1、本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告光合色素的提取、理化性質(zhì) 分離、吸收光譜及含量的測(cè)定學(xué)號(hào)： 134120171 姓名： 王曉蓮 學(xué)院： 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)、班級(jí) 13生物科學(xué)C班 實(shí)驗(yàn)課程名稱： 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn) 教師及職稱： 李忠光 開課學(xué)期： 2015 至 2016 學(xué)年 下 學(xué)期 填報(bào)時(shí)間： 2016 年 4 月 2 日云南師范大學(xué)教務(wù)處編印實(shí)驗(yàn)序號(hào) 實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)名稱光合色素的提取、理化性質(zhì)分離、吸收光譜及含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)間2016.3.15-29實(shí)驗(yàn)室睿智三4281實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）掌握光合色素的提取方法以及了解有關(guān)的理化性質(zhì)。（2）掌握光合色素的分離方法以及了解有關(guān)的吸收光譜。（3）掌握用分光光度計(jì)測(cè)

2、定葉綠素含量的方法2 實(shí)驗(yàn)原理光合色素的提取與理化性質(zhì) 光合色素能溶于具有一定極性的有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇等。提取液中無(wú)任何電子受體，因此可以觀察熒光現(xiàn)象。離體葉綠素在有氧氣和光照條件下，發(fā)生光氧化作用，結(jié)構(gòu)遭到破壞，形成加氧葉綠素等產(chǎn)物。葉綠素是一種雙羧酸酯，可以發(fā)生皂化反應(yīng)。葉綠素分子中Mg2+與仆啉環(huán)結(jié)合不穩(wěn)定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等離子所取代。 光合色素的分離與吸收光譜 光合色素能溶于具有一定極性的有機(jī)溶劑，如丙酮、乙醇等。不同光合色素的分子量、分子結(jié)構(gòu)、極性、溶解度、支持物對(duì)它們的吸附力等不同，因而分配系數(shù)不同，故彼此可以分開。葉綠素的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)光有很強(qiáng)的吸收，主要是紅光

3、和藍(lán)紫光。 光合色素含量的測(cè)定混合液中的兩個(gè)或多各組分，只要它們的光譜吸收峰不互相重疊，仍然可以根據(jù)Lambert-Beer定律（A = k L C）求出各組分含量。Lambert定律：A = k L；Beer定律A = k C。葉綠素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分別為663nm、645nm，由此得出：見推導(dǎo)過程Ca = 12.7 A663 2.69 A645；Cb = 22.9 A645 4.68 A663Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A645A663 = Ca.ka1 + Cb.kb1 A645 = Cb.kb2 + Ca.ka2由于K是一個(gè)常數(shù)，而A可以通過分光

4、光度計(jì)測(cè)出，故求二元一次方程組可得到此公式。k比吸收系數(shù)。即溶劑和波長(zhǎng)不變的情況下，當(dāng)物質(zhì)的濃度(C)為1g/L(0.1%)，比色皿的直徑(光徑，L)為1cm時(shí)所測(cè)出的吸光度即為比吸收系數(shù)。故其單位為：摩爾吸收系數(shù)。即溶劑和波長(zhǎng)不變的情況下，當(dāng)物質(zhì)的濃度(C)為1mol/L，比色皿的直徑(光徑，L)為1cm時(shí)所測(cè)出的吸光度即為摩爾吸收系數(shù)。故其單位為： 3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料（1） 材料 新鮮植物葉片、丙酮、碳酸鈣、石英砂、20%KOH甲醇溶液、苯、 自來(lái)水、50%醋酸、醋酸銅、啟動(dòng)劑、80%丙酮（2） 實(shí)驗(yàn)設(shè)備試管、濾紙、研缽、玻璃棒、錐形瓶、剪刀、移液管、洗耳球、燒杯、漏斗、離心機(jī)、便攜式葉綠

5、素測(cè)定儀、分光光度計(jì)、天平、離心管、滴管4實(shí)驗(yàn)步驟光合色素的提取與理化性質(zhì)（1）光合色素的提取：將植物葉片洗凈并用濾紙洗干，取1/2片葉片，放入研缽中并加入少許CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。（2）觀察熒光現(xiàn)象：與光線垂直的方向觀察色素顏色。（3）光破壞作用：1ml色素提取液于室內(nèi)，1ml于太陽(yáng)光下，30min后觀察顏色變化。（4）皂化反應(yīng)：取一支試管，加入色素提取液2.5ml，再加入20%KOH甲醇溶液1ml，搖勻，再加入苯2.5ml，輕輕搖動(dòng)，沿試管壁慢慢加入自來(lái)水1ml，輕輕搖動(dòng)后觀察，注意觀察整個(gè)過程顏色的變

6、化。（5）取代反應(yīng)：取一支試管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液變?yōu)辄S褐色。倒出一半，加入少許醋酸銅粉末，酒精燈上加熱，與另一半比較顏色的差異。II 光合色素的分離與吸收光譜（1） 光合色素的提?。簩⒅参锶~片洗凈并用濾紙洗干，取1/3片葉片，放入研缽中并加入少許CaCO3和石英砂及5 ml丙酮，充分研磨，再加入10 ml丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。（2） 光合色素分離：剪取適當(dāng)長(zhǎng)度和寬度的濾紙條 用上行紙層析法分離色素 啟動(dòng)劑：石油醚：丙酮：苯=10：2：1（3） 吸收光譜的測(cè)定 光合色素的吸收光譜：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL，搖勻后在分光光度計(jì)上40

7、0到700 nm處每隔10 nm進(jìn)行掃描。 各色素的吸收光譜：上述層析出的34種色素，分別剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法掃描。III 光合色素含量的測(cè)定方法一：快速測(cè)定法 由于葉綠素a、b在652nm處有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1?？芍苯佑帽銛y式葉綠素測(cè)定儀測(cè)定植物葉片的葉綠素含量，最后濃度單位為mg/dm2方法二: 分光光度計(jì)法色素提?。簩⑸鲜鲋参锶~片洗凈并用濾紙吸干，準(zhǔn)確稱取已知的葉圓片0.05g左右，加入少許CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，轉(zhuǎn)入離心管中（離心機(jī)使用），再用5ml 80%丙酮洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管中，平衡，5000rpm離心10mi

8、n, 記錄上清液體積，取1ml稀釋到4ml。測(cè)定：以1cm比色皿分別測(cè)定A663、A645。使A控制在0.1 0.8之間。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析光合色素的提取與理化性質(zhì) 一層：淺黃綠色(1)皂化反應(yīng)：溶液分為三層 二層：淺綠色 三層：深綠色輕輕搖晃過程中：第一層由淺綠色逐漸變?yōu)辄S綠色 第二三層逐漸變?yōu)橐粚樱罹G色 在第一層下面出現(xiàn)一層油滴層 原因:葉綠素是一種由葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復(fù)雜酯，故可與堿起皂化反應(yīng)而生成甲醇和葉綠醇及葉綠酸鹽，產(chǎn)生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開(2) 熒光現(xiàn)象的觀察 用肉眼可以觀察到葉綠素提取液在直射光照射下，反射光為藍(lán)綠色，透射光為深紅色 原因：

9、葉綠素吸收光量子而轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當(dāng)它變回到基態(tài)時(shí)可發(fā)射出紅光量子，因而產(chǎn)生熒光；反射光呈藍(lán)綠色是因?yàn)槿~綠素對(duì)藍(lán)綠色光的吸收很少，而對(duì)于其他顏色光的吸收很多，所以會(huì)呈現(xiàn)出藍(lán)綠色的反射光II 光合色素的分離與吸收光譜 光合色素的分離如圖所示將涂有葉綠體色素的濾紙放入層析液后，葉綠體色素隨層析液沿濾紙向上推進(jìn)，在濾紙上分為四個(gè)條帶，其顏色由下至上分別為黃綠色、藍(lán)綠色、黃色、橙黃色，由資料可知由下至上依次為葉綠素b、葉綠素a、葉黃素、胡蘿卜素；其中藍(lán)綠色條帶最寬，黃綠色條帶次之，黃色、橙黃色條帶較細(xì)，說明葉綠體中含量較多的是葉綠素a和葉綠素b。吸收光譜（附圖）III 光合色

10、素含量的測(cè)定方法一：快速測(cè)定法序號(hào)1234平均值含量（mg/dm2）31.630.531.627.630.3方法二: 分光光度計(jì)法波長(zhǎng)(nm)663645含量（A）0.2070.077 Ca = 12.7 A663 2.69 A645 Ca=2.42mg/L Cb = 22.9 A645 4.68 A663 Cb=0.79mg/L Ca+b=8.02A663+20.20A645 Ca+b=3.12mg/L各葉綠素含量：V=10mlW=0.05g由公式：Chl content=(mg.g-1FW) Chla=484mg.g-1FW Chlb=158mg.g-1FW 6、 思考題1、 為什么在皂化

11、反應(yīng)中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液？ 因?yàn)樯夭荒苋苡谒?，甲醇其?shí)在這里只是當(dāng)做溶劑使用，化學(xué)中有“相似相容”，色素是有機(jī)物所以只能溶于有機(jī)溶劑2、 光合色素的吸收光譜對(duì)我們理解光合作用有何意義？ 葉綠體色素的吸收光譜的來(lái)年改革峰值分別在430nm左右和660nm左右?；静晃站G光，因而綠光被反射而是葉子（大部分）顯綠色。也就是說主要吸收這些波長(zhǎng)的光的能量在葉綠體內(nèi)合成植物所需要的物質(zhì)。3、試論述高等植物光合色素的種類和生理功能 植物含有幾種類型的葉綠素，它們之間的差別在于烴側(cè)鏈的不同。大多數(shù)能進(jìn)行光合作用的細(xì)胞還有第二種類型的葉綠素，即葉綠素b或葉綠素c。在高等植

12、物的細(xì)胞中含有葉綠素b,而在其它一些類型的細(xì)胞中含有葉綠素c。不同類型的葉綠素對(duì)光的吸收也是不同的，如葉綠素a最大的吸收光的波長(zhǎng)在420663nm,葉綠素b的最大吸收波長(zhǎng)范圍在460645nm。當(dāng)葉綠素分子位于葉綠體膜上時(shí)，由于葉綠素與膜蛋白的相互作用，會(huì)使光吸收的特性稍有改變。4、 一般正常的植物葉片，Chla / Chlb = 3 / 1，你所測(cè)定的結(jié)果符合此比例嗎？ Chla=484mg.g-1FW Chlb=158mg.g-1FW 符合5、兩種測(cè)定方法含量有何不同？為什么？ 快速測(cè)定法用便攜式葉綠素測(cè)定儀測(cè)定植物葉片的葉綠素含量，局部含量測(cè)定。比較準(zhǔn)確，但不便于整體測(cè)定，取樣多次平均值也不能代表整體葉綠素含量；分光光度計(jì)法采用低雜散光,高分辨率的單光束單色器,保證了波長(zhǎng)準(zhǔn)確度.波長(zhǎng)重復(fù)性和更高的分辨率,自動(dòng)調(diào)0%T和100%T,自動(dòng)調(diào)波長(zhǎng)用多種方法的數(shù)據(jù)處理功能,高分辨,寬大的樣品糟,可容納100mm,光徑吸收池和相應(yīng)的反射附件,儀器配有標(biāo)準(zhǔn)的RS-232雙向通訊接口,可外接打印機(jī),打印相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).個(gè)性代的外形設(shè)計(jì),輕觸式按鍵使操作更為方便.可見分光光度計(jì)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥,衛(wèi)生,化工,學(xué)校,生物化學(xué),石油化工,質(zhì)量控制,環(huán)境保護(hù)