組織樣本庫(kù)的石蠟包埋與冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)化方案演講人01組織樣本庫(kù)的石蠟包埋與冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)化方案02引言：標(biāo)準(zhǔn)化是組織樣本庫(kù)質(zhì)量的基石03石蠟包埋標(biāo)準(zhǔn)化方案：穩(wěn)定組織形態(tài)與抗原性的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”04冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)化方案：保留生物大分子活性的“快速路徑”05標(biāo)準(zhǔn)化方案的質(zhì)控體系與持續(xù)改進(jìn)06總結(jié)：標(biāo)準(zhǔn)化賦能組織樣本庫(kù)的高質(zhì)量發(fā)展目錄01組織樣本庫(kù)的石蠟包埋與冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)化方案02引言：標(biāo)準(zhǔn)化是組織樣本庫(kù)質(zhì)量的基石引言：標(biāo)準(zhǔn)化是組織樣本庫(kù)質(zhì)量的基石在生物醫(yī)學(xué)研究與臨床轉(zhuǎn)化的漫長(zhǎng)征程中，組織樣本庫(kù)作為“生物資源寶庫(kù)”，承載著從基礎(chǔ)機(jī)制探索到疾病診療突破的核心價(jià)值。無論是腫瘤的分子分型、靶向藥物研發(fā)，還是罕見病的病理機(jī)制解析，高質(zhì)量的組織樣本始終是數(shù)據(jù)可靠性的根本保障。而石蠟包埋與冷凍保存作為組織樣本最核心的兩種保存方式，其標(biāo)準(zhǔn)化程度直接決定了樣本的核酸、蛋白質(zhì)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而影響下游實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性與可信度。在樣本庫(kù)的日常管理中，我曾遇到過這樣的案例：某合作團(tuán)隊(duì)因前期樣本固定時(shí)間不統(tǒng)一（部分樣本固定24小時(shí)，部分固定72小時(shí)），導(dǎo)致后續(xù)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)中基因表達(dá)差異顯著，最終不得不重復(fù)實(shí)驗(yàn)，浪費(fèi)了大量時(shí)間與成本。這一經(jīng)歷深刻印證了“沒有標(biāo)準(zhǔn)化，就沒有高質(zhì)量”。因此，構(gòu)建一套涵蓋從樣本接收、前處理到保存、質(zhì)控的全流程標(biāo)準(zhǔn)化方案，不僅是樣本庫(kù)規(guī)范運(yùn)營(yíng)的核心要求，更是推動(dòng)多中心協(xié)作、成果轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵前提。本文將從石蠟包埋與冷凍保存兩大技術(shù)路徑出發(fā)，結(jié)合行業(yè)實(shí)踐與質(zhì)量控制要點(diǎn)，系統(tǒng)闡述其標(biāo)準(zhǔn)化方案的構(gòu)建邏輯與操作細(xì)則。03石蠟包埋標(biāo)準(zhǔn)化方案：穩(wěn)定組織形態(tài)與抗原性的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”石蠟包埋標(biāo)準(zhǔn)化方案：穩(wěn)定組織形態(tài)與抗原性的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”石蠟包埋（ParaffinEmbedding,PE）因其能長(zhǎng)期保存組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、便于切片與存儲(chǔ)，成為組織病理學(xué)診斷和回顧性研究的首選方法。其標(biāo)準(zhǔn)化需圍繞“固定-脫水-透明-浸蠟-包埋”五大核心環(huán)節(jié)，通過參數(shù)控制與質(zhì)量監(jiān)控，確保樣本的形態(tài)學(xué)完整性與抗原可檢測(cè)性。1樣本接收與前處理：標(biāo)準(zhǔn)化流程的“第一道關(guān)卡”樣本接收是保證后續(xù)質(zhì)量的前提，需建立嚴(yán)格的樣本信息核查與狀態(tài)評(píng)估機(jī)制。-信息核對(duì)：需與樣本采集方核對(duì)唯一標(biāo)識(shí)號(hào)、患者基本信息（年齡、性別、診斷）、采集時(shí)間、部位、臨床病史及已知情同意書，確保信息完整且可追溯。對(duì)于手術(shù)切除樣本，還需記錄離體時(shí)間、冷缺血時(shí)間（樣本離體至冷凍/固定的時(shí)間，建議≤30分鐘）及送檢條件（是否干冰/冰袋運(yùn)輸）。-樣本分揀與修剪：根據(jù)研究目的對(duì)樣本進(jìn)行分揀，如腫瘤組織需包含癌灶、癌旁及正常組織（若可能）。修剪時(shí)需剔除脂肪、結(jié)締組織及壞死區(qū)域（壞死面積＞30%的樣本應(yīng)標(biāo)記為“不合格”），組織塊大小建議為1.5cm×1.5cm×0.3cm（厚度≤0.5cm，確保固定液充分滲透）。-記錄與留檔：使用實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS）錄入樣本信息，拍照存檔（包含尺子參照物），確保每一步操作可追溯。2固定：形態(tài)學(xué)與抗原性保存的“核心環(huán)節(jié)”固定是石蠟包埋中最關(guān)鍵的一步，其目的是通過化學(xué)試劑（常用10%中性福爾馬林）使組織蛋白質(zhì)交聯(lián)，抑制酶活性，防止自溶與腐敗，同時(shí)保持細(xì)胞形態(tài)與抗原結(jié)構(gòu)。-固定液選擇與配制：優(yōu)先使用10%中性緩沖福爾馬林（NBF，pH7.0-7.4），避免使用酸性福爾馬林（如未經(jīng)緩沖的甲醛溶液，可能導(dǎo)致過度酸化、核酸降解）。固定液需現(xiàn)用現(xiàn)配或定期更換（每3個(gè)月檢測(cè)pH值，低于6.0時(shí)需更換），固定液與組織體積比建議≥10:1（確保組織完全浸泡）。-固定時(shí)間控制：固定時(shí)間過短（＜6小時(shí)）會(huì)導(dǎo)致固定不足，組織自溶、抗原丟失；時(shí)間過長(zhǎng)（＞72小時(shí)）會(huì)導(dǎo)致過度交聯(lián)，抗原表位遮蔽，影響后續(xù)免疫組化（IHC）結(jié)果。不同組織類型需差異化處理：-實(shí)質(zhì)器官（肝、腎）：固定6-12小時(shí)；2固定：形態(tài)學(xué)與抗原性保存的“核心環(huán)節(jié)”21-間質(zhì)組織（纖維組織、肌肉）：固定12-24小時(shí)；-固定后處理：固定完成后，組織需用流水沖洗4-6小時(shí)（去除殘留固定液，防止結(jié)晶），或用70%乙醇保存（若暫時(shí)不處理）。-含纖維成分多的組織（乳腺、皮膚）：固定24-48小時(shí)；-神經(jīng)組織：需適當(dāng)延長(zhǎng)至48-72小時(shí)（但需避免過度硬化）。433脫水：去除組織水分的“關(guān)鍵步驟”脫水的目的是去除組織中的水分，為后續(xù)透明劑浸透和石蠟置換創(chuàng)造條件。常用梯度乙醇脫水，需嚴(yán)格控制濃度與時(shí)間。-脫水梯度與時(shí)間：|濃度（%）|作用|時(shí)間（小時(shí)）|注意事項(xiàng)||----------|------------|--------------|------------------------------||70%|初步脫水|2-4（過夜）|低濃度乙醇可固定部分蛋白||80%|進(jìn)一步脫水|1-2|避免組織收縮變形||95%|深度脫水|1-2（2次）|時(shí)間不宜過長(zhǎng)，防止組織變脆|3脫水：去除組織水分的“關(guān)鍵步驟”|100%|無水乙醇|1-2（2次）|需用新鮮無水乙醇（含水＜0.03%）|-脫水設(shè)備與維護(hù)：使用自動(dòng)脫水機(jī)時(shí)，需定期更換乙醇（每100個(gè)樣本更換一次），檢查液位傳感器與溫度控制（脫水溫度≤38℃，高溫會(huì)導(dǎo)致組織變脆、抗原丟失）。手動(dòng)脫水需確保組織完全浸沒在乙醇中，避免漂浮。4透明：置換乙醇為石蠟的“過渡階段”透明的目的是用透明劑（常用二甲苯或甲苯）置換組織中的乙醇，使石蠟?zāi)軌驖B入組織。-透明劑選擇：二甲苯透明效率高，但毒性大；甲苯毒性較低，適合大規(guī)模操作；也可使用新型透明劑（如檸檬烯），環(huán)保且對(duì)抗原性影響小。透明劑需保持無水，每50個(gè)樣本更換一次。-透明時(shí)間：組織塊大小不同，透明時(shí)間差異顯著：-小塊組織（1cm3）：30-60分鐘；-中等組織（2cm3）：1-2小時(shí)；-大塊組織（＞3cm3）：需延長(zhǎng)至2-3小時(shí)（避免透明不充分，導(dǎo)致浸蠟時(shí)出現(xiàn)“白斑”）。-透明后檢查：組織應(yīng)呈半透明狀態(tài)，若仍有渾濁，需延長(zhǎng)透明時(shí)間或更換透明劑。5浸蠟與包埋：石蠟置換與成型的“最終環(huán)節(jié)”浸蠟是用石蠟置換透明劑，包埋是將浸透石蠟的組織包埋在石蠟中，形成便于切片的蠟塊。-浸蠟條件：-石蠟選擇：熔點(diǎn)54-58℃（常規(guī)切片）或60-62℃（需高溫切片的組織），需定期過濾（去除雜質(zhì)），每200個(gè)樣本更換一次。-溫度控制：浸蠟溫度高于石蠟熔點(diǎn)5-8℃（如58℃石蠟浸蠟溫度為60-63℃），溫度過高會(huì)導(dǎo)致組織變脆、抗原破壞；溫度過低則石蠟滲透不充分。-時(shí)間控制：2-3小時(shí)（需更換2次石蠟，確保充分滲透）。-包埋操作：-包埋模具需預(yù)加熱（50-55℃），防止石蠟快速凝固導(dǎo)致組織移位；5浸蠟與包埋：石蠟置換與成型的“最終環(huán)節(jié)”-組織需按預(yù)定方向（如組織長(zhǎng)軸垂直于包埋面）放入模具，確保后續(xù)切片能展示關(guān)鍵結(jié)構(gòu)（如腫瘤與正常組織交界處）；-倒入石蠟時(shí)需緩慢，避免產(chǎn)生氣泡（氣泡可用加熱針頭去除）；-包埋后蠟塊需在室溫下冷卻1-2小時(shí)（避免速冷導(dǎo)致組織收縮），然后標(biāo)記樣本號(hào)，4℃保存。6石蠟包埋樣本的質(zhì)量控制（QC）-形態(tài)學(xué)QC：切片厚度3-5μm，HE染色后顯微鏡下觀察，組織結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞核清晰、無artifacts（如刀痕、折疊、氣泡）；-抗原性QC：選取3-5種常用抗體（如CK、Vimentin、Ki-67）進(jìn)行IHC染色，陽(yáng)性定位準(zhǔn)確、染色強(qiáng)度符合預(yù)期；-核酸QC：部分樣本需進(jìn)行DNA/RNA質(zhì)量檢測(cè)（如DNAOD260/280=1.8-2.0，RNARIN≥7），確保下游分子實(shí)驗(yàn)可用。04冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)化方案：保留生物大分子活性的“快速路徑”冷凍保存標(biāo)準(zhǔn)化方案：保留生物大分子活性的“快速路徑”冷凍保存（cryopreservation）是通過超低溫（-80℃或液氮）抑制生物活性，最大限度保留組織中的核酸、蛋白質(zhì)及酶活性，適用于基因測(cè)序、蛋白質(zhì)組學(xué)等需高活性生物分子的研究。其標(biāo)準(zhǔn)化需圍繞“樣本評(píng)估-冷凍保護(hù)-冷凍速率-存儲(chǔ)條件-復(fù)蘇驗(yàn)證”五大核心，避免冰晶損傷與再結(jié)晶效應(yīng)。1樣本評(píng)估與前處理：確保樣本“可凍性”冷凍保存對(duì)樣本狀態(tài)要求更高，需在采集后立即處理（冷缺血時(shí)間≤10分鐘），以減少細(xì)胞死亡與酶解。-樣本類型篩選：-適合冷凍：新鮮手術(shù)樣本（穿刺、切除）、活檢樣本、細(xì)胞懸液；-不適合冷凍：壞死組織（＞10%）、脂肪組織（含大量脂質(zhì)，易形成冰晶）、固定組織（已交聯(lián)，無法保持活性）。-樣本修剪與分裝：修剪至0.5cm×0.5cm×0.3cm（小體積可減少冰晶形成），分裝時(shí)避免反復(fù)凍融（每管分裝量需滿足單次實(shí)驗(yàn)用量，如100mg/管）；-標(biāo)記與信息錄入：使用耐低溫標(biāo)簽（如凍存管螺旋口標(biāo)簽），錄入樣本信息至LIMS，記錄分裝時(shí)間、操作人。2冷凍保護(hù)劑（CPA）添加：對(duì)抗冰晶損傷的“防護(hù)盾”冷凍保護(hù)劑可通過降低溶液冰點(diǎn)、減少冰晶形成，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與生物大分子。常用CPA分為滲透性（如DMSO、甘油）與非滲透性（如海藻糖、聚乙二醇）。-CPA選擇與配制：-組織樣本：常用10-15%DMSO（滲透性強(qiáng)，但細(xì)胞毒性大，需預(yù)冷至4℃），或5-10%甘油（毒性低，但滲透速度慢）；-細(xì)胞懸液：常用10%FBS+10%DMSO（細(xì)胞凍存液）；-CPA需用PBS或培養(yǎng)基配制，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存（避免DMSO高溫降解）。-處理時(shí)間與溫度：組織塊與CPA體積比1:5，4℃條件下孵育30-60分鐘（滲透平衡），期間輕輕晃動(dòng)（避免組織沉底）。3冷凍速率控制：決定細(xì)胞存活率的“核心技術(shù)”冷凍速率是冷凍保存的關(guān)鍵：速率過快（＞100℃/min）會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)冰晶形成，損傷細(xì)胞膜；速率過慢（＜1℃/min）會(huì)導(dǎo)致胞外冰晶增長(zhǎng)，擠壓細(xì)胞。-程序降溫（推薦）：使用程序降溫儀，設(shè)置梯度降溫：-從4℃降至-5℃（1℃/min），誘發(fā)細(xì)胞外冰晶形成（減少胞內(nèi)過冷）；--5℃保持10分鐘（冰晶生長(zhǎng)穩(wěn)定）；-從-5℃降至-40℃（1-5℃/min，避免過冷）；--40℃以下轉(zhuǎn)入-80℃冰箱長(zhǎng)期保存，或直接投入液氮（-196℃）。-手動(dòng)降溫（輔助）：若無條件使用程序降溫儀，可采用“凍存管置于泡沫盒+異丙醇預(yù)冷”的方法，以5-10℃/min速率降溫（異丙醇可改善熱傳導(dǎo)），但需嚴(yán)格驗(yàn)證降溫速率。4存儲(chǔ)條件：維持超低溫穩(wěn)定的“環(huán)境保障”-存儲(chǔ)溫度：根據(jù)樣本用途選擇：-短期保存（1年內(nèi)）：-80℃冰箱（需定期校準(zhǔn)溫度波動(dòng)范圍≤±2℃）；-長(zhǎng)期保存（＞1年）：液氮罐（氣相-150℃或液相-196℃），避免液氮直接接觸樣本（防止玻璃化破裂）。-存儲(chǔ)管理：-液氮罐需每周檢查液位，記錄壓力變化；-樣本需分層存儲(chǔ)（不同項(xiàng)目/類型分區(qū)），標(biāo)注“危險(xiǎn)”（如含DMSO樣本易燃）；-定期盤點(diǎn)樣本（每3個(gè)月一次），確保無丟失、無標(biāo)簽脫落。5復(fù)蘇與質(zhì)控：驗(yàn)證冷凍效果的“最終檢驗(yàn)”復(fù)蘇的目的是快速恢復(fù)樣本活性，避免再結(jié)晶損傷。-復(fù)蘇操作：--80℃樣本：37℃水浴快速?gòu)?fù)蘇（1-2分鐘，不斷晃動(dòng)至完全融化），立即預(yù)冷的PBS洗滌（去除CPA）；-液氮樣本：需在通風(fēng)櫥中操作（防止DMSO揮發(fā)中毒），快速取出后37℃水浴復(fù)蘇。-質(zhì)控檢測(cè)：-細(xì)胞活力：臺(tái)盼藍(lán)染色（活細(xì)胞率＞85%適用于細(xì)胞培養(yǎng)，＞70%適用于核酸提?。?復(fù)蘇與質(zhì)控：驗(yàn)證冷凍效果的“最終檢驗(yàn)”-核酸質(zhì)量：DNA片段化檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳，無拖尾），RNARIN值（≥7）；-蛋白質(zhì)活性：Westernblot檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)量，與新鮮樣本對(duì)比（差異＜20%）。05標(biāo)準(zhǔn)化方案的質(zhì)控體系與持續(xù)改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)化方案的質(zhì)控體系與持續(xù)改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)化不是一成不變的流程，而是需通過質(zhì)控體系（QC/QA）與持續(xù)改進(jìn)（PDCA循環(huán)）不斷完善的過程。1全流程質(zhì)控指標(biāo)體系建立“樣本接收-前處理-保存-存儲(chǔ)-出庫(kù)”全流程質(zhì)控點(diǎn)，量化評(píng)估樣本質(zhì)量：1全流程質(zhì)控指標(biāo)體系|環(huán)節(jié)|質(zhì)控指標(biāo)|合格標(biāo)準(zhǔn)|檢測(cè)頻率||--------------|---------------------------|------------------------------|----------------||樣本接收|冷缺血時(shí)間|≤30分鐘|每批100%||固定|固定時(shí)間、pH值|6-72小時(shí)，pH7.0-7.4|每批10%||石蠟包埋|切片質(zhì)量、抗原保存率|HE染色無artifact，IHC陽(yáng)性率≥90%|每批5%||冷凍保存|復(fù)蘇細(xì)胞活力、核酸RIN值|活率＞70%，RNARIN≥7|每批3%|1全流程質(zhì)控指標(biāo)體系|環(huán)節(jié)|質(zhì)控指標(biāo)|合格標(biāo)準(zhǔn)|檢測(cè)頻率||存儲(chǔ)條件|溫度波動(dòng)、液位|-80℃±2℃，液氮≥50%|每日記錄|2不合格樣本處理與偏差分析01對(duì)質(zhì)控不合格樣本需啟動(dòng)偏差分析流程：02-記錄偏差現(xiàn)象（如“固定時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致IHC陰性”）；03-調(diào)查原因（如操作人員失誤、設(shè)備故障）；04-制定糾正措施（如增加固定時(shí)間提醒標(biāo)簽、校準(zhǔn)脫水機(jī)溫度）；05-