ICS77.040.99

H20

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/ZSAxxx-xxxx

抗菌不銹鋼表面抗菌性能試驗(yàn)方法

Antibacterialstainlesssteel—Measurementofantibacterialactivityonthe

surface

（征求意見稿）

xxxx-xx-xx發(fā)布xxxx-xx-xx實(shí)施

中關(guān)村標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)發(fā)布

T/ZSA×××—××××

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。中關(guān)村標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。

本標(biāo)準(zhǔn)由中關(guān)村標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。

本文件起草單位：

本文件主要起草人：

III

T/ZSA×××—××××

引言

抗菌不銹鋼作為新型的結(jié)構(gòu)功能一體化材料已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。為保證抗菌不銹鋼的抗菌質(zhì)

量，快速真實(shí)有效檢測(cè)出抗菌不銹鋼的抗菌性能，特制定本文件。本文件主要基于抗菌材料對(duì)細(xì)菌的接

觸殺菌機(jī)制，提供抗菌不銹鋼抗菌效果的評(píng)價(jià)方法。對(duì)于抗菌不銹鋼的其他重要性能，如產(chǎn)品的理化性

能和安全性可參考其他相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，在本文件中不作規(guī)定。

IV

T/ZSA×××—××××

抗菌不銹鋼表面抗菌性能試驗(yàn)方法

警告：處理和操作具有潛在危險(xiǎn)的微生物需要很高的技術(shù)能力，需遵守現(xiàn)行國(guó)家法律和條例，只有

經(jīng)過(guò)微生物學(xué)技術(shù)培訓(xùn)的人員才能進(jìn)行這些檢測(cè)工作。并應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)的消毒、滅菌和個(gè)人衛(wèi)生規(guī)范

程序。

1范圍

本文件規(guī)定了抗菌不銹鋼的抗菌性能的評(píng)價(jià)方法。

本文件適用于抗菌不銹鋼材料的抗菌性能檢測(cè)，其他經(jīng)抗菌處理的實(shí)體無(wú)孔合金材料的抗菌性能也

可參照?qǐng)?zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)和定義

以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

抗菌antibacterial

制品表面殺滅或妨礙細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖及其活性的效果。

注：改寫GB/T31402—2015，定義3.1。

3.2

抗菌劑antibacterialagent

通過(guò)表面抗菌處理或添加到制品而抑制細(xì)菌在制品表面生長(zhǎng)的藥劑。

注：改寫GB/T31402—2015，定義3.2。

3.3

抗菌不銹鋼antibacterialstainlesssteel

在普通不銹鋼中添加一定量的金屬抗菌劑，通過(guò)控制鑄造、鍛壓、軋制以及熱處理等過(guò)程，使其成

為具有抗菌功能的不銹鋼。

3.4

抗菌性能antibacterialactivity

經(jīng)過(guò)抗菌處理后的制品和未經(jīng)抗菌處理的制品在接種細(xì)菌培養(yǎng)后，得到的活菌數(shù)的差異。

注：改寫GB/T31402—2015，定義3.3。

4材料

4.1試驗(yàn)細(xì)菌

試驗(yàn)采用以下兩種細(xì)菌：

a）金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus（菌株號(hào)ATCC6538）；

b）大腸埃希氏菌Escherichiacoli（菌株號(hào)ATCC8739）。

根據(jù)產(chǎn)品的使用要求，可選用其他菌種作為檢驗(yàn)菌種，但菌種應(yīng)由國(guó)家級(jí)菌種保藏管理中心提供，

1

T/ZSA×××—××××

并應(yīng)在檢測(cè)報(bào)告中注明及說(shuō)明理由。

注：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）是世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)（WFCC）成員，與金黃色葡萄球菌ATCC

6538等同的國(guó)內(nèi)菌株號(hào)為CGMCC1.2465，與大腸埃希氏菌ATCC8739等同的國(guó)內(nèi)菌株號(hào)為CGMCC1.2463。

4.2試劑、溶液與培養(yǎng)基

所使用的水都應(yīng)是蒸餾水或去離子水，通常為電導(dǎo)率小于1μS/cm的二級(jí)水。

所有試劑都應(yīng)是分析純或微生物試驗(yàn)試劑。

4.2.1消毒劑

75％乙醇溶液。

4.2.2洗脫液

將8.5g氯化鈉加入到1000mL蒸餾水中，攪拌均勻，制成生理鹽水。然后置于高溫高壓蒸汽滅菌

鍋內(nèi)，121℃滅菌20min。如不立即使用，于5℃~10℃保藏。不應(yīng)使用存放一個(gè)月或以上的生理鹽水。

4.2.3培養(yǎng)基

4.2.3.1營(yíng)養(yǎng)肉湯

將5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨和5.0g氯化鈉加入1000mL蒸餾水中制備成溶液，用0.1mol/LNaOH

溶液調(diào)節(jié)PH值至7.0~7.2，然后置于高溫高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121℃滅菌20min。如不立即使用，于

5℃~10℃保藏。不應(yīng)使用存放一個(gè)星期或以上的營(yíng)養(yǎng)肉湯。

4.2.3.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂

1000mL4.2.3.1的營(yíng)養(yǎng)肉湯中加入15.0g瓊脂，加熱融化，用0.1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至

7.0~7.2，并置于高溫高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121℃滅菌20min。如不立即使用，于5℃~10℃保藏。不應(yīng)使

用存放一個(gè)月或以上的營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

4.2.3.3斜面培養(yǎng)基

將6mL~10mL加熱溶解的營(yíng)養(yǎng)瓊脂加入到已高溫高壓滅菌（見6.1）的旋蓋試管中，將試管置于傾

角約15°的位置，等待培養(yǎng)基凝固。如不立即使用，于5℃~10℃保藏。不應(yīng)使用存放一個(gè)月或以上的斜

面培養(yǎng)基。

5儀器

如無(wú)特別說(shuō)明，使用以下器具和材料。

5.1

恒溫試驗(yàn)箱：在設(shè)定溫度下，溫度波動(dòng)不超過(guò)±1℃。

5.2

壓力蒸汽滅菌鍋：能保持121℃±2℃的溫度，保持103kPa±5kPa的壓力。

5.3帶攪拌的水浴鍋。

5.4pH計(jì)：精度±0.2。

5.5天平：精度±0.01g。

5.6移液器：滅菌移液管。

5.7渦旋攪拌器。

5.8超聲波清洗器。

5.9接種環(huán)：直徑4mm。

5.10酒精燈。

2

T/ZSA×××—××××

5.11培養(yǎng)皿：直徑90mm~100mm，滅菌后使用。

5.12滅菌離心管。

5.13滅菌三角耙。

5.14

冷藏箱：保持0℃~5℃的溫度。

6儀器滅菌和菌種保藏

6.1高溫高壓滅菌

將物品放入壓力蒸汽滅菌鍋，于121℃滅菌不少于20min。

6.2玻璃器皿的準(zhǔn)備

以堿性或中性清潔劑清洗，然后用蒸餾水或者去離子水沖洗干凈。使用前用壓力蒸汽滅菌鍋滅菌。

6.3菌種保藏

將菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，37℃±1℃下培養(yǎng)24h后，在0℃~5℃下保藏，作為斜面保藏菌。不得

使用轉(zhuǎn)種超過(guò)5次或者轉(zhuǎn)種間隔超過(guò)1個(gè)月的菌種。

7檢測(cè)步驟

7.1檢測(cè)原理

本方法基于抗菌材料對(duì)于細(xì)菌的接觸殺菌理論，通過(guò)接種能夠確保細(xì)菌與材料充分接觸的菌懸液于

待檢樣品上，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的培養(yǎng)后，測(cè)得樣品中的活菌數(shù)，并計(jì)算出樣品的抗菌率。

7.2細(xì)菌預(yù)培養(yǎng)

用無(wú)菌接種環(huán)將細(xì)菌從保藏菌種的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基，在37℃±1℃下培養(yǎng)16h~24h。再用

無(wú)菌接種環(huán)將此細(xì)菌轉(zhuǎn)移到新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在37℃±1℃下培養(yǎng)16h~20h。

7.3樣品的制備

7.3.1對(duì)照樣品

對(duì)照樣品（樣品A）為未經(jīng)抗菌處理的普通不銹鋼，樣品標(biāo)準(zhǔn)尺寸為10mm×10mm，厚度不大于5mm，

樣品表面用240#、400#、600#、800#、1000#、1500#、2000#的水磨砂紙逐級(jí)打磨，每一級(jí)打磨相對(duì)于

上一級(jí)打磨旋轉(zhuǎn)90°，以便將上一級(jí)磨痕磨掉。至少準(zhǔn)備6片樣品，3片用于接種細(xì)菌后立即測(cè)試活菌數(shù)，

3片用于測(cè)量接種試驗(yàn)時(shí)間后的活菌數(shù)。

注：對(duì)于無(wú)法制備未經(jīng)抗菌處理樣品的情況，對(duì)照樣品可以采用衛(wèi)生級(jí)高密度聚乙烯（HDPE）注塑成型，標(biāo)準(zhǔn)尺

寸為10mm×10mm，厚度不大于5mm，要求其本身不具有抗菌作用且對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的判定無(wú)影響。。

7.3.2抗菌不銹鋼樣品

抗菌不銹鋼樣品（樣品B）為經(jīng)抗菌處理的不銹鋼，樣品標(biāo)準(zhǔn)尺寸為10mm×10mm，厚度不大于5mm，

樣品表面用240#、400#、600#、800#、1000#、1500#、2000#的水磨砂紙逐級(jí)打磨，每一級(jí)打磨相對(duì)于

上一級(jí)打磨旋轉(zhuǎn)90°，以便將上一級(jí)磨痕磨掉。至少準(zhǔn)備3片樣品。

7.3.3樣品消毒

3

T/ZSA×××—××××

樣品在試驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行消毒，建議用消毒劑（75%乙醇溶液）進(jìn)行超聲清洗15min后，用無(wú)菌水沖洗，

自然干燥。

7.4菌懸液的制備

用接種環(huán)從7.2培養(yǎng)基上取少量（刮1~2環(huán)）新鮮細(xì)菌，加入到5mL~8mL無(wú)菌生理鹽水中，確保

細(xì)菌分散均勻，采用比濁法測(cè)試細(xì)菌濃度。隨后依次做10倍遞增稀釋液，選擇菌液濃度

1.0×107CFU/mL～5.0×107CFU/mL的稀釋液作為試驗(yàn)用細(xì)菌接種懸液。

7.5樣品接種

將樣品A和樣品B分別放入24孔板中，用無(wú)菌槍頭吸取10μL配制好的菌懸液滴加到每個(gè)孔中的

樣品表面上，鋪展菌液確保細(xì)菌與樣品表面的充分接觸同時(shí)無(wú)明顯厚度液膜在樣品表面形成。

接種液應(yīng)在表面充分鋪展，并且在鋪展的過(guò)程不應(yīng)溢出。對(duì)于有些疏水性非常強(qiáng)的表面，可通過(guò)在

接種液中添加表面活性劑（如含氟表面活性劑等）來(lái)增強(qiáng)表面的潤(rùn)濕性；對(duì)于有些親水性非常強(qiáng)的表面，

可通過(guò)減少菌液體積以適應(yīng)試樣表面，但菌液體積不應(yīng)少于5μL，并應(yīng)增加接種液的細(xì)菌濃度來(lái)保證具

有規(guī)定數(shù)量的細(xì)菌。

7.6接種樣品的培養(yǎng)

除特別說(shuō)明外，含有接種試樣的孔板，在37℃±1℃、相對(duì)濕度RH大于90％的條件下培養(yǎng)1h~4h，

培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)接種液體積及材料抗菌性能確定。根據(jù)在培養(yǎng)溫度下測(cè)得的抗菌性能值來(lái)確定抗菌不銹鋼

的抗菌效果。

7.7樣品上的細(xì)菌回收

7.7.1樣品接種后即時(shí)測(cè)試

接種后，立即對(duì)已接種的3片樣品A進(jìn)行細(xì)菌回收，將樣品連同其上菌液一同取出，放入離心管

中，加入3mL的洗脫液稀釋細(xì)菌懸液，充分渦旋振蕩。以此種方法得到樣品A上的即時(shí)接種活菌數(shù)。

7.7.2樣品接種培養(yǎng)后測(cè)試

根據(jù)7.6的程序培養(yǎng)后，按7.7.1對(duì)樣品B和剩余的樣品A表面的細(xì)菌進(jìn)行回收處理，隨后立即對(duì)

回收的活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)（見7.8）。

7.8平板培養(yǎng)法測(cè)定活菌數(shù)

用無(wú)菌生理鹽水（見4.2.2）對(duì)按7.7處理過(guò)的細(xì)菌回收液進(jìn)行10倍逐級(jí)稀釋，用移液器從回收液

和逐級(jí)稀釋液中各吸取0.1mL加至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，使用滅菌三角耙將菌液均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)基

平板上，每種稀釋度的溶液各涂布兩個(gè)平板。倒置平板并置于37℃±1℃恒溫箱中培養(yǎng)24h~48h。到達(dá)

時(shí)間點(diǎn)后，對(duì)菌落數(shù)在30~300的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并記錄相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。如果0.1mL的洗脫液中

的菌落數(shù)小于30，則直接對(duì)該平板進(jìn)行計(jì)數(shù)；如果所有平板中均沒有菌落，則記為<1。

8試驗(yàn)結(jié)果

8.1活菌數(shù)測(cè)定

對(duì)于每個(gè)試樣，都按照式（1）來(lái)計(jì)算活菌數(shù)。

N=10×C×D×V……………….（1）

式中：

4

T/ZSA×××—××××

N——每個(gè)試樣每平方厘米的活菌數(shù)；

C——兩個(gè)平板培養(yǎng)基的平均菌落數(shù)；

D——稀釋倍數(shù)；

V——用于洗脫的洗脫液體積。

計(jì)算每組試樣回收活菌數(shù)的幾何平均數(shù)并記錄菌數(shù)時(shí)取2位有效數(shù)字，若某一稀釋倍數(shù)的所有瓊脂

平板上都沒有菌落，則將活菌計(jì)作＜V（用于洗脫的洗脫液體積mL）。計(jì)算平均數(shù)時(shí)，如各稀釋度均沒

有菌數(shù)，則記錄為V。

例如：V=3mL，計(jì)算所得平均數(shù)為3。

8.2試驗(yàn)有效的條件

當(dāng)滿足以下條件時(shí)，試驗(yàn)認(rèn)定為有效，否則試驗(yàn)無(wú)效，應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)：

1）同一樣品A的3個(gè)即時(shí)接種回收活菌數(shù)應(yīng)滿足式（2）的要求：

（Lmax—Lmin）/Lmean≤0.3……………（2）

式中：Lmax——樣品上最大回收活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值；

Lmin——樣品上最小回收活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值；

Lmean——樣品上平均回收活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值；

2）樣品A不應(yīng)具有明顯的抗菌作用；

3）每個(gè)樣品A經(jīng)培養(yǎng)后的回收活菌數(shù)應(yīng)均不小于樣品A即時(shí)接種活菌數(shù)的10%。

8.3抗菌率的計(jì)算

在試驗(yàn)被認(rèn)為有效的情況下，抗菌率按式（3）計(jì)算，結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后1位：

R=（Am－Bm）/Am×100%……………（3）

式中：

R—抗菌率；

Am—樣品A（或空白對(duì)照組）接種培養(yǎng)后的平均回收活菌數(shù)，單位為細(xì)菌數(shù)每片（CFU/片）；

Bm—樣品B接種培養(yǎng)后的平均回收活菌數(shù)，單位為細(xì)菌數(shù)每片（CFU/片）。

9試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下信息：

a）注明采用本文件；

b）經(jīng)抗菌處理和未經(jīng)抗菌處理的不銹鋼材質(zhì)、尺寸、形狀和厚度；

c）試驗(yàn)用菌種和菌株號(hào)，如采用其他菌種需說(shuō)明原因；

d）接種菌液的體積；

e）洗脫液的體積；

f）孵育時(shí)間；

g）抗菌性能值；

h）若采用了不同于本文件的一些操作，如清洗方法變更、菌液回收方法變更及培養(yǎng)溫度不同時(shí)，

均應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明；

i）實(shí)驗(yàn)室的名稱等識(shí)別資料及實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人的姓名和簽字；

j）試驗(yàn)開始日期；

k）試驗(yàn)報(bào)告日期。

5

T/ZSA×××—××××

參考文獻(xiàn)

[1]GB/T31402—2015塑料塑料表面抗菌性能試驗(yàn)方法

[2]JISZ2801:2000Antimicrobialproducts-Testforantibamicrobialactivityandefficacy

[3]ASTME1054Standardtestmethodsforevaluationofinactivatorsofantimicrobialagents

[4]ISO/IEC17025:2000Generalrequirementsforthecompetenceoftestingandcalibrationlaboratories

[5]Zhang,X.R.,Yang,C.G.andYang,K.Contact-killingofCu-bearingstainlesssteelbasedoncharge

transfercausedbythemicrodomainpotentialdifference,ACSAppliedMaterials&Interfaces,12(2020),pp.

361-372.

6

T/ZSA×××—××××

目次

前言...............................................................................................................................................................III

引言...............................................................................................................................................................IV

1范圍...................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件...............................................................................................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.......................................................................................................................................................1

4材料...................................................................................................................................................................1

5儀器...................................................................................................................................................................2

6儀器滅菌和菌種保藏.......................................................................................................................................3

7檢測(cè)步驟...........................................................................................................................................................3

8試驗(yàn)結(jié)果...........................................................................................................................................................4

9試驗(yàn)報(bào)告...........................................................................................................................................................5

參考文獻(xiàn).................................................................................................................................................................6

II

T/ZSA×××—××××

抗菌不銹鋼表面抗菌性能試驗(yàn)方法

警告：處理和操作具有潛在危險(xiǎn)的微生物需要很高的技術(shù)能力，需遵守現(xiàn)行國(guó)家法律和條例，只有

經(jīng)過(guò)微生物學(xué)技術(shù)培訓(xùn)的人員才能進(jìn)行這些檢測(cè)工作。并應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)的消毒、滅菌和個(gè)人衛(wèi)生規(guī)范

程序。

1范圍

本文件規(guī)定了抗菌不銹鋼的抗菌性能的評(píng)價(jià)方法。

本文件適用于抗菌不銹鋼材料的抗菌性能檢測(cè)，其他經(jīng)抗菌處理的實(shí)體無(wú)孔合金材料的抗菌性能也

可參照?qǐng)?zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)和定義

以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

抗菌antibacterial

制品表面殺滅或妨礙細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖及其活性的效果。

注：改寫GB/T31402—2015，定義3.1。

3.2

抗菌劑antibacterialagent

通過(guò)表面抗菌處理或添加到制品而抑制細(xì)菌在制品表面生長(zhǎng)的藥劑。

注：改寫GB/T31402—2015，定義3.2。

3.3

抗菌不銹鋼antibacterialstainlesssteel

在普通不銹鋼中添加一定量的金屬抗菌劑，通過(guò)控制鑄造、鍛壓、軋制以及熱處理等過(guò)程，使其成

為具有抗菌功能的不銹鋼。

3.4

抗菌性能antibacterialactivity

經(jīng)過(guò)抗菌處理后的制品和未經(jīng)抗菌處理的制品在接種細(xì)菌培養(yǎng)后，得到的活菌數(shù)的差異。

注：改寫GB/T31402—2015，定義3.3。

4材料

4.1試驗(yàn)細(xì)菌

試驗(yàn)采用以下兩種細(xì)菌：

a）金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus（菌株號(hào)ATCC6538）；

b）大腸埃希氏菌Escherichiacoli（菌株號(hào)ATCC8739）。

根據(jù)產(chǎn)品的使用要求，可選用其他菌種作為檢驗(yàn)菌種，但菌種應(yīng)由國(guó)家級(jí)菌種保藏管理中心提供，

1

T/ZSA×××—××××

并應(yīng)在檢測(cè)報(bào)告中注明及說(shuō)明理由。

注：中國(guó)普通