1、曲霉菌實時熒光定量PCR檢測體系的建立,研究生 導(dǎo) 師 學(xué) 院,The establishment of real-time fluorescent quantitative PCR assays for the detection of Aspergillus,.,1. 研究背景 2. 研究目的 3. 實驗路線 4. 第一部分 曲霉菌標準株的培養(yǎng)與DNA提取 5. 第二部分 曲霉菌FQ-PCR檢測體系的建立及評價 6. 結(jié)果與討論 7. 全文結(jié)論,目 錄,.,研究背景,.,研究背景,曲霉菌屬(aspergillus )： 屬絲狀真菌，是一種常見的條件致病性真菌，好發(fā)于免疫低下及缺陷的人群 在

2、免疫缺陷、惡性腫瘤、器官移植 患者中的感染率呈上升趨勢,Yu Y,Am Jperinatol,2013 Mellado E. Rev lberoam Micol,2013 Armstrong-James D. Trends in microbiology, 2014 Kauffman C A. Fungal infections. 2013,.,研究背景,地方性真菌1%,地方性真菌3.5%,1990年-1999年,2000年-2008年,leukemia patients,M.D. Anderson Cancer center ,CID,2010,50:405-15 楊尚倫. 急性淋巴細胞白血

3、病真菌感染臨床特點分析J. 實用癌癥志, 2014(9):1182-1184.,2008年-2013年,.,研究背景,侵襲性曲霉菌病（Invasive Aspergillosis, IA）：是感染曲霉菌所引起的一種慢性霉菌病 最常見的致病性曲霉菌：煙曲霉菌、黃曲霉菌 土曲霉菌、黑曲霉菌,Arvanitis M. Clinical Infectious Diseases, 2015 Kwon-Chung KJ. PLoS Pathog .2013,.,研究背景,曲霉菌輔助檢查方法,直接涂片和培養(yǎng) 陽性率低,取材有創(chuàng)、困難,真菌感染診斷的研究熱點,缺乏特異性，特征性表現(xiàn)出現(xiàn)晚,靈敏性、特異性高，但

4、易受影響，出現(xiàn)假陽性及假陰性,.,FQ-PCR技術(shù)在病毒感染的診斷檢查技術(shù)方面已經(jīng)成熟 目前沒有標準的用于臨床的曲霉菌FQ-PCR檢測試劑盒（CFDA檢索） 前期已成功建立了念珠菌及新型隱球菌實時熒光定量PCR檢測體系,研究背景,LauA Methods Mol Biol,2013 Aittakorpi A. Journal of clinical microbiology, 2012,.,建立曲霉菌實時熒光定量PCR檢測體系 ，關(guān)鍵在于曲霉菌DNA的提取和特異性引物探針的設(shè)計,研究背景,.,研究背景,曲霉菌DNA提取方法,史俊艷. 臨床常見曲霉菌體外藥物敏感性及分子生物學(xué)鑒定方法研究D. 中

5、國協(xié)和醫(yī)科大學(xué), 2010. Klimek-Ochab M. Folia Microbiologica, 2011,.,研究背景,曲霉菌DNA提取方法的選取,物理方法,液氮研磨法：次之，已有商品化試劑盒,玻璃珠機研磨法：最佳，但耗時長,超聲波降解法,化學(xué)方法,CTAB緩沖液加微波法,酶消化法：快速有效,高滲震擾法,Klimek-Ochab M. Folia Microbiologica, 2011 Rittenour W R. Journal of Environmental Monitoring, 2012 OConnor L. US20110311969P. 2011,.,研究背景,Gad

6、e L, Eukaryot Cell, 2013 Ogawa M. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2012 Robinson S L.Mycologia, 2012 Yuquan X. Applied & Environmental Microbiology, 2013,擴增靶序列的選取,1.探針不保守 2.引物Tm值不達要求,.,初步設(shè)計合成的四種曲霉菌引物探針序列（每種2套）,研究背景,.,研究目的,.,課題來源,湖南省科技廳科技計劃項目（2013FJ6028）兒童血液腫瘤疾病侵襲性真菌感染的PCR檢測研究,湖南省科技廳科技計劃項目（2013FJ602

7、8）兒童血液腫瘤疾病侵襲性真菌感染的PCR檢測研究,湖南省科技廳科技計劃項目（2013FJ6028）兒童血液腫瘤疾病侵襲性真菌感染的PCR檢測研究,湖南省科技廳科技計劃項目（2013FJ6028）兒童血液腫瘤疾病侵襲性真菌感染的PCR檢測研究,.,實驗線路,.,曲霉菌標準株的接種及培養(yǎng),制備提取DNA的標本,200mg左右的固體組織,105 個孢子/ml的混懸液,液氮研磨法,一步結(jié)合加熱法,下載曲霉菌特異性序列,設(shè)計引物探針并Blast對比,篩選引物探針,建立的熒光定量PCR檢測體系，并進行重復(fù)性、特異性、靈敏性評估,1.分光光度計進行比較 2.熒光定量PCR進行比較,引物探針送上海合成,.,

8、第一部分 曲霉菌標準株的培養(yǎng)與 DNA提取方法的比較,.,材料與方法,.,實驗材料,實驗菌株 真菌標準株：煙曲霉(CGMCC3.5305)、黃曲霉(CGMCC3.5306)、土曲霉(CGMCC3.4341)、黑曲霉(CGMCC3.4335)購買于中國通微生物菌種保藏管理中心 主要試劑 一步法結(jié)合加熱法DNA提取試劑盒：湖南圣湘生物有限公司 E.Z.N.A. TM Fungal DNA Mini Kit(真菌DNA提取試劑盒)：OMEGA公司,.,實驗方法,1.SDA培養(yǎng)基培養(yǎng)曲霉菌 2.制備DNA提取標本及提取DNA 3.分光光度計檢測兩種方法的DNA濃度及OD值 4.熒光定量PCR比較兩種方

9、法，觀察曲線 5.利用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析不同方法提取DNA擴增的效果,.,實驗結(jié)果與討論,.,23,不同曲霉菌在SDA培養(yǎng)基上生長形態(tài),煙曲霉菌,黃曲霉菌,土曲霉菌,黑曲霉菌,結(jié)果與討論：1.曲霉菌的培養(yǎng),.,24,不同曲霉菌光鏡下菌落形態(tài),煙曲霉菌（X100）,黃曲霉菌（X100）,土曲霉菌（X100）,黑曲霉菌（X40）,結(jié)果與討論：1.曲霉菌的培養(yǎng),.,肉眼觀察SDA培養(yǎng)基上四種的菌落形態(tài)及顏色,結(jié)果與討論：1.曲霉菌的培養(yǎng),.,結(jié)果與討論：1.曲霉菌的培養(yǎng),曲霉菌培養(yǎng)的污染問題,因空氣中廣泛存在各種霉菌孢子，接種時若培養(yǎng)基長期暴露在空氣中，則容易被污染 同時高濃度培養(yǎng)的標準株

10、若孢子紛飛可對實驗室造成災(zāi)難性的損害，所以曲霉菌的接種及標本的制備必須在至少2級生物安全柜中進行，于接種前紫外燈照射半小時，接種后至少照射2小時,.,表：分光光度計測量液氮研磨法提取的DNA純度和OD值,注：一步結(jié)合加熱法提取的DNA量少，低于分光光度計檢測的下限，未能檢測出OD值，但兩者樣本的基礎(chǔ)組織量不同，不具有可比性,結(jié)果與討論：2.DNA提取方法的比較,.,結(jié)果與討論：2.DNA提取方法的比較,液氮研磨法與一步結(jié)合加熱法提取DNA行實時熒光定量PCR的比較,液氮研磨法,一步結(jié)合加熱法,擴增曲線均為“S”型,.,結(jié)果與討論：2.DNA提取方法的比較,兩種DNA提取方法Ct值的比較,P0.

11、05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即兩種方法提取DNA進行熒光定量PCR檢測無明顯統(tǒng)計學(xué)差異,.,兩種DNA提取方法的對比,結(jié)果與討論：DNA提取方法的比較,.,第二部分 曲霉菌FQ-PCR檢測體系的建立及評價,.,材料與方法,.,實驗菌株 實驗用真菌標準株：多種曲霉菌購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心 湖南省微生物室提供多種細菌。 湖南圣湘生物有限提供乙肝病毒、支原體、衣原體、巨細胞病毒、結(jié)核菌、EB病毒。 主要試劑 Taq酶、 Tris-HCl EDTA、Buffer、dNTP（0.1mol/L）、MgCl2（1mol/L）、PCR引物和探針,實驗材料,.,實驗方法,1. 設(shè)計引物探針 2. 篩選

12、引物探針 3.PCR擴增產(chǎn)物送檢測序 4.培養(yǎng)其他曲霉菌及收集實驗室標本評估體系特異性 5.檢測體系重復(fù)性：采用三種不同濃度的標本，批內(nèi)：每一濃度同一天重復(fù)點樣20次，批間：每一濃度連續(xù)5天重復(fù)點樣20次，計算Ct值變異系數(shù)（CV），若CV5%，重復(fù)性好 6. 靈敏性檢測：取102個孢子/ml標準菌株懸浮液按1:1、1:2、1:3的比例稀釋進行FQ-PCR,.,實時熒光定量擴增條件：94 C 預(yù)變性5min后進入循環(huán)， 94 C 15s、57 C 30s ，共45個循環(huán)，在每個循環(huán)末收集熒光信號。,實時熒光定量PCR反應(yīng)體系（50ul）,實驗方法,.,實驗結(jié)果與討論,.,液氮研磨法提取的DNA

13、為底物，四種曲霉菌不同引物、探針 行實時熒光定量PCR擴增曲線,A.fumigatus引物探針1,A.fumigatus引物探針2,A.flavus引物探針1,A.flavus引物探針2,結(jié)果與討論：1.引物探針的篩選,.,液氮研磨法提取的DNA為底物，四種曲霉菌不同引物、探針 行實時熒光定量PCR擴增曲線,A.terreus引物探針1,A.terreus引物探針2,A.niger引物探針1,A.niger引物探針2,結(jié)果與討論：1.引物探針的篩選,.,結(jié)果與討論：1.引物探針的篩選,四種曲霉菌篩選完成的引物探針序列,.,結(jié)果與討論：2.擴增產(chǎn)物測序,普通PCR擴增產(chǎn)物進行電泳分析,四種曲霉菌

14、DNA的特異性序列擴增產(chǎn)物電泳條帶清晰、亮度高，無拖帶、涂抹帶現(xiàn)象，擴增產(chǎn)物長度均約為100bp左右，擴增產(chǎn)物完整性好,.,結(jié)果與討論：2.擴增產(chǎn)物測序,PCR擴增產(chǎn)物送至上海公司測序Blast結(jié)果,.,結(jié)果與討論：3.特異性檢測,四種曲霉菌FQ-PCR特異性檢測,其他曲霉菌、真菌及細菌、人類基因均未見擴增曲線，引物探針特異性好，與其他真菌、細菌、人類基因無交叉反應(yīng)。,.,結(jié)果與討論：4.重復(fù)性實驗,四種曲霉菌批內(nèi)重復(fù)性試驗,A.fumigatus,A.flavus,A.terreus,A.niger,.,結(jié)果與討論：4.重復(fù)性實驗,批內(nèi)重復(fù)性試驗Ct均值與標準差,.,結(jié)果與討論：4.重復(fù)性實

15、驗,批間重復(fù)性試驗Ct均值與標準差,批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗CV最大值均5%，反應(yīng)體系重復(fù)性好,.,結(jié)果與討論：5.靈敏度檢測,四種曲霉菌FQ-PCR靈敏度檢測曲線,A.fumigatus,A.flavus,A.terreus,A.niger,不同真菌、每一濃度均可見擴增曲線，且每一種稀釋濃度的重復(fù)樣本擴增比例均大于95%，結(jié)果顯示靈敏度均為35個孢子/ml,.,全文結(jié)論,.,全文結(jié)論,1. 對于曲霉菌屬固體組織標本，液氮研磨法提取DNA濃度、純度高，對于曲霉菌屬標準株培養(yǎng)的孢子沖洗標本，一步結(jié)合加熱法提取曲霉菌DNA操作簡單、能有效的運用于實時熒光定量PCR檢測。,.,全文結(jié)論,2. 成功篩選出煙曲霉菌、黃曲霉菌、土曲霉菌、黑曲霉菌引物探針，并建立了曲霉菌實時熒光定量