性激素結(jié)合球蛋白基因Asp327Asn多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性研究摘要目的：研究中國漢族人群性激素結(jié)合球蛋白（Sexhormone-bindingglobulin,SHBG）基因Asp327Asn多態(tài)性與2型糖尿?。═ype2diabetesmellitus,T2DM）發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系。方法：應(yīng)用限制性片段長度多態(tài)性（Polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP）方法，對599例重慶及周邊地區(qū)漢族人群（T2DM患者248例、正常對照351例）Asp327Asn進(jìn)行基因分型。用穩(wěn)態(tài)模型（Homeostaticmodelassessment,HOMA）評估胰島素抵抗（HOMA-IR）和胰島β細(xì)胞功能（HOMA-B）。結(jié)果：Asn等位基因的分布頻率T2DM組低于正常對照組（分別為14.5%、20.1%）；與Asp等位基因攜帶者相比，Asn等位基因攜帶者患T2DM的風(fēng)險顯著降低（OR=0.62,95%CI為0.42~0.91,P=0.016）。結(jié)論：SHBG基因Asp327Asn位點(diǎn)Asn等位基因可能與低T2DM患病風(fēng)險相關(guān)。關(guān)鍵詞單核苷酸多態(tài)性；性激素結(jié)合球蛋白；2型糖尿??；相關(guān)性研究一、引言2型糖尿?。═ype2diabetesmellitus,T2DM）是一種常見的代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受遺傳和環(huán)境等多種因素的綜合影響。近年來，隨著人們生活方式的改變和老齡化進(jìn)程的加速，T2DM的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈顯著上升趨勢，給社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。深入探究T2DM的遺傳易感因素，對于早期預(yù)防、精準(zhǔn)診斷和個性化治療具有重要意義。性激素結(jié)合球蛋白（Sexhormone-bindingglobulin,SHBG）是一種主要由肝臟合成和分泌的糖蛋白，在人體多個組織如睪丸、腦、卵巢、胎盤、子宮內(nèi)膜和乳腺癌組織中也有基因表達(dá)。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，SHBG主要作用是結(jié)合循環(huán)中的類固醇激素，特別是雄激素和雌激素，通過調(diào)節(jié)性激素的生物可利用度在體內(nèi)發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)。大量研究表明，性激素代謝失衡與T2DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，雄激素和雌激素可通過多種途徑影響胰島素的敏感性、胰島β細(xì)胞的功能以及糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)。而SHBG作為性激素的重要載體蛋白，其水平或功能的改變可能間接影響T2DM的發(fā)病風(fēng)險。在SHBG基因中，Asp327Asn位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性，該位點(diǎn)的堿基變異可能導(dǎo)致SHBG的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，進(jìn)而影響其對性激素的結(jié)合能力及后續(xù)生物學(xué)效應(yīng)，最終影響T2DM的發(fā)病風(fēng)險。然而，目前關(guān)于SHBG基因Asp327Asn多態(tài)性與中國漢族人群T2DM發(fā)病風(fēng)險之間關(guān)系的研究尚存在爭議，相關(guān)機(jī)制也有待進(jìn)一步明確。因此，本研究旨在探討中國漢族人群中SHBG基因Asp327Asn多態(tài)性與T2DM發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系，為T2DM的遺傳病因?qū)W研究提供新的線索和理論依據(jù)。二、對象與方法2.1研究對象選取2010年1月至2011年6月期間，在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的248例T2DM患者作為病例組。所有患者均符合1999年世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)：即空腹血糖≥7.0mmol/L，或餐后2小時血糖≥11.1mmol/L，或有典型糖尿病癥狀且隨機(jī)血糖≥11.1mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)為：1型糖尿病、妊娠糖尿病、特殊類型糖尿??；患有嚴(yán)重的心、肝、腎等重要臟器功能障礙；近3個月內(nèi)使用過影響糖代謝或性激素水平的藥物；患有惡性腫瘤、自身免疫性疾病等其他嚴(yán)重疾病。同時，選取同期在我院進(jìn)行健康體檢的351例漢族人群作為正常對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)為：空腹血糖<6.1mmol/L，餐后2小時血糖<7.8mmol/L，且無糖尿病家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。所有研究對象均為重慶及周邊地區(qū)的漢族常住居民，年齡在18-70歲之間，且簽署了知情同意書。2.2研究方法2.2.1標(biāo)本采集所有研究對象均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血5ml，其中2ml置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的試管中，用于基因組DNA的提?。涣硗?ml置于普通試管中，3000r/min離心10min，分離血清，用于檢測空腹血糖（Fastingbloodglucose,FBG）、空腹胰島素（Fastinginsulin,FINS）、總膽固醇（Totalcholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、高密度脂蛋白膽固醇（Highdensitylipoproteincholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（Lowdensitylipoproteincholesterol,LDL-C）、性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）等生化指標(biāo)。2.2.2DNA提取采用酚-氯仿法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。具體步驟如下：將EDTA抗凝全血與紅細(xì)胞裂解液按1:5的比例混合，顛倒混勻，室溫靜置10min，使紅細(xì)胞充分裂解。4000r/min離心10min，棄上清，收集白細(xì)胞沉淀。向白細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞核裂解液和蛋白酶K，55℃水浴消化過夜。次日，加入等體積的飽和酚，輕輕顛倒混勻10min，4000r/min離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。重復(fù)酚抽提一次，然后加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）混合液，顛倒混勻10min，4000r/min離心10min，再次將上層水相轉(zhuǎn)移至新管。加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕輕顛倒混勻，可見白色絮狀DNA沉淀析出。12000r/min離心10min，棄上清，用75%乙醇洗滌DNA沉淀2次，室溫晾干后，加入適量的TE緩沖液溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3SHBG基因Asp327Asn多態(tài)性檢測采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（Polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP）技術(shù)對SHBG基因Asp327Asn位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。根據(jù)GenBank中SHBG基因序列（登錄號：NM_000343），使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物。上游引物：5'-CTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，擴(kuò)增片段長度為250bp。PCR反應(yīng)體系為25μl，包括10×PCR緩沖液2.5μl，2.5mmol/LdNTPs2μl，上下游引物各0.5μl（10μmol/L），TaqDNA聚合酶0.2μl（5U/μl），模板DNA1μl（約50ng），用雙蒸水補(bǔ)足至25μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察擴(kuò)增條帶是否清晰、特異。取5μlPCR產(chǎn)物，加入10U的限制性內(nèi)切酶NcoI，37℃水浴酶切過夜。酶切產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠（EB）染色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照。根據(jù)酶切片段長度判斷基因型：若出現(xiàn)250bp單一未酶切條帶，為純合野生型（Asp/Asp）；若出現(xiàn)190bp和60bp兩條酶切條帶，為純合突變型（Asn/Asn）；若同時出現(xiàn)250bp、190bp和60bp三條條帶，則為雜合突變型（Asp/Asn）。為確?；蚍中徒Y(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選取10%的樣本進(jìn)行重復(fù)檢測，并由兩位獨(dú)立的研究者分別對結(jié)果進(jìn)行判讀，不一致的結(jié)果經(jīng)重新檢測后確定。2.2.4生化指標(biāo)檢測采用全自動生化分析儀（Hitachi7600）檢測血清FBG、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平。其中，F(xiàn)BG采用葡萄糖氧化酶法測定，TC采用膽固醇氧化酶法測定，TG采用甘油磷酸氧化酶法測定，HDL-C和LDL-C采用直接法測定。血清FINS水平采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測定，試劑盒購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。血清SHBG水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定，試劑盒購自美國R&DSystems公司，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。2.2.5胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能評估采用穩(wěn)態(tài)模型評估法（Homeostaticmodelassessment,HOMA）計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和胰島β細(xì)胞功能指數(shù)（HOMA-β）。計算公式如下：HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5；HOMA-β=20×FINS（mU/L）/[FBG（mmol/L）-3.5]。2.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。Hardy-Weinberg平衡檢驗用于判斷研究對象群體是否具有代表性。采用非條件logistic回歸模型分析SHBG基因Asp327Asn多態(tài)性與T2DM發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系，計算比值比（Oddsratio,OR）及其95%置信區(qū)間（Confidenceinterval,CI），并對年齡、性別、BMI、血壓、血脂等可能的混雜因素進(jìn)行校正。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。三、研究結(jié)果3.1研究對象的一般臨床資料病例組和對照組在年齡、性別構(gòu)成上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。與對照組相比，病例組的BMI、FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P<0.01），而HDL-C和SHBG水平顯著降低（P<0.01）。具體數(shù)據(jù)見表1。指標(biāo)病例組（n=248）對照組（n=351）t/χ2P年齡（歲）52.3±10.550.8±9.81.7840.075性別（男/女，例）136/112185/1660.1470.701BMI（kg/m2）26.5±3.223.8±2.510.432<0.001FBG（mmol/L）9.6±2.15.1±0.632.741<0.001FINS（mU/L）15.8±5.68.2±3.118.752<0.001HOMA-IR3.5±1.21.5±0.622.347<0.001HOMA-β68.5±25.692.4±30.5-8.563<0.001TC（mmol/L）5.8±1.04.9±0.811.325<0.001TG（mmol/L）2.2±0.81.4±0.613.576<0.001HDL-C（mmol/L）1.0±0.21.3±0.3-13.641<0.001LDL-C（mmol/L）3.6±0.92.8±0.711.894<0.001SHBG（nmol/L）20.5±8.635.2±12.3-16.345<0.0013.2SHBG基因Asp327Asn多態(tài)性分布對照組中，Asp/Asp、Asp/Asn、Asn/Asn基因型頻率分別為63.0%、30.5%、6.5%，Asn等位基因頻率為20.1%；病例組中，Asp/Asp、Asp/Asn、Asn/Asn基因型頻率分別為74.6%、23.4%、2.0%，Asn等位基因頻率為14.5%。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，對照組和病例組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），表明研究對象群體具有代表性。兩組間基因型分布和等位基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.254，P=0.010；χ2=6.025，P=0.014）。具體數(shù)據(jù)見表2。基因型/等位基因病例組（n=248）對照組（n=351）χ2PAsp/Asp（例，%）185（74.6）221（63.0）--Asp/Asn（例，%）58（23.4）107（30.5）9.2540.010Asn/Asn（例，%）5（2.0）23（6.5）--Asn等位基因頻率（%）14.520.16.0250.0143.3SHBG基因Asp327Asn多態(tài)性與T2DM發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系以Asp/Asp基因型為參照，非條件logistic回歸分析結(jié)果顯示，校正年齡、性別、BMI、血壓、血脂等混雜因素后，Asp/Asn基因型攜帶者患T2DM的風(fēng)險與Asp/Asp基因型攜帶者相比無顯著差異（OR=1.18，95%CI：0.82-1.70，P=0.374）；Asn/Asn基因型攜帶者患T2DM的風(fēng)險顯著降低（OR=0.32，95%CI：0.12-0.85，P=0.023）。進(jìn)一步將Asn等位基因攜帶者（Asp/Asn+Asn/Asn）與Asp等位基因攜帶者（Asp/Asp）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)Asn等位基因攜帶者患T2DM的風(fēng)險顯著降低（OR=0.62，95%CI：0.42-