1、.,1,實(shí)驗(yàn)1-1 核苷酸的醋酸纖維膜電泳分離鑒定,.,2,帶電荷物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。 各種核苷酸在pH3.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中電離差異，帶有不同的凈電荷，在電場中的遷移率不一樣，從而達(dá)到分離的目的。,一、原理：,.,3,1、水平電泳儀、水平電泳槽、紫外檢測儀、電吹風(fēng)、 醋酸纖維膜。 2、0.02 mol/L 檸檬酸緩沖液(pH3.5)：取檸檬酸(C6H807.H20) 16.2g，檸檬酸三鈉(Na3C6H507.2H20) 6.7g。用蒸溜水溶解，定容到2000ml。 3、腺苷酸溶液： AMP、ADP、ATP，用水配成50mg/ml。,二、儀器與試劑：,.,4

2、,三、實(shí)驗(yàn)步驟：,1、準(zhǔn)備好電泳槽，向二邊槽內(nèi)加入檸檬酸緩沖液(pH3. 5)，使兩邊等高。 2、醋酸纖維素薄膜裁成28cm，先在蒸餾水潤濕，然后涼干。在粗糙面距一端1.5cm畫一條線，標(biāo)出點(diǎn)樣點(diǎn)。 3、點(diǎn)樣：用毛細(xì)管在點(diǎn)樣點(diǎn)處點(diǎn)樣2-3次， 注意斑點(diǎn)直徑23mm。 4、在電泳槽的陽極和陰極放入濾紙，使其下端浸入電泳緩沖液中。 5、粗糙面朝上，將醋酸纖維膜平穩(wěn)地放在電泳槽的濾紙架上，注意二點(diǎn)：點(diǎn)樣點(diǎn)在負(fù)極。濾紙橋與醋酸纖維膜貼緊。,.,5,6、蓋上電泳槽的蓋子，平衡10分鐘. 7、接上電極，點(diǎn)樣端在負(fù)極，接通電源，調(diào)整電壓在100V，室溫通電40分鐘。 8、電泳完畢后，關(guān)閉電源，取出濾紙，電吹

3、風(fēng)吹干。 9、在紫外燈下觀察，可見核苷酸的深藍(lán)色斑點(diǎn)。,.,6,畫出核苷酸在醋酸纖維膜上的位置，并分析其分離依據(jù)。,四、結(jié)果與討論：,.,7,實(shí)驗(yàn)1-2 Sephadex G-50分離生物大分子,.,8,1、凝膠層析法的原理：,凝膠層析是一種液相層析，其原理是分子篩效應(yīng)。 根據(jù)不同分子的分配系數(shù)不同而分離。 當(dāng)洗脫開始以后，小分子可進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流程長，流動慢；大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，流程短，流動快。這樣，就可使大小不同的分子分開。,.,9,.,10,總體積： Vt(total volume)， 外水體積：Vo(outer volume) 內(nèi)水體積： Vi(inner volume)

4、洗脫體積： Ve(elution volume) 干膠體積： Vg(gel volume) Vt（床體積）= Vo + Vi + Vg , Ve（洗脫體積 = Vo + KdVi。,層析的幾個(gè)主要參數(shù)：,.,11,Kd值的計(jì)算與意義：,Kd = (Ve-Vo) /Vi Kd=0,則Ve=Vo ，全排阻； Kd=1,則Ve=Vo+Vi ，全摻入； 0Kd1，則VeVo+Vi，Sephadex 對它們有吸附作用，如芳香族AA。,.,12,2、影響凝膠層析分離的因素：,2.1、樣品的體積、粘度。 2.2、層析柱 ：（高度，內(nèi)徑，材質(zhì)）。 2.3、洗脫液的流速： 過慢：擴(kuò)散； 過快：拖尾。 2.4、洗

5、脫液的離子強(qiáng)度、pH。,.,13,2.1、樣品的體積、粘度：,分析分離時(shí)：Vsample=1-4%Vbed； 制備分離時(shí)：Vsample=25-30%Vbed. 分離體積(Vsep): 相鄰兩組分Ve之差，用于衡量相鄰兩組分的分離效果。 Vsep=Ve1-Ve2 ，當(dāng)VsampleVsep時(shí)，則相鄰兩組分可完全分離。 相對粘度：樣品液粘度與洗脫液粘度的比值。分離效果只與相對粘度有關(guān)，一般來說，相對粘度不得超過1.52。 今天的上樣量（0.5ml）約為1%柱床體積。,.,14,2.2、層析柱：,柱長：組別分離時(shí)，530厘米； 分級分離時(shí)，可長至100厘米； 柱徑：分析分離時(shí)，由于樣品量少，常使用

6、1厘米直徑的層析柱，若制備分離時(shí)樣品量大，最好使用直徑23厘米的層析柱。 今天選用的是2cm 50cm的層析柱。,.,15,2.3、洗脫液的離子強(qiáng)度和pH值：,多糖類：水是最佳洗脫劑。 蛋白類：離子強(qiáng)度0.02M的鹽溶液作洗脫劑， 以消除凝膠的吸附作用。 pH7時(shí)，酸性物質(zhì)易被洗脫。 pH7時(shí)，堿性物質(zhì)易被洗脫。,.,16,3、凝膠層析法的應(yīng)用：,1、分子量的測定: 利用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白洗脫，制備洗脫標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2、多組分混合物的分離: 利用Kd的差異分離。 3、脫鹽與分離純化: 用于脫鹽的凝膠多為顆粒大、交聯(lián)度高的凝膠。 此時(shí)，溶液中大分子（如蛋白質(zhì)）的kd=0，鹽類的kd=1，易于分離

7、脫鹽。,.,17,4、凝膠的特性、種類、使用與保存：,凝膠是一種具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)（如葡聚糖、 瓊脂糖、聚丙烯酰胺等), 吸收大量液體（水或洗脫 液）溶脹而成。,.,18,4.1、凝膠的特性：,1、惰性：保證其不與待分離物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 2、穩(wěn)定。 3、低電荷：避免離子交換效應(yīng)的發(fā)生。 4、足夠的機(jī)械強(qiáng)度：在一定的操作壓下不形變。,.,19,4.2、凝膠的幾種主要類型：,1、天然凝膠： 馬鈴薯淀粉凝膠、瓊脂及瓊脂糖凝膠 。 2、人工合成凝膠： 聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠 。,.,20,葡聚糖凝膠 的型號：,目前，凝膠層析法中使用最廣泛的一類層析凝膠，商品名稱：Sephadex。其基本

8、骨架是葡聚糖，它是由右旋葡萄糖殘基通過1，6糖苷鍵連接而成，葡聚糖分子之間通過醚橋（甘油基）交聯(lián)形成三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。,.,21,.,22,4.3、Sephadex的使用原則：,1、型號選擇： 組別分離：Sephadex G25最為常用。例如 樣品中緩沖液的更換，蛋白質(zhì)的脫鹽 ； 分級分離：多種蛋白質(zhì)分離時(shí)，根據(jù)待分離物中各組分的分子量大小和分布范圍來確定型號。同時(shí)，參考商家產(chǎn)品信息。 2、粒度的選擇 ： 組別分離時(shí)，選用較粗的顆粒。 分級分離時(shí)，以細(xì)顆粒凝膠為主，而且要求顆粒大小均勻。 同型號的膠，同樣的床體積，粒度小的膠對樣品的分離度要優(yōu) 于粒度大的膠，即有較高的分辨率。,.,23,4.4

9、、凝膠的防腐、保存：,Sephadex、Sepharose 是多糖類物質(zhì)，易于長菌。因 此，常在凝膠不用時(shí)，加入抑菌劑，使用時(shí)再除去。 1. 常用0.02疊氮鈉作防腐劑。 2. 常用20乙醇溶液保存各類凝膠。,.,24,5 儀器、材料：,1、儀器與材料：柱層析裝置、Sephadex G-50。 2、樣品混合物：藍(lán)色葡聚糖-200 (MW=2000kDa,藍(lán)色)、細(xì)胞色素C (MW=12.4kDa，紅色)和重鉻酸鉀(K2Cr2O7, MW=294.18，黃色)的混合物。 3、洗脫液：蒸餾水。,.,25,6、實(shí)驗(yàn)步驟：,6.1、凝膠用量的計(jì)算。 6.2、凝膠的溶脹。 6.3、裝柱與平衡。 6.4、

10、上樣。 6.5、洗脫和收集。 6.6、繪制洗脫曲線。 6.7、凝膠的回收與保存。,.,26,6.1、凝膠用量的計(jì)算：,根據(jù)層析柱的容積和所選凝膠溶脹后的柱床體 積計(jì)算出所需凝膠干粉的重量。 凝膠的克數(shù) Vbed Vc 。,.,27,.,28,6.2、凝膠的溶脹：,稱取3克Sephadex G-50凝膠干粉投入燒杯中，加 60mL蒸餾水，在沸水中溶脹2小時(shí)。 沸水浴溶脹的好處： 省時(shí)，還可消毒，驅(qū)除凝膠顆粒內(nèi)部的氣泡。,.,29,6.3、裝柱與平衡：,將洗凈的層析柱垂直固定在支架上。柱內(nèi)裝滿蒸餾水，排除層析柱連接系統(tǒng)內(nèi)的空氣，關(guān)閉出口。打開柱底部的夾子，調(diào)節(jié)流速，以0.5mL/min流速慢慢流下

11、，柱內(nèi)留下約2/3柱體積的蒸餾水。然后，一邊用玻棒攪拌，一邊用滴管緩慢地加入Sephadex G-50漿液，使凝膠均勻沉降。連續(xù)地灌注凝膠漿液，直到凝膠沉降到距上端5 cm為止。膠床上部保持2-3 cm水層，關(guān)閉下部出口。室溫靜置2 h，以平衡凝膠。,注意點(diǎn)：防止膠床出現(xiàn)氣泡、斷層。,.,30,6.4、上樣：,上樣前： 1. 柱子要用洗脫液洗脫平衡。 2. 除去膠面之上的液體：用吸管吸，或打開層析柱下的止水夾，使凝膠表面上的蒸餾水剛好流入膠面，迅速關(guān)閉止水夾，以防空氣進(jìn)入凝膠。,.,31,上樣： 用自動進(jìn)樣器吸取0. 5 ml混合樣品，小心地加到柱床表面（切勿沖動膠面），保持膠面平整.使樣品液成一薄層。 2. 隨即打開層析柱下面的出口，使樣品完全進(jìn)入膠柱內(nèi)。 3. 用滴管小心地加少許蒸餾水到凝膠的上表面。使膠面上保持2-3cm厚的水層。 4. 同時(shí)，接通洗脫液，用刻度試管，分別收集洗脫液。,.,32,6.5、洗脫和收集：,調(diào)節(jié)洗脫液流速為0.5 ml/min, 仔細(xì)觀察柱內(nèi)樣品分離現(xiàn)蒙，用刻度試管收集并置取洗脫液的體積。等蘭色到柱的燒結(jié)板時(shí)再另換一個(gè)刻度試管收集，用刻度試管收集并量取洗脫液的體積。,.,33,注意觀察樣品的分離現(xiàn)象。最后，根據(jù)記錄的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算層析柱的Vo、Vi以及樣品的Ve、Kd。,6. 6、繪制洗脫曲線：,在座標(biāo)紙上以洗脫體積為橫座標(biāo)，以洗脫液顏色深度為縱