實驗2：分離以尿素為氮源的微生物尿素是蛋白質降解的產(chǎn)物，通常用作植物的氮肥。但是植物的根幾乎不吸收尿素，尿素經(jīng)微生物(脲酶)分解為氨,氨溶解于水中成為銨根離子而被植物吸收。一、基礎知識1、尿素(脲)：大量尿素的存在會對環(huán)境造成污染，如土壤板結、肥料利用率下降、地下水污染等。例如：2、選擇培養(yǎng)基：

添加或減少某種成分，以允許某種微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中缺乏有機碳源時可篩選出自養(yǎng)型微生物只以尿素為氮源的培養(yǎng)基可篩選出含脲酶的微生物一、基礎知識3、玻璃砂漏斗：

玻璃砂(砂芯)漏斗有6種：

G1~G6(砂芯含有不同規(guī)格小孔)。G6孔徑最小，細菌不能濾過。

若培養(yǎng)基中含有不能加熱滅菌的化合物，如尿素(加熱會

分解)等，只能用G6玻璃砂漏斗過濾來除去微生物。

玻璃砂漏斗用前也要進行高壓蒸汽滅菌(121℃，15min)。

用后需用1mol/L的HCl浸泡，并抽濾去酸，再用蒸餾水洗至洗出液呈中性，干燥后保存。各種規(guī)格吸頭各種規(guī)格移液器移液器的使用

根據(jù)取用溶液體積選用適當

的移液器操作方法：設定體積安裝吸頭吸液放液卸掉吸頭從大值調整到小值時，逆時針旋轉體積調節(jié)按紐到剛好即可。從小值調整到大值時，應順時針先調至超過設定值后再回調。設定體積安裝吸頭將移液器頂端垂直插入吸頭，再輕輕用力下壓的同時，左右微微轉動，上緊即可。切記用力不能過猛，選擇與移液器匹配的吸頭。吸液1、預洗吸頭：吸取、排放樣液2~3次，讓吸頭內壁形成一道

同質液膜，確保移液工作的精度和準度。一般液體，正向吸液(將按鈕按到第一檔釋放吸液)粘稠液體和易揮發(fā)液體，反相吸液(將按鈕直接按到第二檔吸液)2、垂直吸液、慢吸慢放：吸頭垂直浸入液面2-4mm。盡量避

免吸頭浸入液面過深，以免液壓對吸液的精確度造成影響。

吸液速度切記不能過快，以免導致液體吸入移液器內部。將移液槍提離液面需停約1~3秒，觀察是否有液滴緩慢的流出。若有流出，說明有漏氣現(xiàn)象。卸掉吸頭

一般用力下按吸頭脫卸按紐即可卸掉吸頭。

將吸頭丟棄到廢物收集器中。

移液器如不使用，將刻度調到最大量程，使彈簧

恢復原形，延長移液器的使用壽命。（二）實驗原理：

在土壤中，存在一些細菌，它們含有脲酶，能分解尿素(脲)作為其生長的氮源(NH3)1.利用尿素培養(yǎng)基(以尿素為惟一氮源的選擇培養(yǎng)基)，分離出土壤中含脲酶的細菌。2CO32NH2OH+????+脲酶22)(ONH=C二、實驗內容2.細菌合成的脲酶能將尿素分解成NH3，致使PH升高，使酚紅指示劑變紅。為什么要設置全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基？起對照作用。土壤中含有多種細菌，在全營養(yǎng)LB培養(yǎng)基中，多數(shù)細菌都能生長；而在僅以尿素為氮源的培養(yǎng)基中，只有含有脲酶的微生物才能生長。1、為什么用瓊脂糖替代瓊脂作為固化劑？酚紅在此起什么作用？

瓊脂是末被純化的混合物，內含有一定量的含氮化合物。如果用瓊脂固化培養(yǎng)基，會為細菌提供一定量的非尿素類氮源，這樣會在尿素固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量以非尿素為氮源的細菌，不利于以尿素為氮源的細菌的篩選。

酚紅為酸堿指示劑，在酸性環(huán)境呈黃色，在堿性環(huán)境呈紅色。通過酚紅的顏色變化，可檢測培養(yǎng)基中pH的變化。思考與練習：注意：取樣時盡量只取懸液。稱量—溶化—調PH—分裝—加塞封口—包扎—滅菌二、實驗內容（五）實驗步驟：1、配制培養(yǎng)基并滅菌2、倒平板3、制備細菌懸液4、用涂布分離法分離細菌5、細菌培養(yǎng)6、觀察、對比全營養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基(除尿素外)均進行高壓蒸汽滅菌；尿素固體培養(yǎng)基待冷卻到60℃，加入用G6玻璃漏斗過濾的尿素溶液。用10-4和10-5的土壤稀釋液各濃度均做三個培養(yǎng)皿培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)，37℃24~48h。實驗組與對照組菌落數(shù)制成10-2、10-3、10-4、10-5土壤稀釋液用移液器取0.1ml土壤稀釋液用涂布器涂布分離二、實驗內容（六）實驗結果：10-4、10-5土壤稀釋液尿素培養(yǎng)基上涂布結果10-4、10-5土壤稀釋液全營養(yǎng)LB培養(yǎng)基上涂布結果

這說明能利用尿素的細菌在土壤菌群中只占少數(shù)。因為人和其他哺乳動物產(chǎn)生的排泄物畢竟是少量的，且尿素還可以在高溫下自然分解，因此，以尿素為氮源的菌群較少。4、與全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)相比，為什么尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落？思考與練習：2.有脲酶的細菌在生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定上起什么作用？3.有脲酶的細菌菌落周圍為什么有著色的環(huán)帶出現(xiàn)？

土壤中大量尿素的存在會對環(huán)境造成污染，如土壤板結、肥料利用率下降、地下水污染等。有脲酶的細菌能分解尿素，并利用所形成的氨，有利于自然界中的氮循環(huán)。

有脲酶的細菌向胞外分泌脲酶，使培養(yǎng)基中的尿素(中性)分解產(chǎn)生氨(堿性)，導致培養(yǎng)基中酚紅指示劑變?yōu)?/p>