為了研究細(xì)胞破碎，提升其破碎率，有必要了解各種微生物細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)微生物革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)（6-8%）脂類(lèi)（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂類(lèi)蛋白質(zhì)一、細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)第1頁(yè)細(xì)菌破碎主要阻力來(lái)自于肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌堅(jiān)固；酵母細(xì)胞壁破碎阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)緊密程度和它厚度；因?yàn)槊咕?xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌細(xì)胞壁有所提升。第2頁(yè)為了破碎細(xì)胞，必須克服主要阻力是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)共價(jià)鍵。各種微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成差異很大，壁結(jié)構(gòu)不但取決于遺傳信息，也取決于生長(zhǎng)環(huán)境，真菌壁結(jié)構(gòu)還隨發(fā)酵罐中混合機(jī)械作用而改變。

在用酶法或化學(xué)法來(lái)溶解細(xì)胞壁時(shí)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成顯得尤其主要，可用來(lái)作為選擇溶菌酶和化學(xué)方法依據(jù)。第3頁(yè)分類(lèi)作用機(jī)理適應(yīng)性機(jī)械法珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目標(biāo)產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽(yáng)性菌超聲破碎法液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過(guò)程升溫猛烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目標(biāo)產(chǎn)物不適合非機(jī)械法酶溶法酶分解作用含有高度專(zhuān)一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓猛烈改變破碎率較低，常與其它方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法重復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目標(biāo)產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件改變猛烈，易引發(fā)大分子物質(zhì)失活二、微生物細(xì)胞破碎技術(shù)＝＝＝＝基本說(shuō)出第4頁(yè)細(xì)胞破碎機(jī)理圖第5頁(yè)1、機(jī)械方法為了粉碎微生物細(xì)胞，經(jīng)常選擇機(jī)械方法，因?yàn)樗鼈兲幚砹看?，破碎速度較快。采取這些方法，細(xì)胞受到由高壓產(chǎn)生高剪切力，但在大多數(shù)情況下要采取冷卻辦法，方便除去因?yàn)橄臋C(jī)械能而產(chǎn)生過(guò)多熱量，預(yù)防生化物質(zhì)破壞。第6頁(yè)（1）珠磨機(jī)

研磨是慣用一個(gè)方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使到達(dá)細(xì)胞某種程度破碎。

高速組織搗碎機(jī)和Braun勻漿器是試驗(yàn)室規(guī)模細(xì)胞破碎設(shè)備，利用玻璃小珠撞擊微生物細(xì)胞而到達(dá)破碎目標(biāo)。這些裝置主要缺點(diǎn)是在破碎期間樣品溫度快速升高，經(jīng)過(guò)用二氧化碳來(lái)冷卻容器可得到部分處理。第7頁(yè)在工業(yè)規(guī)模破碎中，能夠采取高速珠磨機(jī)。在這種設(shè)備中，因?yàn)閳A盤(pán)高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻璃珠相互攪動(dòng)，細(xì)胞破碎是由剪切力層之間碰撞和磨料滾動(dòng)而引發(fā)。第8頁(yè)（2）高壓勻漿器采取高壓勻漿器是大規(guī)模破碎細(xì)胞慣用方法。利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液經(jīng)過(guò)針形閥，因?yàn)橥蝗粶p壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)造成細(xì)胞破裂。在工業(yè)規(guī)模細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母菌等難破碎及濃度高或處于生長(zhǎng)靜止期細(xì)胞，常采取屢次循環(huán)操作方法。第9頁(yè)（3）X－press法另一個(gè)改進(jìn)高壓方法是將濃縮菌體懸浮液冷卻至－25℃至－30℃形成冰晶體，利用500MPa以上高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是因?yàn)楸w磨損，包埋在冰中微生物變形所引發(fā)。此法稱(chēng)為X－press法，主要用于試驗(yàn)室中。該法優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣，破碎率高，細(xì)胞碎片粉碎程度低以及活性保留率高。該法對(duì)冷冰－融解敏感生化物質(zhì)不適用。第10頁(yè)（4）超聲波法細(xì)胞破碎是因?yàn)槌暡昭ㄗ饔茫瑥亩a(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈沖擊波壓力，由它引發(fā)粘滯性旋渦在介質(zhì)中懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力，促使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。對(duì)于不一樣菌種發(fā)酵液、超聲波處理效果不一樣，桿菌比球菌易破碎、革蘭氏陰性菌細(xì)胞比革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞輕易破碎，對(duì)酵母菌效果極差。超聲波振蕩輕易引發(fā)溫度猛烈上升，操作時(shí)能夠在細(xì)胞懸浮液中投入冰或在夾套中通入冷卻劑進(jìn)行冷卻。該法不適于大規(guī)模操作，因?yàn)榉糯蠛?，要輸入很高能量?lái)提供必要冷卻，這是困難。第11頁(yè)（1）酶解法利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上特殊鍵，從而到達(dá)破壁目標(biāo)。2、非機(jī)械法非機(jī)械方法很多，包含酶解、滲透壓沖擊、凍結(jié)和融化、干燥法和化學(xué)法溶胞等。第12頁(yè)慣用溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等溶菌酶主要用于細(xì)菌類(lèi)細(xì)胞壁溶解酶是幾個(gè)酶復(fù)合物溶菌酶是應(yīng)用最多酶，它能專(zhuān)一地分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子α-1，4糖苷鍵，使脂多糖解離，經(jīng)溶菌酶處理后細(xì)胞移至低滲溶液中使細(xì)胞破裂。外加酶法第13頁(yè)對(duì)酵母細(xì)胞采取酶法破碎時(shí)，先加入蛋白酶作用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露葡聚糖層，最終只剩下原生質(zhì)體，這時(shí)若緩沖液滲透壓改變，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時(shí)必須依據(jù)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)酶，并確定對(duì)應(yīng)次序。酶溶法優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差（不一樣菌種需選擇不一樣酶），產(chǎn)物抑制存在。在溶酶系統(tǒng)中，甘露糖對(duì)蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。第14頁(yè)自溶作用是酶解另一個(gè)方法，所需溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生。影響自溶過(guò)程原因有溫度、時(shí)間、pH緩沖液濃度、細(xì)胞代謝路徑等。自溶法在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模，不過(guò)，對(duì)不穩(wěn)定微生物輕易引發(fā)所需蛋白質(zhì)變性，自溶后細(xì)胞培養(yǎng)液過(guò)濾速度也會(huì)降低。第15頁(yè)

（2）滲透壓沖擊是較溫和一個(gè)破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓介質(zhì)中（如一定濃度甘油或蔗糖溶液），到達(dá)平衡后，介質(zhì)被突然稀釋?zhuān)蛘邔⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，因?yàn)闈B透壓突然改變，水快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引發(fā)細(xì)胞壁破裂。滲透壓沖擊方法僅對(duì)細(xì)胞壁較脆弱菌，或者細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理，或合成受抑制而強(qiáng)度減弱時(shí)才是適當(dāng)。

（3）重復(fù)凍結(jié)一融化，可用于一些細(xì)胞破碎，或釋放一些細(xì)胞組分。凍結(jié)－融化法系將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，重復(fù)屢次而到達(dá)破壁作用。因?yàn)槔鋬?，首先能使?xì)胞膜疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加了細(xì)胞親水性能，另首先胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度改變，引發(fā)細(xì)胞突然膨脹而破裂。對(duì)于細(xì)胞壁較脆弱菌體，可采取此法。但通常破碎率很低，即使重復(fù)循環(huán)屢次也不能提升收率。另外，還可能引發(fā)對(duì)凍融敏感一些蛋白質(zhì)變性。第16頁(yè)（4）干燥法可采取空氣干燥，真空干燥，噴霧干燥和冷凍干燥等。它使細(xì)胞膜滲透性改變，當(dāng)用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就輕易被抽提出來(lái)。空氣干燥主要適合用于酵母菌，普通在25－30℃氣流中吹干，然后用水、緩沖液或其它溶劑抽提。空氣干燥時(shí)，部分酵母可能產(chǎn)生自溶，所以較冷凍干燥、噴霧干燥輕易抽提。真空干燥適合用于細(xì)菌干燥。冷凍干燥適合用于較不穩(wěn)定生化物質(zhì)，將冷凍干燥后菌體在冷冰條件下磨成粉，然后用緩沖液抽提。第17頁(yè)（5）化學(xué)滲透法:一些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，能夠改變細(xì)胞壁或膜通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。該法取決于化學(xué)試劑類(lèi)型以及細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)與組成。第18頁(yè)如TritonX-100是一個(gè)非離子型清潔劑，對(duì)疏水性物質(zhì)含有很強(qiáng)親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜磷脂雙分子層，使一些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。其它表面活性劑，如牛黃膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉等也可使細(xì)胞破碎。表面活性劑可促使細(xì)胞一些組分溶解，其增溶作用有利于細(xì)胞破碎。第19頁(yè)處理G-細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞外層膜有破壞作用。G-細(xì)菌外層膜結(jié)構(gòu)通?？慷r(jià)陽(yáng)離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜磷脂來(lái)填補(bǔ)，從而造成內(nèi)層膜通透性增強(qiáng)。EDTA螯合劑酸堿使蛋白質(zhì)易于溶解第20頁(yè)能分解細(xì)胞壁中類(lèi)脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級(jí)醇等。有機(jī)溶劑變性劑鹽酸胍（Guanidinehydrochloride）和脲（Urea）是慣用變性劑。變性劑與水中氫鍵作用，減弱溶質(zhì)分子間疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。第21頁(yè)不一樣細(xì)胞可采取化學(xué)滲透處理方式細(xì)胞類(lèi)型變性劑清潔劑有機(jī)溶劑酶抗生素生物試劑螯合劑革蘭氏陰性細(xì)菌******革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌***酵母菌******植物細(xì)胞****巨噬細(xì)胞****表適用第22頁(yè)通用性差；時(shí)間長(zhǎng)，效率低，普通胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超出50%；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物釋放有一定選擇性，可使一些較小分子量溶質(zhì)如多肽和小分子酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和深入提取。值得一提是，除了應(yīng)研究破碎細(xì)胞方法外，還應(yīng)研究在生物合成過(guò)程中減低細(xì)胞牢靠程度方法。第23頁(yè)三、破碎率測(cè)定為了測(cè)定細(xì)胞破碎程度，取得定量結(jié)果，就需要準(zhǔn)確分析技術(shù)，可采取以下幾個(gè)方法：1、直接測(cè)定法利用顯微鏡或電子微粒計(jì)數(shù)器可直接計(jì)數(shù)完整細(xì)胞量，所以可用于破碎前細(xì)胞計(jì)量?？墒瞧扑檫^(guò)程中所釋放物質(zhì)如DNA和其它聚合物組分會(huì)干擾計(jì)數(shù)，此時(shí)可采取染色法把破碎細(xì)胞從未損害完整細(xì)胞中區(qū)分開(kāi)來(lái)，方便于計(jì)數(shù)。比如，破碎革蘭氏陽(yáng)性菌?？扇旧筛锾m氏陰性菌顏色，利用革蘭氏染色法未受損害酵母細(xì)胞展現(xiàn)紫色，而受損害酵母細(xì)胞展現(xiàn)亮紅色。＝＝＝＝第24頁(yè)2、測(cè)定釋放蛋白質(zhì)量或酶活力細(xì)胞破碎后，測(cè)定懸浮液中細(xì)胞內(nèi)含物增量來(lái)估算破碎率。通常將破碎后細(xì)胞懸浮液離心，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量或酶活力，并與所取得標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值直接比較。3、測(cè)定導(dǎo)電率利用破碎前后導(dǎo)電率改變來(lái)測(cè)定破碎程度快速方法。導(dǎo)電率改變是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)含物被釋放到水相中而引發(fā)。導(dǎo)電率伴隨破碎率增加而呈線性增加。因?yàn)閷?dǎo)電率讀數(shù)取決于微生物種類(lèi)、處理?xiàng)l件、細(xì)胞濃度、溫度和懸浮液中電解質(zhì)含量，所以，應(yīng)預(yù)先采取其它方法來(lái)進(jìn)行標(biāo)化。第25頁(yè)四、