目錄TOC\o"1-1"\t"標題2,1,標題3,1"\h210961緒論 538001.1研究背景 5322411.2研究目的及意義 5141051.3白色念珠菌 5238611.3.1白色念珠菌的概況 518801.3.2白色念珠菌的致病機理 6163761.3.3白色念珠菌的研究現(xiàn)狀 629951.4解淀粉芽孢桿菌 6142381.4.1解淀粉芽孢桿菌的研究現(xiàn)狀 6303861.4.2解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì) 7246802實驗材料和實驗方法 782302.1實驗材料 7218252.1.1實驗室菌種 7225562.1.2實驗主要藥品 8111222.1.3實驗設備和儀器 857432.2實驗方法 8318572.2.1培養(yǎng)基的制備 850362.2.3菌懸液制備 9306292.2.4解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵條件優(yōu)化 9323673結(jié)果分析 117323.1白色念珠菌 11226333.2解淀粉芽孢桿菌 11265503.3解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液 1283513.4解淀粉芽孢桿菌抑菌物質(zhì)鹽析液 12157223.6正交實驗結(jié)果 13237203.7最優(yōu)條件驗證實驗 15311014展望 15248314.1發(fā)酵條件對脂肽合成的調(diào)控機制 15100884.2脂肽抗白色念珠菌的作用特性與優(yōu)勢 15308704.3研究局限性與未來研究方向 1616015結(jié)論 1620047參考文獻 171253致謝 18摘要脂肽類化合物作為芽孢桿菌屬微生物合成的天然代謝產(chǎn)物，通過破壞真菌細胞膜脂質(zhì)雙層、誘導胞內(nèi)物質(zhì)泄漏發(fā)揮抗菌作用，對多重耐藥菌株（包括氟康唑耐藥白色念珠菌）顯示出獨特優(yōu)勢，其中解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）因具備安全級（GRAS）屬性及高效產(chǎn)脂肽能力，成為該領(lǐng)域的研究熱點。本研究通過三因素三水平正交試驗（溫度28–37℃、發(fā)酵時間24–48h、轉(zhuǎn)速180–250r/min），對解淀粉芽孢桿菌HY-1產(chǎn)脂肽的發(fā)酵條件進行優(yōu)化,以抑菌圈直徑為響應指標，結(jié)合方差分析（ANOVA）篩選關(guān)鍵影響因子。結(jié)果表明，發(fā)酵時間（F=404.24，P<0.001）和溫度（F=110.67，P<0.01）對脂肽產(chǎn)量具有極顯著影響，而轉(zhuǎn)速影響不顯著（P=0.198）。經(jīng)條件優(yōu)化與驗證，確定最佳工藝參數(shù)為30℃、48h、180r/min。此時抑菌圈直徑達26mm,代表著優(yōu)化后受脂肽對白色念珠菌具有顯著的抗菌效能。關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌，脂肽，白色念珠菌，發(fā)酵優(yōu)化AbstractLipopeptidecompounds,asendogenousmetabolitesgeneratedbyBacillusmicroorganisms,exhibitantimicrobialactivitiesthroughdisruptingthelipidbilayeroffungalcellmembranesandtriggeringintracellularsubstanceefflux.Theyexhibituniqueadvantagesagainstmultidrug-resistantstrains,includingFluconazole-resistantCandidaalbicans.Amongthem,Bacillusamyloliquefaciens,withitsGRAS(GenerallyRecognizedAsSafe)statusandhigh-efficiencylipopeptide-producingcapability,hasbecomearesearchhotspotinthisfield.ThisstudyoptimizedthefermentationconditionsforlipopeptideproductionbyB.amyloliquefaciensHY-1throughathree-factorthree-levelorthogonaltest(temperature:28–37°C,fermentationtime:24–48h,rotationspeed:180–250r/min),usingthediameteroftheinhibitionzoneastheresponseindexandcombininganalysisofvariance(ANOVA)toscreenkeyinfluencingfactors.Theresultsshowedthatfermentationtime(F=404.24,P<0.001)andtemperature(F=110.67,P<0.01)hadextremelysignificanteffectsonlipopeptideyield,whilerotationspeedhadnosignificanteffect(P=0.198).Throughconditionoptimizationandverification,theoptimalprocessparametersweredeterminedas30°C,48h,and180r/min.Undertheseconditions,theinhibitionzonediameterreached26mm,indicatingthattheoptimizedlipopeptidehassignificantantibacterialefficacyagainstCandidaalbicans.Keywords:Bacillusamyloliquefaciens;lipopeptide;Candidaalbicans;fermentationoptimization1緒論1.1研究背景近年來，全球范圍內(nèi)微生物耐藥性危機日益嚴峻，尤其是白色念珠菌（Candidaalbicans）對臨床一線抗真菌藥物（如氟康唑、伊曲康唑）的耐藥率持續(xù)攀升，且生物膜形成能力進一步增強其對抗菌藥物的耐受性，導致感染反復發(fā)作，成為免疫缺陷患者死亡的主要原因之一。所以開發(fā)出新型抗真菌劑已成為全球公共衛(wèi)生的迫切需求。白色念珠菌又名白假絲酵母菌，是一種機會性致病真菌，主要在人體胃腸道和泌尿生殖道內(nèi)繁殖[1]，可引發(fā)多種感染性疾病，包括鵝口瘡、陰道炎等淺表黏膜感染，以及血流感染、腦膜炎等深部系統(tǒng)性感染。白色念珠菌是導致免疫缺陷患者感染的重要病原菌，與患者死亡率密切相關(guān)。近年來臨床監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，該菌對氟康唑、伊曲康唑等唑類抗真菌藥物的耐藥性不斷上升，研究表明其對氟康唑耐藥率達8.6%，對伊曲康唑和伏立康唑耐藥率都超過了20.0%。而白色念珠菌形成生物膜的能力使其對多數(shù)抗真菌藥物產(chǎn)生固有抗性[5]，進一步增強藥物耐受性，導致感染反復不愈。前期研究已證實，解淀粉芽孢桿菌HY-1能夠產(chǎn)生具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物，經(jīng)鑒定其成分屬于脂肽類化合物[6]。脂肽類化合物是芽孢桿菌屬微生物合成的天然表面活性物質(zhì)，主要有表面活性素、伊枯草菌素和豐原素等。文獻表明芽孢桿菌產(chǎn)生的抗真菌成分主要為脂肽類和蛋白類[7]，其中表面活性素、伊枯草菌素和豐原素等，因為廣譜抗真菌活性和良好穩(wěn)定性受到關(guān)注[8]。本研究選用解淀粉芽孢桿菌HY-1作為脂肽生產(chǎn)菌株，系統(tǒng)優(yōu)化溫度、發(fā)酵時間和轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件，探究其對脂肽產(chǎn)量的影響，以白色念珠菌為指示菌株，通過抑菌圈直徑評價發(fā)酵產(chǎn)物抗真菌活性，為天然抗真菌制劑工業(yè)化生產(chǎn)提供關(guān)鍵工藝參數(shù)。1.2研究目的及意義本研究以解淀粉芽孢桿菌HY-1為產(chǎn)脂肽菌株，通過優(yōu)化發(fā)酵條件提高脂肽產(chǎn)量和活性，增強抑菌效果，提升抑菌物質(zhì)產(chǎn)量來提高應用價值。優(yōu)化后的工藝組合能在保證較大抑菌圈直徑的同時，降低轉(zhuǎn)速可以減少30%能耗，顯著提升工業(yè)化生產(chǎn)的成本效益，推動多領(lǐng)域抗菌產(chǎn)品開發(fā)。在臨床醫(yī)學領(lǐng)域，可根據(jù)該成果開發(fā)陰道栓劑、口腔凝膠等局部抗真菌制劑，用于治療白色念珠菌引發(fā)的黏膜感染，避免傳統(tǒng)唑類藥物的肝毒性和耐藥性問題。農(nóng)業(yè)植保方面，利用解淀粉芽孢桿菌公認安全（GRAS）的特性，制備生物農(nóng)藥用于果蔬采后抑菌，減少化學農(nóng)藥殘留，符合全球“減抗替抗”發(fā)展趨勢。在畜牧養(yǎng)殖與食品生產(chǎn)領(lǐng)域，脂肽作為生物源抗菌劑可有效替代抗生素，降低藥物殘留對生態(tài)環(huán)境的污染，符合我國“十四五”規(guī)劃中“推動綠色生物制造”的戰(zhàn)略導向，具有顯著的社會經(jīng)濟效益與生態(tài)保護意義。并且可以應對真菌耐藥性公共衛(wèi)生危機，針對白色念珠菌對臨床藥物耐藥率攀升的現(xiàn)狀，本研究開發(fā)的天然脂肽通過獨特膜損傷機制發(fā)揮作用，為解決“超級真菌”感染提供新途徑，有望減少臨床對抗真菌藥物的依賴，降低耐藥菌傳播風險。1.3白色念珠菌1.3.1白色念珠菌的概況白色念珠菌（C.albicans）是一種典型的機會性致病真菌，屬于廣泛定植于人體口腔、胃腸道及泌尿生殖道黏膜的念珠菌屬。該菌可突破宿主免疫屏障引發(fā)從淺表黏膜感染到深部系統(tǒng)性感染的多類型疾病。白色念珠菌的生長周期較短，為24-48小時?？梢栽谏呈掀咸烟黔傊⊿DA）培養(yǎng)基上形成肉眼可見的菌落。一般情況下白色念珠菌菌落顏色顯示為白色，在菌落分布上以絲狀分布[9],正面呈圓形，光滑濕潤邊緣整齊。背面顏色較淺呈淡黃色或無色，質(zhì)地均勻。目前臨床常見感染的藥物多烯類、棘白菌素類抗菌類，但由于這些藥物在臨床上長期大量使用、大劑量逐漸產(chǎn)生和加劇了白色念珠菌菌株的耐藥性，進而使藥物臨床治療效果明顯下降[10]。因此，在面臨攻克難治性念珠菌病難題，持續(xù)研發(fā)新型抗真菌制劑已成為重點研究方向。其中，脂肽類化合物、抗菌肽以及植物提取物等天然產(chǎn)物，在制造新型抗真菌劑領(lǐng)域，展現(xiàn)出重要的研究價值與應用潛力。1.3.2白色念珠菌的致病機理白色念珠菌的致病機理是其通過表面黏附蛋白（如Als家族、Hsp90）識別宿主細胞外基質(zhì)成分（如纖維連接蛋白、膠原蛋白）實現(xiàn)初始黏附定植，黏附到宿主的上皮細胞表面。當與宿主細胞接觸后,在適宜條件下由酵母態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性菌絲態(tài)，并且通過菌絲的機械穿透力及分泌的天冬氨酸蛋白酶（Saps）、磷脂酶等水解酶破壞宿主黏膜屏障，其中Saps可降解免疫球蛋白、補體及細胞外基質(zhì)蛋白以削弱免疫防御并提供營養(yǎng)，磷脂酶則通過損傷宿主細胞膜促進感染擴散。隨后,白色念珠菌在血管內(nèi)傳播,在內(nèi)皮細胞中不斷繁殖和滲透[11]。1.3.3白色念珠菌的研究現(xiàn)狀近年來抗白色念珠菌藥物研發(fā)中，人工合成化合物和天然小分子化合物因能抑制白色念珠菌生長和調(diào)控毒力因子，成為研究前沿。按作用機制這些化合物分兩類，其中之一可作單一藥物直接抗真菌感染，另外一種作增敏劑與常規(guī)抗真菌藥聯(lián)用應對耐藥[12-13]。當前，針對不同作用靶點進行設計的小分子天然產(chǎn)物和人工合成化合物是藥物耐藥性研究核心，其單獨使用或與傳統(tǒng)抗真菌藥一起使用，無論是單獨應用還是與傳統(tǒng)抗真菌藥物協(xié)同作用，在對抗白色念珠菌感染上都有顯著療效。這些小分子化合物不僅能抑制白色念珠菌增殖來降低菌株毒力，還可以通過干擾粘附阻斷生物膜形成，成熟和抑制菌絲[14]，來轉(zhuǎn)化發(fā)揮抗菌活性。1.4解淀粉芽孢桿菌1.4.1解淀粉芽孢桿菌的研究現(xiàn)狀在芽孢桿菌屬中，解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）是研究深入程度僅次于枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的脂肽產(chǎn)生菌[15-16]。多項基因組學研究表明，解淀粉芽孢桿菌含有編碼伊枯草菌素、芬原素、表面活性素等多種脂肽物質(zhì)的基因。解淀粉芽孢桿菌是公認的安全級（generallyrecognizedassafe，GRAS）菌株。解淀粉芽孢桿菌是很具潛力的微生物，在許多領(lǐng)域展現(xiàn)出應用價值和營養(yǎng)優(yōu)勢。農(nóng)業(yè)上它能抑制植物病原真菌，細菌，病毒，抵御線蟲。幫助植物提升產(chǎn)生抗菌抗病毒抗蟲能力來減少病蟲害[17]。在食品工業(yè)中被廣泛用于豆豉、日本納豆、韓國清國醬等傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)，既能改善風味，又能通過產(chǎn)酶提升食品營養(yǎng)價值和生物可利用性，還因產(chǎn)生抗菌物質(zhì)抑制腐敗菌和病原菌，實現(xiàn)控制。養(yǎng)殖方面因其在土壤和植物組織廣泛分布，繁殖快，芽孢結(jié)構(gòu)適應極端惡劣環(huán)境，被用于防治病原菌、動物生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖。目前相關(guān)研究從只有一個功能應用向多方面機制解析轉(zhuǎn)變，未來需深入探索其與宿主植物、環(huán)境因子的關(guān)系，結(jié)合人工智能和納米技術(shù)開發(fā)出高效工程的菌株，推進在綠色農(nóng)業(yè)、工業(yè)酶制劑和環(huán)境修復領(lǐng)域的規(guī)?；瘧?。1.4.2解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)解淀粉芽孢桿菌是重要的植物促生菌，能產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌和細菌生長活性的代謝物來有效抑制有害微生物，促進植物健康生長。其中這些代謝物包括了抑菌蛋白類、脂肽類、大環(huán)內(nèi)酯類、聚酮化合物以及肽類等[19]。（1）脂肽類脂肽是由芽孢桿菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有廣譜抑菌、低耐藥性、可生物降解、安全低毒的特性，被視為安全可靠的抑菌物質(zhì)。環(huán)脂肽是由非極性的脂肪酸鏈和極性的氨基酸肽鏈部分結(jié)合而成。其中,氨基酸肽鏈自身成環(huán)或者與部分脂肪酸鏈構(gòu)成成環(huán)[20]。Daptomycin是由玫瑰孢鏈霉菌解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的一種酸性環(huán)脂肽抗生素。Daptomycin對多重耐藥菌具有很好的防治效果，特別是革蘭氏陽性的多重耐藥菌[21]。Arrebola[22]等用正丁醇提取解淀粉芽孢桿菌PPCB004生成的總脂肽，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將正丁醇蒸發(fā)后，再用甲醇溶解脂肽。然后用薄層色譜和高效液相色譜研究其抑菌物質(zhì)的組成成分，其中以伊枯草菌素A為主。（2）抗菌蛋白類Kim[23]等從土壤中分離得到一株具有較強抗真菌活性的解淀粉芽孢桿菌MET0908，將真菌接種于PD培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)兩天，再接種PPCB004菌共培養(yǎng)，得到的共培養(yǎng)液離心收集無細胞濾液，加入30%硫酸銨飽和純化抗真菌蛋白，然后用以過濾層析，得到純化后的解淀粉芽孢桿菌MET0908產(chǎn)生的抗真菌蛋白，最后用SDS凝膠電泳測得純化后的蛋白質(zhì)的分子量為40kDa，該蛋白可作用于炭疽病病原菌lagenarium的細胞壁，達到防治炭疽病的效果，且該蛋白對多種植物病原真菌表現(xiàn)出廣譜抗真菌活性。（3）大環(huán)內(nèi)酯類楊橋[24]等從我國東海海泥中分離到一株可產(chǎn)大環(huán)內(nèi)酯抗生素Mac-rolactinA(MLA)的海洋細菌，經(jīng)多種鑒定確認并將其命名為解淀粉芽孢桿菌JY-863，將該菌株的活性物質(zhì)分離純化之后，進行結(jié)構(gòu)研究，以此確定了其主要成分為MLA。由解淀粉芽孢桿菌JY-863產(chǎn)生的抗生素在體外實驗中，對小鼠黑色素瘤細胞(B16-F10)具有顯著細胞毒性,可有效抑制哺乳動物I型和II型的單純皰疹病毒的復制及HIV在T淋巴細胞內(nèi)的復制等[25]。2實驗材料和實驗方法2.1實驗材料2.1.1實驗室菌種表1實驗菌種菌種名稱菌種來源BacillusAmyloliquefaciensHY-1解淀粉芽孢桿菌HY-1實驗室保存Candidaalbicans白色念珠菌實驗室保存2.1.2實驗主要藥品表2實驗室主要藥品藥品名稱生產(chǎn)廠家蛋白胨北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司酵母提取物成都市科隆化學品有限公司氯化鈉重慶川東化工有限公司葡萄糖成都市科隆化學品有限公司瓊脂廣州碩譜生物科技有限公司甲醇天津市康科德科技有限公司2.1.3實驗設備和儀器表3實驗設備和儀器設備名稱生產(chǎn)廠家自動壓力蒸汽滅菌鍋致微廈門儀器有限公司潔凈工作臺SW-CJ-1F蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司實驗室PH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司渦旋混合器QL-901其林貝爾儀器制造公司電熱鼓風干燥箱GZX-9076MBE上海博訊實業(yè)有限公司冷藏冷凍箱合肥美的榮事達電冰箱有限公司振蕩培養(yǎng)箱上海知楚儀器有限公司離心機湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司稱量臺蘇州一光儀器有限公司2.2實驗方法2.2.1培養(yǎng)基的制備（1）Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB):稱取胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl1g,瓊脂2g,加入100ml純水，攪拌均勻后121℃滅菌20min，保存?zhèn)溆?。制備LB液體培養(yǎng)基則不添加瓊脂。（2）沙氏培養(yǎng)基（SabouraudDextroseAgar,SDA）：用電子天平稱取2g蛋白胨，葡萄糖8g，4g瓊脂，量取200ml去離子水，分別加入250ml燒杯中混勻后，再分別裝入兩個500ml的錐形瓶中，在121℃，101kPa的條件下，滅菌20min。（用121℃滅菌時，需要將葡萄糖與蛋白胨分開裝再滅菌，滅菌完成后再在超凈臺中混勻）。（3）酵母膏胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基:胰蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、瓊脂20g溶解于1000ml蒸餾水中，分裝，115℃高壓滅菌15min。2.2.2試劑的配置配制0.5mol/L氫氧化鈉溶液：用電子天平（精度0.001g）稱取20.000g氫氧化鈉固體，放置于500mL燒杯中，加入約300mL超純水，攪拌至完全溶解并冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶，用超純水洗滌燒杯及玻璃棒3次，洗液并入容量瓶，定容至刻度線，搖勻后用橡膠塞密封，通過PH試紙標定濃度（酚酞指示劑，終點pH8.2–9.0），確保濃度誤差≤±0.01mol/L。配制0.1mol/L鹽酸溶液：在通風櫥中量取8.33mL濃鹽酸（分析純，濃度約12mol/L），緩慢注入盛有500mL超純水的燒杯中，冷卻后轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶，定容并搖勻，采用無水碳酸鈉基準物質(zhì)標定（甲基橙指示劑，終點pH3.1–4.4），調(diào)整濃度至0.100±0.005mol/L。全程需佩戴耐酸堿手套，氫氧化鈉配制需避免長時間暴露于空氣中以防潮解，鹽酸操作需注意揮發(fā)防護。2.2.3菌懸液制備解淀粉芽孢桿菌：取出實驗室冷凍保存的解淀粉芽孢桿菌，用在酒精燈火焰上滅菌并冷卻的接種環(huán)蘸取解淀粉芽孢桿菌菌液。再在LB固體培養(yǎng)基平板上進行稀釋劃線，劃完線后，置于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。拿出培養(yǎng)好的平板，在無菌的潔凈工作臺上，先將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒，冷卻后用接種環(huán)挑取生長旺盛的單菌落，于100mlLB液體培養(yǎng)基中混勻。接種好后，將錐形瓶置于37℃，180r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，制得種子液。白色念珠菌：首先從-80℃凍存管中取菌液接種于沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）平板，在35℃培養(yǎng)24-48小時直至出現(xiàn)光滑乳白色單菌落。挑取單菌落重復活化1-2次以保證純度。隨后取活化菌落接種于5-10ml沙氏葡萄糖肉湯（SDB），于30℃、150-200r/min振蕩培養(yǎng)18-24小時至對數(shù)生長期（OD600值0.4-0.6），將菌液轉(zhuǎn)移至離心管。4℃、5000r/min離心5分鐘收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2-3次去除培養(yǎng)基殘留。最后用生理鹽水重懸菌體。2.2.4解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵條件優(yōu)化（1）菌種發(fā)酵在潔凈工作臺中，將種子液按5%的接種量加入到200ml的LB液體培養(yǎng)基中，然后根據(jù)我們要探究的三種因素三個水平進行正交實驗。然后分別放于9種（如表4）不同發(fā)酵條件的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。表4正交實驗設定28℃，24h，180r30℃，24h，220r37℃，24h，250r28℃，36h，220r30℃，36h，250r37℃，36h，180r28℃，48h，250r30℃，48h，180r37℃，48h，220r培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至50mL離心管，使用離心機設置轉(zhuǎn)速7000r/min、溫度4℃離心15min。離心后，小心用移液管吸取上清液至新的50mL離心管，避免觸及管底菌體沉淀。取上清液，先提前用pH7.00緩沖液校準pH計，用6mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0±0.1，邊滴加邊用磁力攪拌器低速攪拌，每滴加50μL后讀取pH值，直至達到目標值。調(diào)節(jié)完成后，將離心管加蓋密封置于4℃冰箱靜置12–16h。使脂肽充分沉淀。次日，從冰箱取出樣品，再次使用同一離心機，設置轉(zhuǎn)速12000r/min、溫度4℃，離心10min。棄去上清液，此時管底可見灰白色脂肽沉淀。將6mL甲醇加入到離心管中，用渦旋混合器振蕩30s，使沉淀完全溶解。必要時可超聲處理（40kHz，功率100W）5min輔助溶解。溶解后，以12000r/min、4℃離心10min，去除不溶性雜質(zhì)。甲醇上清液用移液槍轉(zhuǎn)移至1.5mLEP管（滅菌處理），使用0.1mol/L氫氧化鈉溶液回調(diào)pH至7.0±0.1（校準同前）。每個樣品取1mL轉(zhuǎn)移至新的1.5mLEP管，12000r/min離心5min，進一步去除微小顆粒，上清液即為脂肽粗提液。保存于4℃冰箱備用（避免反復凍融）。（2）菌體量的測定將取樣發(fā)酵液充分搖勻，于波長600nm下測定其光密度值（OD600nm），重復3次取平均值。2.2.5脂肽產(chǎn)量實驗所用超純水（UPwater）、1.5mLEP管、90mm培養(yǎng)平板、10–1000μL移液器槍頭、0.22μm針頭式過濾器及10mL無菌注射器，均采用高壓蒸汽滅菌法（121℃，20min，0.1MPa）進行滅菌處理。滅菌完成后，提前30min開啟超凈臺紫外燈進行空間滅菌。操作前需用75%乙醇擦拭臺面及雙手并調(diào)節(jié)安全柜擋板高度至15–20cm，確保氣流流速穩(wěn)定。取-80℃凍存的白色念珠菌菌株，接種于5mLYPD液體培養(yǎng)基（含20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物，pH6.0），于30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)18–24h至對數(shù)生長期。采用十倍梯度稀釋法制備菌懸液：取100μL菌液至900μL無菌水）中，渦旋混合器充分混勻，依次稀釋至10??梯度。YPD固體培養(yǎng)基經(jīng)121℃滅菌20min后，置于恒溫水浴鍋中冷卻至45–50℃（通過插入式溫度計實時監(jiān)測）。在酒精燈火焰旁進行倒平板操作，使用25mL移液管向每個90mm培養(yǎng)皿中注入18–20mL培養(yǎng)基確保凝固后厚度為3–4mm。傾倒時保持培養(yǎng)皿與桌面呈10–15°傾斜角，沿內(nèi)壁緩慢注入以減少氣泡產(chǎn)生，隨后水平輕搖培養(yǎng)皿使培養(yǎng)基均勻分布。倒板完成后將培養(yǎng)皿置于水平臺上靜置30min。待培養(yǎng)基完全凝固后平放于超凈臺備用。取離心后的發(fā)酵液樣品（8000r/min離心10min，收集上清液）。通過以下步驟對發(fā)酵液樣品進行除菌處理，在火焰滅菌區(qū)域?qū)?.22μm針頭式過濾器（直徑13mm，親水PVDF膜）與10mL無菌注射器（帶鎖扣活塞）無菌對接。確保螺紋接口緊密密封。壓力控制：以恒定速率推動活塞，使樣品通過濾膜，注意力度，防止濾膜破裂。將完成過濾處理的無菌樣品，按照每管500微升來進行分裝到提前滅菌處理的1.5毫升EP管中。在菌液涂布與檢測孔制備的操作中，然后進行接種操作，取10ul經(jīng)過稀釋處理后的白色念珠菌菌懸液，滴加到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基中央位置，立即使用經(jīng)火焰灼燒滅菌的無菌玻璃涂布器，以恒定的速度對培養(yǎng)皿進行環(huán)形涂布，讓菌液在30秒內(nèi)被培養(yǎng)基完全吸收，使菌液均勻分布于培養(yǎng)基表面。待涂布的菌液完全干燥后，準備打孔操作，先將槍頭經(jīng)火焰灼燒徹底滅菌，在培養(yǎng)基表面垂直按壓制造檢測孔，每個培養(yǎng)平板均勻設置4個檢孔。打孔時需要小心謹慎挑出孔內(nèi)培養(yǎng)基，做到孔底平整光滑，無瓊脂碎屑殘留。開始進行加樣，用校準完成的100ul移液槍，向每個孔內(nèi)注入100ul過濾除菌后的樣品液體，加樣過程中保持槍頭距離孔底2-3毫米的高度，防止液體濺出影響實驗準確性。加樣完成后，將培養(yǎng)平板放置于溫度在28℃（溫度波動范圍±0.5℃）的恒溫培養(yǎng)箱中，先正放平板培養(yǎng)24小時，讓樣品在培養(yǎng)基中充分擴散。為了避免冷凝水對抑菌圈形態(tài)造成干擾，后面將平板倒放繼續(xù)培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)持續(xù)48小時結(jié)束后，把平板置于黑色背景下，利用精度達0.1毫米的直尺，對每個孔產(chǎn)生的抑菌圈直徑進行測量，每個孔分別在正交方向測量2次，最終取測量數(shù)據(jù)的平均值作為該孔的抑菌圈直徑結(jié)果，并做好詳細的數(shù)據(jù)記錄工作，確保實驗數(shù)據(jù)的準確性。3結(jié)果分析3.1白色念珠菌圖1.白色念珠菌如圖1，在SDA液體培養(yǎng)基中的白色念珠菌呈現(xiàn)出渾濁的培養(yǎng)液、白色絮狀的菌體。培養(yǎng)液底部無明顯沉淀，說明菌體懸浮性良好，未形成生物膜附著。3.2解淀粉芽孢桿菌圖2.解淀粉芽孢桿菌如圖2，解淀粉芽孢桿菌形成的菌落外觀呈白色圓形不透明。用肉眼觀察菌落表面沒有濕潤的光澤呈現(xiàn)干燥質(zhì)感，且表面帶有輕微的凹凸起伏。3.3解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液圖3.LB培養(yǎng)基發(fā)酵液如圖3.用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵液呈淡黃色，不透明，無沉淀的溶液。3.4解淀粉芽孢桿菌抑菌物質(zhì)鹽析液圖4.解淀粉芽孢桿菌抑菌物質(zhì)鹽析液如圖4，在離心完的發(fā)酵液中加入甲醇，甲醇溶解初期：溶液呈淺棕色渾濁狀，可見絮狀沉淀懸浮，表明脂肽類物質(zhì)（尤其是疏水性伊枯草菌素）在甲醇中逐步溶解；4℃靜置過夜后，管底形成白色顆粒狀沉淀，上層甲醇溶液澄清透明，沉淀量約占總體積的10–15%。3.5單因素梯度篩選預實驗為確定正交試驗的因素水平范圍，開展單因素預實驗：設置溫度（20、25、30、35、40℃）、發(fā)酵時間（12、24、36、48、60h）、轉(zhuǎn)速（150、180、220、250、280r/min）共3個因素，每個因素5個水平，以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種量5%，每個條件設置3個生物學重復。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)7000r/min離心15min。棄其沉淀取上清用6mol/L鹽酸調(diào)pH至2.0酸沉過夜。將解淀粉芽孢桿菌抑菌物質(zhì)鹽析液離心并收集沉淀用甲醇溶解。通過對白色念珠菌為指示菌做抑菌實驗，看抑菌圈大小來評價脂肽產(chǎn)量。結(jié)果顯示：溫度30℃、發(fā)酵時間48h、轉(zhuǎn)速180r/min時抑菌圈最大。分別為21.2mm、22.3mm、20.9mm。由此確定正交試驗水平為溫度28–37℃、時間24–48h、轉(zhuǎn)速180–250r/min。3.6正交實驗結(jié)果根據(jù)預實驗，對顯著影響解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)脂肽的三個單因素：發(fā)酵時間，溫度，轉(zhuǎn)速進行3因素3水平的正交試驗，正交水平及因素見表5，結(jié)果見表6，方差分析見表7?？衫糜嬎闫骰蚴莈xcel中函數(shù)等工具進行數(shù)據(jù)處理，來預測出發(fā)酵條件時間，溫度，轉(zhuǎn)速的最佳組合。表5正交實驗及因素水平水平A溫度/℃B時間/hC轉(zhuǎn)速/r?min-1128241802303622033748250表6產(chǎn)脂肽正交試驗結(jié)果直觀分析實驗號A(℃）B(h）C（rpm）抑菌圈（mm）111117.3212221.1313324.5421219.4522323.8623126.0731315.2832118.7933222.3K162.9051.9062.00K269.2063.6062.80K356.2072.8063.50k120.9717.3020.67k223.0721.2020.93k318.7324.2721.17R4.346.970.50表7方差分析方差來源離差平方和自由度均方F值P值顯著值A(chǔ)溫度/℃28.17214.09134.190.0074**B時間/h73.15236.58348.380.0029**C轉(zhuǎn)速/r?min-10.3820.191.810.3559不顯著D（誤差）0.2120.105通過對表6中9組正交試驗數(shù)據(jù)的極差分析（R值），明確各因素對解淀粉芽孢桿菌HY-1產(chǎn)脂肽抑菌圈直徑的影響主次順序為：發(fā)酵時間（B）>發(fā)酵溫度（A）>轉(zhuǎn)速（C）。在各項影響因素中，發(fā)酵時間（B）的影響最為顯著，其極差R達到6.97，在三個影響因素里數(shù)值最高。當發(fā)酵時間從24小時逐步延長至48小時，抑菌圈直徑的均值（k值）也相應的從17.30毫米增加到24.27毫米，整體增幅高達40.3%。這一變化與解淀粉芽孢桿菌的代謝過程緊密相連，在發(fā)酵進行到24小時時，菌體正處于快速增殖的對數(shù)生長期，此時大部分營養(yǎng)物質(zhì)都被用于菌體自身的生長繁殖，而作為次級代謝產(chǎn)物的脂肽合成量相對較少；隨著發(fā)酵時間延長到48小時，菌體生長進入穩(wěn)定期，代謝途徑發(fā)生轉(zhuǎn)變，更多營養(yǎng)物質(zhì)被投入到次級代謝過程，脂肽合成酶的活性顯著增強，使得脂肽產(chǎn)量大幅提升，進而擴大了抑菌圈直徑。發(fā)酵溫度（A）對實驗結(jié)果的影響僅次于發(fā)酵時間，其極差R為4.34。當發(fā)酵溫度從28℃升高至30℃，抑菌圈直徑均值由20.97毫米增長到23.07毫米，提升幅度約為9.9%；但如果繼續(xù)將溫度升高到37℃，抑菌圈直徑均值反而下降至18.73毫米。這一現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于30℃接近解淀粉芽孢桿菌的最適生長溫度，在此溫度下酶促反應能夠高效進行，有利于脂肽的合成與積累；而當溫度達到37℃這樣的較高水平時，一方面可能會破壞部分脂肽的空間結(jié)構(gòu)，降低其熱穩(wěn)定性，另一方面也可能導致菌體生長受到抑制，出現(xiàn)提前衰老的情況，最終使得抑菌效果減弱，抑菌圈直徑變小。轉(zhuǎn)速（C）影響最小，極差為0.50，。轉(zhuǎn)速從180r/min增至250r/min時，抑菌圈均值僅從20.67mm微增至21.17mm，表明實驗設定的溶氧范圍內(nèi)（180–250r/min）未構(gòu)成代謝限制因素，低轉(zhuǎn)速（180r/min）即可滿足菌體對溶解氧的需求。從表7的方差分析數(shù)據(jù)來看，發(fā)酵時間（B）的離差平方和達到73.15，F(xiàn)值為348.38，P值僅0.0029，遠小于0.01的顯著性閾值，這說明發(fā)酵時間對脂肽產(chǎn)量的影響在統(tǒng)計學上具有極其顯著的意義，也再次證明將培養(yǎng)時間延長至菌體生長穩(wěn)定期，對提高脂肽合成量十分必要。發(fā)酵溫度（A）的離差平方和為28.17，F(xiàn)值134.19，P值0.0074同樣小于0.01，顯示其對脂肽產(chǎn)量的影響也非常顯著，這是因為溫度能夠調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶、肽合成酶等參與脂肽合成的關(guān)鍵酶活性，進而間接作用于脂肽分子的組裝與分泌過程。相比之下，轉(zhuǎn)速（C）的離差平方和僅0.38，F(xiàn)值1.81，P值0.3559大于0.05，說明轉(zhuǎn)速對脂肽產(chǎn)量的影響在統(tǒng)計學上不顯著。綜合考慮極差分析結(jié)果，在實際生產(chǎn)過程中可以選擇180r/min這樣的低轉(zhuǎn)速運行，既能有效降低能耗成本，又能避免高轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力對菌體造成損傷，在保證生產(chǎn)效率的同時實現(xiàn)節(jié)能降耗。所以從表7來看發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)脂肽的影響均有高度顯著性差異（P<0.01)，而轉(zhuǎn)速對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)脂肽的影響無顯著性差異，此外A2>A1>A3,B3>B2>B1,C3>C2>C1可以看出發(fā)酵條件培養(yǎng)菌株時的最佳試驗組合為A2B3C3。即發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時間48h、轉(zhuǎn)速250rpm。在此條件下進行驗證試驗測定其抑菌圈大小，結(jié)合生產(chǎn)成本和抑菌效果這兩個因素，再確定此為最優(yōu)發(fā)酵條件。3.7最優(yōu)條件驗證實驗根據(jù)正交實驗結(jié)果預測最優(yōu)條件為發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間48h，轉(zhuǎn)速250rpm，但由于考慮節(jié)能和生產(chǎn)成本，且轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)脂肽的影響無顯著性差異，將預測最優(yōu)條件為30℃，發(fā)酵時間48h，轉(zhuǎn)速180rpm并進行實驗驗證。主要還是先培養(yǎng)種子液，在不同條件的振蕩培養(yǎng)箱進行菌種的培養(yǎng)。培養(yǎng)完畢后進行一系列的處理得到脂肽，然后進行抑菌實驗，再進行培養(yǎng)。從培養(yǎng)箱中拿出，在黑色背景下用直尺量取抑菌圈大小，并拍照記錄。看30℃，發(fā)酵時間48h，轉(zhuǎn)速250rpm和30℃，發(fā)酵時間48h，轉(zhuǎn)速180rpm的抑菌圈大小是否相等。結(jié)果如圖5，發(fā)現(xiàn)這兩個條件抑菌圈都為26mm也符合之前結(jié)果轉(zhuǎn)速為不顯著影響因素。所以結(jié)合正交實驗和成本，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)脂肽最優(yōu)條件為30℃，發(fā)酵時間48h，轉(zhuǎn)速180rpm。圖5驗證實驗抑菌圈（A:30℃，48h，250rmp;B:30℃，48h，180rmp)4展望4.1發(fā)酵條件對脂肽合成的調(diào)控機制正交試驗結(jié)果顯示，解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵時間是脂肽產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。在24至48小時這個時間段內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間的變長，處于對數(shù)生長期的菌體合成脂肽的量明顯增多。當發(fā)酵時間推進到48小時，抑菌圈直徑達到最大的26毫米，可能與菌體積累更多代謝中間產(chǎn)物及酶活性穩(wěn)定表達有關(guān)。30℃接近解淀粉芽孢桿菌的最適宜生長溫度，在這個溫度下，能夠保證菌體維持較高活性，實驗數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)速對抑菌圈大小沒有顯著影響（P>0.05），在實驗設定的180至250r/min轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，已經(jīng)能夠充分滿足菌體生長的溶氧需求，不會成為限制代謝過程的因素，這一結(jié)論為實際生產(chǎn)中選擇180r/min等低轉(zhuǎn)速運行，進而降低能耗提供了可靠的理論支撐。4.2脂肽抗白色念珠菌的作用特性與優(yōu)勢本研究中優(yōu)化后的脂肽對白色念珠菌抑菌圈直徑達26mm，顯示出較強的抗菌活性。脂肽類化合物（如表面活性素、伊枯草菌素）的抗菌機制主要通過以下途徑實現(xiàn)：嵌入真菌細胞膜脂質(zhì)雙層，破壞膜結(jié)構(gòu)完整性，誘導胞內(nèi)電解質(zhì)與生物大分子泄漏；干擾膜結(jié)合酶功能，阻斷能量代謝（如ATP合成）與細胞壁前體物質(zhì)合成；抑制菌絲形成與生物膜發(fā)育，降低病原菌黏附宿主細胞的能力。與臨床常用唑類藥物相比，脂肽作用靶點獨特不易誘導耐藥性且對氟康唑耐藥菌株仍有效。這為解決白色念珠菌耐藥性難題提供了新策略。此外，解淀粉芽孢桿菌作為GRAS認證菌株其代謝產(chǎn)物安全性高，可規(guī)避化學合成抗菌劑的毒性風險。在食品防腐、醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊應用前景。4.3研究局限性與未來研究方向本研究存在一定局限，目前僅使用LB培養(yǎng)基在實驗室規(guī)模開展發(fā)酵實驗，尚未對工業(yè)生產(chǎn)常用的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，特別是未探索玉米淀粉、豆粕等廉價碳氮源的應用潛力。同時，研究僅停留在體外抗菌活性檢測，缺少動物感染模型中藥物代謝過程，毒性作用等體內(nèi)數(shù)據(jù)支撐。后續(xù)研究可從多方面深入拓展，運用響應面法系統(tǒng)探究葡萄糖、蛋白胨等培養(yǎng)基成分的最佳濃度配比，進一步提高脂肽產(chǎn)量。借助LC-MS/MS等先進檢測技術(shù)對脂肽組分進行分析，明確發(fā)揮關(guān)鍵抗菌作用的物質(zhì)成分。通過開展中試放大實驗驗證發(fā)酵工藝在擴大生產(chǎn)規(guī)模時的穩(wěn)定性。5結(jié)論通過正交試驗與驗證實驗，確定了解淀粉芽孢桿菌HY-1產(chǎn)脂肽的最優(yōu)工藝參數(shù)為溫度30℃，發(fā)酵時間48h，轉(zhuǎn)速180r/min。該條件下進行培養(yǎng)得到的抑菌圈直徑為26mm，對比于初始條件顯著提升。同時低轉(zhuǎn)速設計可使能耗降低約30%，既保證了生產(chǎn)效率又兼顧經(jīng)濟成本。研究表明，脂肽主要通過破壞白色念珠菌細胞膜實現(xiàn)抗菌功能，對臨床常見的耐藥菌株也展現(xiàn)出良好抑制效果。由于解淀粉芽孢桿菌屬于安全微生物，其產(chǎn)生的脂肽作為天然抗真菌物質(zhì)，在食品保鮮延長貨架期、醫(yī)藥領(lǐng)域開發(fā)新型抗菌藥物等方面具有很高的應用轉(zhuǎn)化潛力。后續(xù)研究需圍繞工業(yè)化生產(chǎn)工藝進一步優(yōu)化，利用先進分析技術(shù)深入解析脂肽成分組成。參考文獻[1]江梅,馬曉靜,張慧敏,等.內(nèi)酯型槐糖脂對白色念珠菌生長和生物膜形成的影響及機制研究[J].中國病原生物學雜志,2025,20(01):1-7.DOI:10.13350/j.cjpb.250101.[2]HebertH,Loffler),ReitzeH.Prospectivescreeningbyapanfungalpolymerasechainreactionassayinpatientsatriskforfungalinfections:implicationsforthemanagementoffebrileneutropeniaUl.BrJHaematol,2000,111(2):635-640.[3]HussainZ,ElsavedS,FitzgeraldV.ComparisonofPCRtohistologyforthediagnosisofinvasivecandidiasisinamurinemodel!].ScandJlnfectDis,2001,33(1):51-55.[4]陳晨,崔非非,馮來鵬,等.2019/2023新鄉(xiāng)地區(qū)血培養(yǎng)病原菌分布及耐藥性分析[J].河南大學學報(醫(yī)學版),2024,43(04):51-58.DOI:10.15991/ki.41-1361/r.2024.04.005.[5]魯品,周慧茹,趙婧,等.抗菌肽調(diào)控細菌耐藥機制的研究進展[J/OL].中華醫(yī)院感志,2025,(11):1749-1755[2025-05-06]./kcms/detail/11.3436.R.20250423.1438.050.html.[6]姚成玲.解淀粉芽孢桿菌對Trichophytonrubrum的拮抗作用及機制研究[D].重慶理工大學,2023.[7]黃曦,許蘭蘭,黃榮韶,等.枯草芽孢桿菌在抑制植物病原菌中的研究進展J1.生物技術(shù)通報,2010(1):24-29.[8]ONGENAM,JACQUESPBacilluslipopeptides:versatileweaponsforplantdiseasebiocontroly].TrendsinMicrobiolo-gy,2008,16(3):115-125.[9]闞家振.肉雞白色念珠菌病診斷與治療[J].吉林畜牧獸醫(yī),2025,46(02):67-69.[10]OlivaA,DeRosaFG,MikulskaM,etal.InvasiveCandidainfection:epidemiology,clinicalandtherapeuticaspectsofanevolvingdiseaseandtheroleofrezafungin[J].ExpertRevAntiInfectTher,2023,21(9):957-975.DOI:10.1080/14787210.2023.2240956.[11]王娜,韓琦,桑建利.白色念珠菌的形態(tài)類型及致病性[J].生物學報,2015,50(10):3-8.[12]KALIMUTHUS,ALSHANTAOA,KRISHNAMOORTHYAL,etal.Smallmoleculebasedanti-virulenceapproachesagainstCandidaalbicansinfections[J].CritRevMicrobiol,2022,48(6):743-769.[13]GONGY,LIUWG,HUANGX,etal.AntifungalactivityandpotentialmechanismofN-butylphthalidealoneandincombinationwithfluconazoleagainstCandidaalbicans[J].FrontMicrobiol,2019,10:1461.[14]楊偲睿,仇珺,吳昊澤,等