檢驗(yàn)科人才PCR技術(shù)試卷與答案一、單選題（每題2分，共30分）1.PCR技術(shù)的基本反應(yīng)步驟不包括（）A.變性B.退火C.延伸D.連接答案：D解析：PCR技術(shù)的基本反應(yīng)步驟包括變性、退火和延伸，連接不是PCR的基本反應(yīng)步驟。變性是使雙鏈DNA解開成單鏈；退火是引物與單鏈DNA模板結(jié)合；延伸是在DNA聚合酶作用下合成新的DNA鏈。2.在PCR反應(yīng)中，引物的作用是（）A.提供模板B.提供3'-OH末端，供DNA聚合酶延伸C.提供5'-OH末端，供DNA聚合酶延伸D.激活DNA聚合酶答案：B解析：引物是一小段單鏈DNA或RNA，它能與模板DNA互補(bǔ)配對(duì)，為DNA聚合酶提供3'-OH末端，使DNA聚合酶能夠從這個(gè)末端開始延伸合成新的DNA鏈。3.PCR反應(yīng)中，TaqDNA聚合酶的最適溫度是（）A.55℃B.72℃C.94℃D.60℃答案：B解析：TaqDNA聚合酶是一種耐熱的DNA聚合酶，其最適溫度約為72℃，在這個(gè)溫度下它具有較高的活性，能夠高效地催化DNA鏈的延伸。4.以下哪種物質(zhì)不是PCR反應(yīng)體系的必需成分（）A.dNTPB.引物C.模板DNAD.連接酶答案：D解析：PCR反應(yīng)體系的必需成分包括模板DNA、引物、dNTP（脫氧核苷三磷酸）、DNA聚合酶和緩沖液等。連接酶主要用于連接DNA片段，不是PCR反應(yīng)體系的必需成分。5.PCR反應(yīng)中，變性溫度一般為（）A.55℃B.72℃C.94℃D.60℃答案：C解析：變性溫度通常為94℃左右，在這個(gè)溫度下，雙鏈DNA分子的氫鍵斷裂，解開成單鏈，為后續(xù)引物的結(jié)合和DNA聚合酶的延伸提供模板。6.引物設(shè)計(jì)時(shí)，引物的長(zhǎng)度一般為（）A.510bpB.1530bpC.3050bpD.50100bp答案：B解析：引物長(zhǎng)度一般在1530bp之間。引物過短，特異性較差，容易與非目標(biāo)序列結(jié)合；引物過長(zhǎng)，合成成本增加，且可能導(dǎo)致退火效率降低。7.在PCR反應(yīng)中，循環(huán)次數(shù)一般為（）A.510次B.1020次C.2535次D.4050次答案：C解析：循環(huán)次數(shù)一般設(shè)置為2535次。循環(huán)次數(shù)過少，擴(kuò)增產(chǎn)物量不足；循環(huán)次數(shù)過多，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加，同時(shí)也會(huì)增加實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本。8.以下關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的描述，錯(cuò)誤的是（）A.可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)B.不需要引物C.可以定量檢測(cè)核酸的起始量D.常用的熒光標(biāo)記方法有SYBRGreenI法和TaqMan探針法答案：B解析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR同樣需要引物。它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)來實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的定量分析。常用的熒光標(biāo)記方法有SYBRGreenI法和TaqMan探針法，能夠定量檢測(cè)核酸的起始量。9.SYBRGreenI法實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，SYBRGreenI能與（）結(jié)合。A.雙鏈DNAB.單鏈DNAC.RNAD.蛋白質(zhì)答案：A解析：SYBRGreenI是一種熒光染料，它能與雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合后熒光信號(hào)增強(qiáng)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以反映雙鏈DNA的擴(kuò)增情況。10.TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，TaqMan探針的5'端標(biāo)記（），3'端標(biāo)記（）。A.熒光報(bào)告基團(tuán)，熒光淬滅基團(tuán)B.熒光淬滅基團(tuán)，熒光報(bào)告基團(tuán)C.放射性標(biāo)記物，熒光標(biāo)記物D.生物素，地高辛答案：A解析：TaqMan探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光被淬滅基團(tuán)吸收；在PCR延伸過程中，TaqDNA聚合酶的5'-3'外切酶活性將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)釋放，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的監(jiān)測(cè)。11.逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）的第一步是（）A.以RNA為模板合成cDNAB.以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增C.提取RNAD.設(shè)計(jì)引物答案：A解析：逆轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）首先要以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，然后再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。12.多重PCR是指（）A.在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶序列B.進(jìn)行多次PCR反應(yīng)C.使用多種DNA聚合酶進(jìn)行PCRD.使用多種引物進(jìn)行PCR答案：A解析：多重PCR是在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶序列，可用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因或病原體等。13.巢式PCR與普通PCR相比，其優(yōu)點(diǎn)是（）A.靈敏度更高B.特異性更強(qiáng)C.擴(kuò)增效率更高D.以上都是答案：D解析：巢式PCR采用兩對(duì)引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。第一輪使用外引物進(jìn)行擴(kuò)增，第二輪使用內(nèi)引物對(duì)第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行再次擴(kuò)增。這樣可以提高擴(kuò)增的靈敏度、特異性和效率，減少非特異性擴(kuò)增的影響。14.PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法不包括（）A.瓊脂糖凝膠電泳B.聚丙烯酰胺凝膠電泳C.測(cè)序D.免疫印跡法答案：D解析：PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、測(cè)序等。免疫印跡法主要用于檢測(cè)蛋白質(zhì)，不是PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法。15.在PCR實(shí)驗(yàn)中，為了防止交叉污染，以下做法錯(cuò)誤的是（）A.使用一次性吸頭B.在不同的區(qū)域進(jìn)行試劑準(zhǔn)備、樣本處理和PCR擴(kuò)增C.定期對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行清潔和消毒D.多人共用一套移液器答案：D解析：為防止交叉污染，應(yīng)使用一次性吸頭，在不同區(qū)域進(jìn)行試劑準(zhǔn)備、樣本處理和PCR擴(kuò)增，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備進(jìn)行清潔和消毒。多人共用一套移液器容易導(dǎo)致樣本之間的交叉污染，是錯(cuò)誤的做法。二、多選題（每題3分，共30分）1.PCR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域包括（）A.基因克隆B.疾病診斷C.親子鑒定D.物種鑒定答案：ABCD解析：PCR技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。在基因克隆中，可用于擴(kuò)增目的基因；在疾病診斷方面，可檢測(cè)病原體、基因突變等；親子鑒定通過擴(kuò)增特定的基因片段進(jìn)行比對(duì)；物種鑒定可通過擴(kuò)增物種特異性的基因序列來實(shí)現(xiàn)。2.影響PCR反應(yīng)特異性的因素有（）A.引物的特異性B.退火溫度C.鎂離子濃度D.循環(huán)次數(shù)答案：ABC解析：引物的特異性直接影響PCR反應(yīng)能否準(zhǔn)確擴(kuò)增目標(biāo)序列；退火溫度過高或過低都會(huì)影響引物與模板的結(jié)合特異性；鎂離子濃度會(huì)影響DNA聚合酶的活性和引物與模板的結(jié)合，從而影響反應(yīng)特異性。循環(huán)次數(shù)主要影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量，對(duì)反應(yīng)特異性影響較小。3.以下關(guān)于PCR反應(yīng)體系中dNTP的描述，正確的是（）A.包括dATP、dTTP、dCTP和dGTPB.提供合成DNA的原料C.濃度過高可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增D.濃度過低會(huì)影響擴(kuò)增效率答案：ABCD解析：dNTP包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP，是合成DNA的原料。dNTP濃度過高，可能會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的幾率；濃度過低，會(huì)使DNA聚合酶缺乏足夠的底物，影響擴(kuò)增效率。4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的定量方法有（）A.絕對(duì)定量B.相對(duì)定量C.終點(diǎn)定量D.內(nèi)參定量答案：AB解析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的定量方法有絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量是通過已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，來確定樣本中核酸的絕對(duì)含量；相對(duì)定量是比較不同樣本中目的基因的表達(dá)差異。終點(diǎn)定量不是實(shí)時(shí)熒光定量PCR的常用定量方法；內(nèi)參定量是相對(duì)定量中常用的一種策略，用于校正樣本間的加樣誤差等，但不是一種獨(dú)立的定量方法。5.逆轉(zhuǎn)錄酶的作用包括（）A.以RNA為模板合成cDNAB.具有RNaseH活性，可降解RNADNA雜交體中的RNAC.具有DNA聚合酶活性，可合成雙鏈DNAD.具有連接酶活性，可連接DNA片段答案：ABC解析：逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成cDNA，同時(shí)具有RNaseH活性，可降解RNADNA雜交體中的RNA，還具有DNA聚合酶活性，可進(jìn)一步合成雙鏈DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶不具有連接酶活性。6.多重PCR設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意的問題有（）A.引物之間不能形成引物二聚體B.各對(duì)引物的退火溫度應(yīng)盡量相近C.引物的長(zhǎng)度應(yīng)盡量一致D.避免引物與非目標(biāo)序列結(jié)合答案：ABCD解析：在多重PCR引物設(shè)計(jì)中，引物之間不能形成引物二聚體，否則會(huì)影響擴(kuò)增效率和特異性；各對(duì)引物的退火溫度應(yīng)盡量相近，以便在同一退火條件下都能有效結(jié)合模板；引物長(zhǎng)度盡量一致有助于保證擴(kuò)增效率的一致性；同時(shí)要避免引物與非目標(biāo)序列結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性。7.巢式PCR中，內(nèi)引物和外引物的關(guān)系是（）A.內(nèi)引物位于外引物的內(nèi)側(cè)B.內(nèi)引物和外引物的序列不同C.外引物先進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)引物再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增D.內(nèi)引物的擴(kuò)增效率高于外引物答案：ABC解析：巢式PCR中，內(nèi)引物位于外引物的內(nèi)側(cè)，二者序列不同。先使用外引物進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，然后以第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用內(nèi)引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。內(nèi)引物和外引物的擴(kuò)增效率并沒有絕對(duì)的高低之分。8.PCR產(chǎn)物的純化方法有（）A.凝膠回收法B.柱純化法C.乙醇沉淀法D.酚氯仿抽提法答案：ABCD解析：PCR產(chǎn)物的純化方法有多種。凝膠回收法是通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，然后從凝膠中切下目標(biāo)條帶進(jìn)行回收；柱純化法利用硅膠柱等對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行吸附和洗脫；乙醇沉淀法通過加入乙醇使PCR產(chǎn)物沉淀下來；酚氯仿抽提法可去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的純化。9.在PCR實(shí)驗(yàn)中，可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果的原因有（）A.樣本交叉污染B.引物特異性差C.實(shí)驗(yàn)環(huán)境中有殘留的PCR產(chǎn)物D.模板DNA中存在非目標(biāo)序列的同源序列答案：ABCD解析：樣本交叉污染會(huì)使其他樣本的DNA混入當(dāng)前樣本，導(dǎo)致假陽性；引物特異性差會(huì)與非目標(biāo)序列結(jié)合并擴(kuò)增；實(shí)驗(yàn)環(huán)境中有殘留的PCR產(chǎn)物，可能會(huì)污染新的反應(yīng)體系；模板DNA中存在非目標(biāo)序列的同源序列，引物可能會(huì)與之結(jié)合并擴(kuò)增，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果。10.以下關(guān)于PCR技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)的描述，正確的是（）A.向高通量、自動(dòng)化方向發(fā)展B.與其他技術(shù)的結(jié)合越來越緊密C.檢測(cè)靈敏度和特異性不斷提高D.應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展答案：ABCD解析：PCR技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)包括向高通量、自動(dòng)化方向發(fā)展，以提高檢測(cè)效率和減少人為誤差；與其他技術(shù)如測(cè)序技術(shù)、芯片技術(shù)等結(jié)合越來越緊密，實(shí)現(xiàn)更全面、準(zhǔn)確的分析；檢測(cè)靈敏度和特異性不斷提高，能夠檢測(cè)到更低含量的目標(biāo)核酸；應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷拓展，如在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品檢測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。三、簡(jiǎn)答題（每題10分，共30分）1.簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的基本原理。答：PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其基本原理是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的過程，在體外特定條件下，通過酶促反應(yīng)快速擴(kuò)增特定DNA片段。具體如下：（1）變性：將反應(yīng)體系加熱至94℃左右，使雙鏈DNA模板的氫鍵斷裂，解開成單鏈DNA，為后續(xù)引物的結(jié)合提供模板。（2）退火：將溫度降低至引物的退火溫度（一般為5565℃），引物與單鏈DNA模板互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。（3）延伸：將溫度升高至72℃左右，在DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3'-OH末端開始，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。這三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，DNA模板的數(shù)量大約增加一倍。經(jīng)過2535個(gè)循環(huán)后，可使目標(biāo)DNA片段得到大量擴(kuò)增。2.簡(jiǎn)述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理和優(yōu)點(diǎn)。答：原理：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)來實(shí)現(xiàn)對(duì)PCR產(chǎn)物的定量分析。常用的熒光標(biāo)記方法有SYBRGreenI法和TaqMan探針法。SYBRGreenI法：SYBRGreenI是一種熒光染料，能與雙鏈DNA結(jié)合，結(jié)合后熒光信號(hào)增強(qiáng)。在PCR擴(kuò)增過程中，隨著雙鏈DNA的增加，SYBRGreenI結(jié)合的量也增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以反映雙鏈DNA的擴(kuò)增情況。TaqMan探針法：TaqMan探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光被淬滅基團(tuán)吸收；在PCR延伸過程中，TaqDNA聚合酶的5'-3'外切酶活性將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)釋放，通過檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增。優(yōu)點(diǎn)：（1）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)：可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程，無需在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行電泳等后續(xù)檢測(cè)，節(jié)省時(shí)間。（2）定量準(zhǔn)確：能夠準(zhǔn)確地定量檢測(cè)核酸的起始量，可用于基因表達(dá)分析、病原體定量檢測(cè)等。（3）靈敏度高：可以檢測(cè)到低含量的目標(biāo)核酸。（4）特異性強(qiáng)：通過設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，能夠有效區(qū)分目標(biāo)序列和非目標(biāo)序列。（5）污染風(fēng)險(xiǎn)低：采用閉管檢測(cè)，減少了PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)。3.簡(jiǎn)述PCR實(shí)驗(yàn)中常見的問題及解決方法。答：（1）無擴(kuò)增產(chǎn)物原因：模板DNA質(zhì)量不佳、引物設(shè)計(jì)不合理、DNA聚合酶活性低、dNTP濃度過低、循環(huán)參數(shù)設(shè)置不當(dāng)?shù)?。解決方法：重新提取高質(zhì)量的模板DNA；重新設(shè)計(jì)引物，確保引物的特異性和退火溫度合適；更換活性高的DNA聚合酶；調(diào)整dNTP濃度至合適范圍；優(yōu)化循環(huán)參數(shù)，如調(diào)整變性、退火和延伸溫度及時(shí)間。（2）非特異性擴(kuò)增原因：引物特異性差、退火溫度過低、鎂離子濃度過高、循環(huán)次數(shù)過多等。解決方法：重新設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的引物；適當(dāng)提高退火溫度；調(diào)整鎂離子濃度；減少循環(huán)次數(shù)。（3）引物二聚體原因：引物之間互補(bǔ)配對(duì)形成引物二聚體。解決方法：重新設(shè)計(jì)引物，避免引物之間存在互補(bǔ)序列；適當(dāng)提高退火溫度；降低引物濃度。（4）假陽性結(jié)果原因：樣本交叉污染、實(shí)驗(yàn)環(huán)境中有殘留的PCR產(chǎn)物、引物特異性差等。解決方法：嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，使用一次性吸頭，在不同區(qū)域進(jìn)行試劑準(zhǔn)備、樣本處理和PCR擴(kuò)增；對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行清潔和消毒，防止殘留的PCR產(chǎn)物污染；重新設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的引物。（5）假陰性結(jié)果原因：模板DNA中目標(biāo)核酸含量過低、抑制劑存在、PCR反應(yīng)體系中成分失效等。解決方法：增加模板DNA的用量；去除模板DNA中的抑制劑，如采用純化方法；更換新鮮有效的PCR反應(yīng)體系成分，如DNA聚合酶、dNTP等。四、論述題（10分）論述PCR技術(shù)在疾病診斷中的應(yīng)用及前景。答：PCR技術(shù)在疾病診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，并且前景十分廣闊。應(yīng)用1.病原體檢測(cè)病毒檢測(cè)：PCR技術(shù)可快速、靈敏地檢測(cè)各種病毒，如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）等。通過擴(kuò)增病毒的特定基因片段，能夠在感染早期檢測(cè)到病毒的存在，有助于及時(shí)診斷和治療。例如，在新冠疫情期間，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)成為新冠病毒核酸檢測(cè)的主要方法，為疫情防控提供了關(guān)鍵支持。細(xì)菌檢測(cè)：對(duì)于一些難以培養(yǎng)或培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的細(xì)菌，如結(jié)核桿菌，PCR技術(shù)可以直接從臨床樣本中擴(kuò)增其特異性基因，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了診斷效率。同時(shí)，還可以檢測(cè)細(xì)菌的耐藥基因，指導(dǎo)臨床合理使用抗生素。寄生蟲檢測(cè)：可用于檢測(cè)瘧原蟲、弓形蟲等寄生蟲感染。通過檢測(cè)寄生蟲的特定核酸序列，能夠準(zhǔn)確診斷寄生蟲病，尤其是在一些癥狀不典型的病例中，PCR技術(shù)具有重要的診斷價(jià)值。2.遺傳病診斷單基因遺傳病診斷：對(duì)于已知致病基因的單基因遺傳病，如地中海貧血、血友病等，PCR技術(shù)可以擴(kuò)增相關(guān)基因的特定區(qū)域，結(jié)合測(cè)序等技術(shù)，檢測(cè)基因突變，實(shí)現(xiàn)疾病的早期診斷和產(chǎn)前診斷。例如，通過對(duì)胎兒的羊水或絨毛樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，可以在孕期發(fā)現(xiàn)胎兒是否攜帶致病基因，為遺傳咨詢和生育決策提供依據(jù)。多基因遺傳病診斷：雖然多基因遺傳病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，但PCR技術(shù)可以用于檢測(cè)與疾病相關(guān)的多個(gè)基因位點(diǎn)的變異，評(píng)估個(gè)體患某種多基因遺傳病的風(fēng)險(xiǎn)，如心血管疾病、糖尿病等