高效液相色譜實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范一、引言高效液相色譜（HPLC）作為一種高精度的分離分析技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品、環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性與重復(fù)性，保障儀器設(shè)備的良好運(yùn)行及實(shí)驗(yàn)人員的安全，特制定本操作規(guī)范。本規(guī)范旨在為HPLC實(shí)驗(yàn)操作提供標(biāo)準(zhǔn)化指導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行相關(guān)操作前應(yīng)仔細(xì)閱讀并嚴(yán)格遵守。二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備與檢查（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與個(gè)人防護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保持清潔、干燥、通風(fēng)良好，避免強(qiáng)光直射及劇烈溫度波動。實(shí)驗(yàn)人員需穿著合適的實(shí)驗(yàn)服，佩戴防護(hù)眼鏡及一次性手套。長發(fā)者應(yīng)束發(fā)，不佩戴可能被儀器卷入的飾品。（二）儀器狀態(tài)檢查1.電源與連接：檢查儀器各模塊（泵、進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測器、工作站）的電源連接是否正常，數(shù)據(jù)線是否牢固。2.色譜柱：確認(rèn)色譜柱型號與實(shí)驗(yàn)要求一致，檢查色譜柱有無破損、固定相有無流失，連接管路是否匹配。若色譜柱為新裝或久置未用，需參考其說明書進(jìn)行預(yù)處理。3.流動相通路：檢查溶劑瓶是否清潔，瓶蓋及輸液管路是否完好，無漏液、堵塞現(xiàn)象。4.廢液處理：確保廢液瓶已正確放置，容量充足，并根據(jù)廢液性質(zhì)選擇合適的收集容器。（三）流動相的準(zhǔn)備1.溶劑選擇與純化：根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法要求選擇色譜純或分析純以上級別的溶劑。必要時(shí)，溶劑需進(jìn)行過濾、蒸餾等純化處理。2.混合與脫氣：按方法規(guī)定比例準(zhǔn)確混合流動相?；旌虾笮柽M(jìn)行脫氣處理，可采用超聲脫氣、真空脫氣或在線脫氣裝置，以去除溶解氧及氣泡，避免影響泵的正常工作和檢測器的基線穩(wěn)定性。3.過濾：流動相在使用前需通過適宜孔徑（通常為0.45μm或0.22μm）的濾膜過濾，水相和有機(jī)相需分別過濾，混合后再次過濾（若混合后可能產(chǎn)生沉淀則需特別注意）。4.pH調(diào)節(jié)：若實(shí)驗(yàn)方法要求特定pH值，需使用精密pH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，所用酸堿溶液濃度及純度應(yīng)符合要求。（四）樣品的準(zhǔn)備1.樣品處理：根據(jù)樣品性質(zhì)及實(shí)驗(yàn)要求，采用適當(dāng)方法（如溶解、萃取、離心、過濾等）對樣品進(jìn)行預(yù)處理，確保樣品澄清、無顆粒物，避免損壞色譜柱或污染儀器。2.濃度適配：樣品溶液濃度應(yīng)在檢測器線性響應(yīng)范圍內(nèi)，過高或過低均需進(jìn)行稀釋或濃縮處理。3.進(jìn)樣瓶準(zhǔn)備：將處理好的樣品溶液轉(zhuǎn)移至潔凈的進(jìn)樣瓶中，注意避免氣泡產(chǎn)生，蓋緊瓶蓋，做好清晰標(biāo)記。自動進(jìn)樣器需使用配套的樣品盤及進(jìn)樣瓶。（五）色譜柱的選擇與安裝根據(jù)待分離物質(zhì)的理化性質(zhì)（極性、分子量、酸堿性等）選擇合適固定相、規(guī)格（長度、內(nèi)徑、粒徑）的色譜柱。安裝時(shí)注意流向標(biāo)識，確保流動相入口與出口連接正確，接頭處應(yīng)擰緊但避免過度用力損壞螺紋或壓壞密封圈。三、儀器開機(jī)與系統(tǒng)平衡（一）開機(jī)順序通常按照“先外設(shè)后主機(jī)，先輔助后核心”的原則開機(jī)。建議順序：打開檢測器、柱溫箱等輔助設(shè)備電源，待其自檢完成后，再開啟泵和自動進(jìn)樣器電源，最后啟動色譜工作站軟件。（二）泵參數(shù)設(shè)置在工作站軟件中設(shè)置流動相組成（比例或梯度程序）、流速。初次使用或更換流動相時(shí)，應(yīng)先以較低流速（如0.2-0.5mL/min）啟動泵，觀察壓力是否正常，有無漏液現(xiàn)象，待確認(rèn)無誤后再逐漸升高至實(shí)驗(yàn)所需流速。（三）檢測器參數(shù)設(shè)置根據(jù)檢測需求設(shè)置檢測器類型（如紫外-可見、熒光、示差折光等）、檢測波長、靈敏度（增益）、采樣頻率等參數(shù)。紫外檢測器若需預(yù)熱，應(yīng)提前開啟。（四）柱溫箱設(shè)置按照實(shí)驗(yàn)方法要求設(shè)定柱溫，開啟柱溫箱加熱或制冷功能，待溫度穩(wěn)定后進(jìn)行后續(xù)操作。（五）系統(tǒng)平衡系統(tǒng)平衡是獲得穩(wěn)定基線和良好分離度的關(guān)鍵步驟。用實(shí)驗(yàn)所用流動相持續(xù)沖洗系統(tǒng)，觀察基線漂移和噪聲是否在可接受范圍內(nèi)，同時(shí)監(jiān)測柱壓是否穩(wěn)定。對于反相色譜，若之前使用了高比例水相，更換為高比例有機(jī)相時(shí)應(yīng)逐步過渡，避免固定相劇烈收縮。一般需平衡至少30分鐘至1小時(shí)，或直至基線平穩(wěn)（漂移<0.1mAU/min，噪聲<0.01mAU）。對于梯度洗脫，建議先運(yùn)行1-2次空白梯度程序，以消除系統(tǒng)殘留干擾。四、樣品測定（一）進(jìn)樣前準(zhǔn)備1.樣品混勻：進(jìn)樣前需將樣品瓶中的溶液輕輕混勻，避免濃度不均。2.進(jìn)樣針/進(jìn)樣器清洗：手動進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣針需用待進(jìn)樣品溶液潤洗至少3次；自動進(jìn)樣器應(yīng)確保洗針液充足，并設(shè)置合適的洗針程序。（二）進(jìn)樣操作1.手動進(jìn)樣：將進(jìn)樣閥扳至“Load”位置，用進(jìn)樣針吸取過量樣品溶液（通常為定量環(huán)體積的3-5倍），緩慢注入定量環(huán)，待溶液從廢液口溢出少許后，迅速將進(jìn)樣閥扳至“Inject”位置，同時(shí)啟動工作站采集數(shù)據(jù)。整個(gè)過程應(yīng)避免引入氣泡。2.自動進(jìn)樣：將樣品瓶按順序放入樣品盤，在工作站軟件中編輯樣品序列表（包括樣品名、進(jìn)樣體積、重復(fù)次數(shù)等），確認(rèn)無誤后啟動進(jìn)樣程序。（三）實(shí)驗(yàn)過程監(jiān)控實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)密切關(guān)注儀器運(yùn)行狀態(tài)，包括壓力曲線、基線變化、譜圖出峰情況。如發(fā)現(xiàn)壓力異常波動、基線漂移過大、出現(xiàn)鬼峰或峰形異常等情況，應(yīng)及時(shí)分析原因并采取相應(yīng)措施。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后操作（一）停泵與沖洗系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)完畢后，不應(yīng)立即關(guān)閉儀器。需先用適當(dāng)?shù)娜軇_洗色譜系統(tǒng)和色譜柱，以去除殘留的樣品和緩沖鹽。1.反相色譜：若流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)先使用不含鹽的過渡流動相（如水-甲醇或水-乙腈混合液，有機(jī)相比例可與原流動相相同或略高）沖洗，再用純有機(jī)相（如甲醇或乙腈）沖洗保存。2.正相色譜：通常用正己烷-乙酸乙酯等混合溶劑沖洗，最后用純正己烷保存。沖洗時(shí)流速可適當(dāng)降低，沖洗時(shí)間應(yīng)足夠長（一般每個(gè)色譜柱體積需沖洗10-20倍）。（二）關(guān)機(jī)順序待系統(tǒng)沖洗完畢后，關(guān)閉泵，然后依次關(guān)閉檢測器、柱溫箱等模塊電源，最后關(guān)閉工作站軟件及總電源。（三）數(shù)據(jù)保存與處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)及時(shí)在工作站中保存，并進(jìn)行備份。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶υ紨?shù)據(jù)進(jìn)行積分、校準(zhǔn)、計(jì)算等處理，生成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。原始數(shù)據(jù)及處理結(jié)果應(yīng)妥善保管，以備查驗(yàn)。（四）實(shí)驗(yàn)臺面清理清理實(shí)驗(yàn)臺面，將用過的樣品瓶、廢液等按規(guī)定分類處理。清洗所用玻璃器皿，歸置實(shí)驗(yàn)器材。（五）儀器使用記錄認(rèn)真填寫儀器使用記錄，包括使用日期、時(shí)間、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、儀器運(yùn)行狀況、異常情況及處理結(jié)果等。六、日常維護(hù)與注意事項(xiàng)（一）流動相相關(guān)1.流動相應(yīng)選用高純度溶劑，水應(yīng)為超純水或二次蒸餾水。2.流動相在使用前必須脫氣，并經(jīng)0.45μm（或0.22μm）濾膜過濾。3.混合流動相應(yīng)注意溶劑間的互溶性，避免產(chǎn)生沉淀或氣泡。4.含緩沖鹽的流動相應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時(shí)間放置滋生微生物或發(fā)生沉淀。5.溶劑瓶應(yīng)定期清洗，避免污染。（二）色譜柱保護(hù)1.避免使用極端pH值的流動相，防止固定相水解或溶解。2.避免使用對固定相有強(qiáng)吸附或化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)作為樣品或流動相添加劑。3.樣品必須經(jīng)過嚴(yán)格過濾，去除顆粒物。4.色譜柱使用完畢后需按規(guī)定沖洗并妥善保存，長時(shí)間不用時(shí)應(yīng)將兩端用堵頭密封。5.安裝和拆卸色譜柱時(shí)應(yīng)在泵停止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行。（三）進(jìn)樣器維護(hù)1.保持進(jìn)樣器清潔，防止樣品殘留和交叉污染。2.自動進(jìn)樣器的定量環(huán)、針座、洗針瓶等部件應(yīng)定期清洗或更換。3.手動進(jìn)樣閥在使用后應(yīng)及時(shí)清洗。（四）檢測器維護(hù)1.紫外檢測器的氘燈有一定使用壽命，達(dá)到壽命或能量不足時(shí)應(yīng)及時(shí)更換。2.避免檢測器流通池干涸，防止氣泡進(jìn)入。若有污染，可用適當(dāng)溶劑沖洗。3.示差折光檢測器對溫度敏感，實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度應(yīng)穩(wěn)定，避免震動。（五）定期檢查定期檢查儀器各連接管路是否老化、破損，接頭是否松動、漏液。檢查泵的密封圈、單向閥等易損部件的狀態(tài)，必要時(shí)進(jìn)行更換。七、安全注意事項(xiàng)1.化學(xué)品安全：熟悉所用流動相及樣品的化學(xué)性質(zhì)，避免接觸皮膚和吸入其蒸氣。有毒有害化學(xué)品應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。2.用電安全：確保儀器接地良好，避免濕手操作電源開關(guān)。儀器運(yùn)行時(shí)，禁止打開儀器面板或進(jìn)行帶電維修。3.廢液處理：實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的廢液應(yīng)分類收集，貼好標(biāo)簽，交由專業(yè)機(jī)構(gòu)處理，不得隨意傾倒。4.應(yīng)急預(yù)案：了解實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急設(shè)備（如洗眼器、緊急