貉芯棵沽⒔?1G菌對飼喂玉米赤霉烯酮污染日糧青年母豬生產(chǎn)性能、免疫功能及中毒癥狀的緩解作用。試驗動物：18頭初始體重為43kg左右的青年母豬，隨機分為3個處理，每個處理6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，試驗時間為24天。試驗設(shè)計：

表1.試驗分組及日糧組成分組

日糧對照組正常玉米型日糧處理組Ⅰ發(fā)霉玉米型日糧(ZEN240ppb)處理組Ⅱ發(fā)霉玉米型日糧（ZEN240ppb）+霉立解01G（2kg/T）日糧中玉米被玉米赤霉烯酮污染，ZEN含量為486ppb；玉米添加比例為51%，處理Ⅰ和Ⅱ組中ZEN的實測值為240ppb。原料配比配方營養(yǎng)原料原料配比（%）營養(yǎng)素名稱計量單位配方營養(yǎng)玉米50豬消化能MC/Kg3.0579小麥8.57粗蛋白%17.1968次粉6賴氨酸%1.0471小麥麩5蛋氨酸%0.2618去皮豆粕5蛋胱氨酸%0.5617玉米胚芽粕3蘇氨酸%0.7177花生仁粕5色氨酸%0.15765賴氨酸0.7纈氨酸%0.6195棉籽粕6鈣%0.6131DDGS7總磷%0.56421%豬預(yù)混料1非植酸磷%0.3355石粉0.8鈉%0.2108碳酸氫鈣1氯%0.362大豆油0.5食鹽%0.298食鹽0.3四種小麥酶混合0.01蘇氨酸0.12表2.日糧組成與配方檢測指標(biāo)：

外陰中毒癥狀：陰戶（長、寬、高和面積）

形態(tài)學(xué)：卵巢和子宮體形態(tài)學(xué)、肝臟和腎臟形態(tài)學(xué)

血清激素：血清中睪酮、孕酮、雌二醇、促黃體生成素、

卵泡刺激素和催乳素玉米赤霉烯酮殘留測定：食糜、糞便和肝臟中ZEN殘留量統(tǒng)計分析：使用SAS9.0進行單因素方差分析。陰戶面積測量方法：

S=（π×a×b）/4圖1.陰戶面積測量示意圖項目組別0-10d10-17d(mm)17-24d(mm)0-24d(mm)長(mm)對照組2.80±1.74a-0.17±2.161.38±1.374.02±2.24處理組Ⅰ6.05±1.16ab0±1.090.79±1.486.84±1.93處理組Ⅱ8.36±1.41b-3.68±0.961.42±1.256.10±1.13寬(mm)對照組2.58±1.841.42±1.652.50±1.526.50±2.21處理組Ⅰ5.44±1.181.64±1.14-0.36±0.996.72±1.57處理組Ⅱ6.30±1.80-1.7±1.281.03±0.955.63±1.57高(mm)對照組1.22±2.