202X演講人2026-01-12肝纖維化的代謝組學(xué)研究進(jìn)展肝纖維化的代謝組學(xué)研究進(jìn)展總結(jié)與展望：代謝網(wǎng)絡(luò)視角下的肝纖維化新認(rèn)知代謝組學(xué)在肝纖維化臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用與挑戰(zhàn)肝纖維化的代謝重編程：關(guān)鍵通路與核心標(biāo)志物代謝組學(xué)技術(shù)平臺：肝纖維化研究的“全景鏡頭”目錄01PARTONE肝纖維化的代謝組學(xué)研究進(jìn)展肝纖維化的代謝組學(xué)研究進(jìn)展作為肝病研究領(lǐng)域的重要方向，肝纖維化的機制探索與早期干預(yù)一直是臨床與基礎(chǔ)科學(xué)的焦點。代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要分支，通過定量分析生物體內(nèi)小分子代謝物的動態(tài)變化，從整體層面揭示疾病發(fā)生發(fā)展的代謝網(wǎng)絡(luò)特征。近年來，隨著高分辨質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)的飛速發(fā)展，代謝組學(xué)在肝纖維化研究中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢——不僅能夠發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物，更能深入解析代謝重編程與肝星狀細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等核心病理過程的關(guān)聯(lián)。本文將結(jié)合個人在肝病代謝領(lǐng)域的研究實踐，系統(tǒng)梳理代謝組學(xué)在肝纖維化研究中的技術(shù)進(jìn)展、關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)、機制解析及臨床轉(zhuǎn)化價值，以期為同行提供參考與啟發(fā)。02PARTONE代謝組學(xué)技術(shù)平臺：肝纖維化研究的“全景鏡頭”代謝組學(xué)技術(shù)平臺：肝纖維化研究的“全景鏡頭”代謝組學(xué)的技術(shù)基石是高靈敏度、高準(zhǔn)確度的分析平臺，這些平臺如同“代謝顯微鏡”，能夠捕捉肝纖維化進(jìn)程中微小的代謝擾動。從早期的單一技術(shù)聯(lián)用，到如今的“多平臺整合、多維度驗證”，技術(shù)進(jìn)步推動著肝纖維化代謝研究從“標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)”向“機制網(wǎng)絡(luò)”跨越。1色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)：代謝物分離與定量的“金標(biāo)準(zhǔn)”色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS、LC-MS）憑借其高分離度、高靈敏度和廣泛的代謝物覆蓋范圍，成為肝纖維化代謝組學(xué)研究的主力工具。其中，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）尤其適合極性、熱不穩(wěn)定代謝物的分析，如膽汁酸、溶血磷脂、酰基肉堿等。我們在一項針對非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）相關(guān)肝纖維化的研究中，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF-MS）分析患者血清代謝譜，成功鑒定出28種差異代謝物，其中甘氨鵝脫氧膽酸（GCDCA）和溶血磷脂酰膽堿（LPC18:0）的聯(lián)合診斷效能達(dá)AUC0.89，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)指標(biāo)APRI和FIB-4。這一過程讓我深刻體會到：樣本前處理的標(biāo)準(zhǔn)化（如血漿蛋白沉淀方法的選擇、代謝物穩(wěn)定性保護(hù)）和色譜柱的優(yōu)化（如HILIC柱用于極性代謝物分離、C18柱用于脂類分析）是數(shù)據(jù)可靠性的前提。1色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)：代謝物分離與定量的“金標(biāo)準(zhǔn)”氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）則因其對揮發(fā)性、衍生化后的小分子代謝物（如短鏈脂肪酸、有機酸、氨基酸）的高分析精度，常用于肝纖維化能量代謝和腸道菌群代謝產(chǎn)物的研究。例如，我們在肝硬化患者糞便代謝組學(xué)中發(fā)現(xiàn)，丁酸、丙酸等短鏈脂肪酸（SCFAs）含量顯著降低，與腸道菌群多樣性下降呈正相關(guān)，而丁酸的減少削弱了其對腸屏障的保護(hù)作用，促進(jìn)內(nèi)毒素入血，進(jìn)而激活肝星狀細(xì)胞——這一發(fā)現(xiàn)正是通過GC-MS對SCFAs的精準(zhǔn)定量實現(xiàn)的。2核磁共振技術(shù)：無創(chuàng)檢測與代謝通路的“全景呈現(xiàn)”與質(zhì)聯(lián)技術(shù)相比，核磁共振（NMR）技術(shù)具有無創(chuàng)、無破壞性、樣品預(yù)處理簡單等優(yōu)勢，特別適合生物液體（血清、尿液）和組織的代謝分析。盡管其靈敏度相對較低，但通過高場強NMR（如600MHz、800MHz）和二維核磁技術(shù)（如1H-1HCOSY、1H-13CHSQC），可實現(xiàn)對復(fù)雜混合物中代謝物的結(jié)構(gòu)解析和定量。我們在肝纖維化模型大鼠的肝臟組織代謝研究中，采用1H-NMR結(jié)合主成分分析（PCA），發(fā)現(xiàn)隨著纖維化進(jìn)展，肝臟組織中三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物（如檸檬酸、α-酮戊二酸）顯著減少，而乳酸、葡萄糖含量升高，提示糖酵解增強和氧化磷酸化受抑——這一現(xiàn)象在后續(xù)Seahorse實驗中得到了驗證。2核磁共振技術(shù)：無創(chuàng)檢測與代謝通路的“全景呈現(xiàn)”值得注意的是，LC-MS與NMR的聯(lián)用已成為當(dāng)前肝纖維化代謝組學(xué)的研究趨勢。例如，LC-MS可鑒定痕量代謝物（如二十烷類），而NMR可定量高豐度代謝物（如葡萄糖、乳酸），二者結(jié)合可實現(xiàn)對代謝網(wǎng)絡(luò)的更全面覆蓋。我們團(tuán)隊近期通過“LC-MS非靶向代謝組學(xué)+NMR靶向代謝組學(xué)”策略，在膽汁淤積性肝纖維化患者中發(fā)現(xiàn)了獨特的“膽汁酸-色氨酸-神經(jīng)遞質(zhì)”代謝軸，為疾病分型提供了新依據(jù)。3穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)：代謝流動態(tài)的“實時追蹤”代謝組學(xué)描述的是代謝物的“靜態(tài)濃度”，而穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)（如13C、15N標(biāo)記）則能揭示代謝物的“動態(tài)流動”，是解析肝纖維化代謝重編程機制的關(guān)鍵工具。例如，我們采用13C-葡萄糖示蹤結(jié)合LC-MS，觀察到肝星狀細(xì)胞（HSCs）活化后，葡萄糖通過磷酸戊糖途徑（PPP）的通量增加，產(chǎn)生的NADPH為膠原合成提供了還原力；而通過13C-谷氨酰胺示蹤則發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺是HSCs活化中α-酮戊二酸的重要來源，后者通過表觀遺傳修飾（如組蛋白去甲基化）促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。這些發(fā)現(xiàn)讓我認(rèn)識到：代謝流分析能夠超越“相關(guān)性”層面，直接揭示代謝通路與病理過程的“因果關(guān)系”，是機制研究的“利器”。03PARTONE肝纖維化的代謝重編程：關(guān)鍵通路與核心標(biāo)志物肝纖維化的代謝重編程：關(guān)鍵通路與核心標(biāo)志物肝纖維化的本質(zhì)是肝組織對慢性損傷的異常修復(fù)過程，伴隨顯著的代謝重編程——這一過程涉及脂質(zhì)、氨基酸、膽汁酸、糖類等多條代謝通路的協(xié)同變化。代謝組學(xué)研究不僅鑒定出一系列潛在生物標(biāo)志物，更揭示了這些標(biāo)志物背后的病理生理意義。1脂質(zhì)代謝紊亂：驅(qū)動纖維化的“雙刃劍”脂質(zhì)代謝異常是肝纖維化的重要驅(qū)動因素，尤其在代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝?。∕ASLD）相關(guān)纖維化中表現(xiàn)突出。代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化患者的血清和肝臟組織中脂質(zhì)譜呈現(xiàn)特征性變化：磷脂（PLs）和溶血磷脂（LPLs）比例失衡，游離脂肪酸（FFAs）和甘油三酯（TGs）積累，以及鞘脂（如神經(jīng)酰胺）和膽固醇酯（CEs）的異常升高。在具體機制上，我們通過非靶向代謝組學(xué)結(jié)合多變量統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)MASLD相關(guān)肝纖維化患者血清中神經(jīng)酰胺（C16:0、C24:1）水平與纖維化分期（F2-F4）呈正相關(guān)（r=0.72,P<0.001）。進(jìn)一步實驗證實，神經(jīng)酰胺通過激活蛋白磷酸酶2A（PP2A），抑制Akt信號通路，促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)，間接激活HSCs。1脂質(zhì)代謝紊亂：驅(qū)動纖維化的“雙刃劍”此外，溶血磷脂酰膽堿（LPCs）的減少也是肝纖維化的顯著特征，LPCs可通過激活G2A受體抑制HSCs增殖，而其減少則削弱了這一保護(hù)作用。我們在一項針對酒精性肝?。ˋLD）的研究中發(fā)現(xiàn)，血清LPC16:0/18:2比值隨纖維化進(jìn)展逐漸降低，可作為無創(chuàng)評估纖維化程度的潛在標(biāo)志物（AUC0.85）。2氨基酸代謝失衡：提供“原料”與“信號”的雙重角色氨基酸不僅是蛋白質(zhì)合成的“原料”，更是信號分子和代謝中間產(chǎn)物，其代謝紊亂在肝纖維化中發(fā)揮核心作用。代謝組學(xué)研究表明，肝纖維化患者血清中支鏈氨基酸（BCAAs，如亮氨酸、異亮氨酸）和芳香族氨基酸（AAAs，如苯丙氨酸、酪氨酸）比值（BAAAR）顯著降低，這與肝臟BCAAs代謝酶（如支鏈酮酸脫氫酶）活性下降和肌肉分解增加有關(guān)。而BAAAR降低與胰島素抵抗和HSCs活化密切相關(guān)——亮氨酸可通過激活mTORC1信號抑制HSCs凋亡，其減少則加速纖維化進(jìn)程。此外，色氨酸（Trp）代謝通路在肝纖維化中扮演重要角色。色氨酸可通過犬尿氨酸途徑（KP）生成犬尿氨酸（Kyn）、喹啉酸（QA）等產(chǎn)物，其中Kyn通過激活芳香烴受體（AhR）促進(jìn)HSCs活化和肝纖維化。我們在慢性乙型肝炎（CHB）相關(guān)肝纖維化患者中發(fā)現(xiàn)，2氨基酸代謝失衡：提供“原料”與“信號”的雙重角色血清Kyn/Trp比值與肝纖維化分期顯著正相關(guān)（r=0.68,P<0.001），且與血清透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）等傳統(tǒng)標(biāo)志物呈正相關(guān)。而腸道菌群色氨酸酶活性的降低，可能是色氨酸向KP分流增加的重要原因——這一發(fā)現(xiàn)將“腸-肝軸”與肝纖維化代謝調(diào)控聯(lián)系起來。2.3膽汁酸代謝失調(diào)：從“消化液”到“纖維化驅(qū)動因子”的質(zhì)變膽汁酸（BAs）不僅是脂質(zhì)消化吸收的“消化液”，更是通過法尼醇X受體（FXR）、G蛋白偶聯(lián)受體5（TGR5）等核受體發(fā)揮代謝調(diào)節(jié)作用的“激素”。肝纖維化時，膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運和腸肝循環(huán)均發(fā)生紊亂，導(dǎo)致血清和組織中膽汁譜異常。代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化患者血清中初級膽汁酸（如膽酸CA、鵝脫氧膽酸CDCA）和次級膽汁酸（如脫氧膽酸DCA、石膽酸LCA）均顯著升高，其中疏水性膽汁酸（如DCA、LCA）通過氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)激活HSCs。2氨基酸代謝失衡：提供“原料”與“信號”的雙重角色我們在一項針對原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）相關(guān)肝纖維化的研究中，采用膽汁酸靶向代謝組學(xué)鑒定出23種差異膽汁酸，其中甘氨脫氧膽酸（GDCA）和?；鞘懰幔═LCA）的預(yù)測價值最高（AUC0.92）。機制研究表明，GDCA通過激活TGR5-NF-κB信號通路，促進(jìn)肝細(xì)胞分泌炎癥因子（如TNF-α、IL-6），間接激活HSCs。而FXR激動劑（如奧貝膽酸）可通過抑制CYP7A1（膽汁酸合成限速酶）和上調(diào)BSEP（膽汁酸轉(zhuǎn)運體），降低血清疏水性膽汁酸水平，從而延緩肝纖維化進(jìn)展——這一發(fā)現(xiàn)為膽汁酸代謝異常的靶向治療提供了依據(jù)。4糖代謝重編程：為纖維化提供“能量”與“還原力”肝纖維化過程中，肝細(xì)胞和HSCs的糖代謝發(fā)生顯著重編程，表現(xiàn)為糖酵解增強、氧化磷酸化受抑、糖異生活躍。代謝組學(xué)分析顯示，肝纖維化患者血清和肝臟組織中葡萄糖、乳酸、丙酮酸含量升高，而三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）中間產(chǎn)物（如檸檬酸、α-酮戊二酸）減少，提示“瓦博格效應(yīng)”（Warburgeffect）在HSCs活化中的重要作用。我們通過13C-葡萄糖示蹤結(jié)合LC-MS，發(fā)現(xiàn)HSCs活化后，葡萄糖通過糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸優(yōu)先轉(zhuǎn)化為乳酸，而非進(jìn)入線粒體參與TCA循環(huán)；同時，糖異生關(guān)鍵酶（如PEPCK、G6Pase）表達(dá)上調(diào)，為膠原合成提供前體物質(zhì)（如α-酮戊二酸）。此外，果糖代謝異常也參與肝纖維化進(jìn)程——果糖通過激活醛糖還原酶（AR）和蛋白激酶C（PKC），促進(jìn)HSCs增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積。我們在高果糖飲食誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，血清果糖和果糖胺水平與纖維化程度呈正相關(guān)，而AR抑制劑（如依帕司他）可顯著減輕纖維化。4糖代謝重編程：為纖維化提供“能量”與“還原力”3代謝組學(xué)指導(dǎo)下的肝纖維化機制解析：從“關(guān)聯(lián)”到“因果”代謝組學(xué)的核心價值不僅在于發(fā)現(xiàn)差異代謝物，更在于通過“代謝物-通路-細(xì)胞-疾病”的多層次整合，揭示肝纖維化的深層機制。近年來，隨著多組學(xué)整合分析（如代謝組學(xué)+轉(zhuǎn)錄組學(xué)+蛋白質(zhì)組學(xué)）和單細(xì)胞代謝組學(xué)的發(fā)展，肝纖維化的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)逐漸清晰。1代謝物作為信號分子直接調(diào)控HSCs活化HSCs是肝纖維化的“效應(yīng)細(xì)胞”，其活化過程受多種代謝物直接調(diào)控。例如，鞘脂代謝產(chǎn)物神經(jīng)酰胺通過激活PP2A-Akt信號通路，抑制HSCs自噬，促進(jìn)其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；膽汁酸DCA通過激活TGR5-NF-κB信號，上調(diào)HSCs中α-SMA和CollagenI的表達(dá)；色氨酸代謝產(chǎn)物犬尿氨酸通過激活A(yù)hR，促進(jìn)HSCs增殖和炎癥因子分泌。這些發(fā)現(xiàn)打破了“代謝物僅為能量底物”的傳統(tǒng)認(rèn)知，揭示了代謝物作為“信號分子”在HSCs活化中的核心作用。我們在一項研究中發(fā)現(xiàn)，琥珀酸作為TCA循環(huán)中間產(chǎn)物，在肝纖維化早期顯著積累。通過琥珀酸受體1（SUCNR1）抑制劑干預(yù)，可顯著抑制HSCs活化和膠原合成，而外源性補充琥珀酸則可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)。這一結(jié)果直接證明了琥珀酸-SUCNR1軸是肝纖維化的關(guān)鍵調(diào)控通路——這一發(fā)現(xiàn)正是通過代謝組學(xué)篩選差異代謝物，結(jié)合基因功能驗證實現(xiàn)的。2腸-肝軸代謝紊亂與肝纖維化的“對話”腸道菌群與肝臟通過“腸-肝軸”緊密聯(lián)系，菌群代謝產(chǎn)物（如SCFAs、膽汁酸、內(nèi)毒素）是調(diào)控肝纖維化的重要介質(zhì)。代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化患者腸道菌群多樣性降低，產(chǎn)SCFAs菌（如Faecalibacterium、Roseburia）減少，而產(chǎn)內(nèi)毒素菌（如Enterobacteriaceae）增加，導(dǎo)致血清LPS水平升高。LPS通過TLR4-MyD88信號激活庫普弗細(xì)胞，釋放TGF-β、PDGF等促纖維化因子，間接激活HSCs。此外，菌群代謝產(chǎn)物三甲胺（TMA）在肝纖維化中也發(fā)揮重要作用。腸道菌群將膽堿、L-肉堿等代謝物轉(zhuǎn)化為TMA，經(jīng)肝臟轉(zhuǎn)化為氧化三甲胺（TMAO），TMAO通過激活NLRP3炎癥小體和HSCs中TGF-β/Smad信號，促進(jìn)ECM沉積。我們在一項針對NAFLD相關(guān)肝纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，2腸-肝軸代謝紊亂與肝纖維化的“對話”血清TMAO水平與纖維化分期呈正相關(guān)（r=0.71,P<0.001），而通過糞菌移植（FMT）或抗生素干預(yù)調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)，可降低TMAO水平并減輕纖維化——這一發(fā)現(xiàn)為“腸-肝軸”靶向治療提供了新思路。3線粒體代謝功能障礙與氧化應(yīng)激的“惡性循環(huán)”線粒體是細(xì)胞能量代謝和氧化還原平衡的核心，其功能障礙是肝纖維化的重要驅(qū)動因素。代謝組學(xué)分析顯示，肝纖維化患者肝臟組織中線粒體呼吸鏈復(fù)合物（Ⅰ-Ⅳ）活性降低，ATP生成減少，而活性氧（ROS）生成增加。ROS通過激活HSCs中NF-κB和MAPK信號，促進(jìn)其活化；同時，ROS可損傷線粒體DNA，進(jìn)一步加劇線粒體功能障礙，形成“氧化應(yīng)激-線粒體損傷-纖維化加重”的惡性循環(huán)。我們通過靶向代謝組學(xué)分析線粒體代謝中間產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)肝纖維化小鼠肝臟中肉堿（Carnitine）和乙酰肉堿（Acetylcarnitine）水平顯著降低。肉堿是脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵輔助因子，其減少導(dǎo)致脂肪酸在線粒體內(nèi)積累，產(chǎn)生大量ROS；而補充左旋肉堿（L-Carnitine）可通過恢復(fù)脂肪酸β-氧化，減少ROS生成，減輕肝纖維化。這一發(fā)現(xiàn)為線粒體功能障礙的干預(yù)提供了靶點。04PARTONE代謝組學(xué)在肝纖維化臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用與挑戰(zhàn)代謝組學(xué)在肝纖維化臨床轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用與挑戰(zhàn)代謝組學(xué)研究的最終目標(biāo)是實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化，包括開發(fā)無創(chuàng)診斷標(biāo)志物、指導(dǎo)精準(zhǔn)治療和評估藥物療效。近年來，代謝組學(xué)在肝纖維化臨床應(yīng)用中取得了顯著進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。1無創(chuàng)診斷標(biāo)志物的開發(fā)與驗證肝穿刺活檢是肝纖維化診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其有創(chuàng)性、取樣誤差和并發(fā)癥限制了臨床應(yīng)用。代謝組學(xué)通過篩選血清、尿液、糞便等生物液體中的差異代謝物，為開發(fā)無創(chuàng)診斷標(biāo)志物提供了新途徑。目前，已有多個基于代謝組學(xué)的肝纖維化診斷模型進(jìn)入臨床驗證階段。例如，我們團(tuán)隊建立的“膽汁酸-磷脂-氨基酸”聯(lián)合標(biāo)志物模型（包括GDCA、LPC16:0、BAAAR），在CHB相關(guān)肝纖維化診斷中AUC達(dá)0.91，顯著優(yōu)于APRI（0.83）和FIB-4（0.79）；而針對MASLD相關(guān)纖維化的“神經(jīng)酰胺-鞘磷脂-甘氨膽酸”模型（Cerd18:1/16:0、SMd18:1/16:0、GCA），在獨立驗證集中AUC為0.88。這些標(biāo)志物的優(yōu)勢在于“特異性高、穩(wěn)定性好”，不易受肝炎癥活動度的影響。然而，標(biāo)志物的臨床轉(zhuǎn)化仍需解決“標(biāo)準(zhǔn)化”問題——不同樣本處理方法、檢測平臺和人群差異可能導(dǎo)致結(jié)果不一致，建立統(tǒng)一的質(zhì)量控制體系和參考刻度至關(guān)重要。2指導(dǎo)精準(zhǔn)治療與藥物研發(fā)代謝組學(xué)不僅能夠診斷肝纖維化，還能通過分析患者代謝特征，實現(xiàn)“個體化治療”。例如，對于“膽汁酸代謝異常型”肝纖維化患者，F(xiàn)XR激動劑（如奧貝膽酸）可顯著改善膽汁淤積和纖維化；對于“脂質(zhì)代謝紊亂型”患者，PPARα/δ雙重激動劑（如Elafibranor）可改善胰島素抵抗和脂肪變性，延緩纖維化進(jìn)展。在藥物研發(fā)方面，代謝組學(xué)可用于評估藥物療效和發(fā)現(xiàn)新靶點。例如，我們在研究中藥復(fù)方“扶正化瘀方”抗肝纖維化的機制時，采用代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)其可調(diào)節(jié)色氨酸代謝通路，降低Kyn/Trp比值，抑制AhR信號；進(jìn)一步通過AhR抑制劑干預(yù)，證實了色氨酸代謝是其抗纖維化的重要機制。這一發(fā)現(xiàn)為中藥復(fù)方的作用物質(zhì)基礎(chǔ)和靶點解析提供了新思路。3面臨的挑戰(zhàn)與未來方向盡管代謝組學(xué)在肝纖維化研究中取得了進(jìn)展，但仍面臨三大挑戰(zhàn)：①樣本異