1、第二章 基因工程制藥,主講人：吳曉敏,第三講 基因工程制藥,第一節(jié) 概述 第二節(jié) 基因藥物生產(chǎn)的基本過程 第三節(jié) 目的基因的獲得 第四節(jié) 基因表達(dá) 第五節(jié) 基因工程菌的穩(wěn)定性 第六節(jié) 基因工程菌生長代謝的特點(diǎn) 第七節(jié) 基因工程菌發(fā)酵 第八節(jié) 基因工程藥物的分離純化 第九節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制 第十節(jié) 基因工程藥物制造實(shí)例,第一節(jié) 概述,基因工程即重組DNA技術(shù)，是指對不同生物的遺傳基因，根據(jù)人們的意愿，進(jìn)行基因的切割、拼接和重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物，或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型。世界上第一批重組DNA分子誕生于1972年，次年幾種不同來源的DNA分子裝入載體后

2、被轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中表達(dá)，標(biāo)志著基因工程正式登上歷史舞臺(tái)?；蚬こ虖氐赘淖兞藗鹘y(tǒng)生物科技的被動(dòng)狀態(tài)，使得人們可以克服物種間的遺傳障礙，定向培養(yǎng)或創(chuàng)造出自然界所沒有的新的生命形態(tài)，以滿足人類社會(huì)的需要。,傳統(tǒng)生物藥物由于來源及制備上的困難、價(jià)格等因素的影響，此外在制備過程可能受到的感染等問題，促使人們尋求安全、實(shí)用、療效可靠的新方法來制備生物藥物?；蚬こ陶谥饾u顯示其在生物技術(shù)藥物制備上的優(yōu)勢。 應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決上述提到的問題，從量、質(zhì)上都可以得到改進(jìn)，且可以創(chuàng)造全新物質(zhì)。,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)：,（1）可以大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽（如胰島素、干擾

3、素、細(xì)胞因子等），為臨床使用提供有效的保障； （2）可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍； （3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；,利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)：,（4）內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除。 （5）利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。 基因工程技術(shù)可將不同種類和用途的基因，在原核細(xì)胞中表達(dá)的特性使其不僅在醫(yī)藥，而且在很多行業(yè)中都會(huì)有重要的應(yīng)用。,第二節(jié) 基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程,基因工程技術(shù)就是將重組對象的目的基因插入載

4、體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。 基因工程藥物制造的主要程序是：目的基因的克隆，構(gòu)建DNA重組體，將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌，工程菌的發(fā)酵，外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，產(chǎn)品的檢驗(yàn)等。以上程序中的每個(gè)階段都包含若干細(xì)致的步驟，這些程序和步驟將會(huì)隨研究和生產(chǎn)條件的不同而改變。,獲得目的基因,組建重組質(zhì)粒,培養(yǎng)工程菌,構(gòu)建基因工程 菌或細(xì)胞,產(chǎn)物分離純化,除菌過濾,半成品檢定,包裝,成品檢定,基因工程藥物制備的一般過程,基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游,上游：主要指的是目的基因分離、工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建。上游階

5、段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成； 下游：主要指的是從工程菌（或細(xì)胞）的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化、質(zhì)量控制等。,工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建中重要的工具,該過程中重要的工具便是酶：限制性內(nèi)切酶和連接酶。 目的基因進(jìn)行限制性內(nèi)切酶和核苷酸序列分析。 基因表達(dá)系統(tǒng) 有原核生物和真核生物兩類表達(dá)系統(tǒng)；選擇基因表達(dá)的系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)蛋白質(zhì)的功能，其次要考慮的是表達(dá)量的多少和分離純化的難易。,下游階段在產(chǎn)業(yè)化中是極其重要,下游階段主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)

6、算機(jī)的優(yōu)化控制等。 工程菌的發(fā)酵工藝需要對影響目的基因表達(dá)的因素進(jìn)行分析，對各種影響因素進(jìn)行優(yōu)化，建立適于目的基因高效表達(dá)的發(fā)酵工藝，同時(shí)建立一系列相應(yīng)的分離純化、質(zhì)量控制、產(chǎn)品保存等技術(shù)。,第三節(jié) 目的基因的獲得,目的基因：所謂目的基因就是我們想要的基因片段，它在生物體內(nèi)能表達(dá)產(chǎn)生所要蛋白產(chǎn)物。 生物界的基因有上億個(gè)，多數(shù)存在于染色體上，少數(shù)存在于細(xì)胞質(zhì)中。取得目的基因的辦法是用“分子剪刀”剪切供體DNA分子，把它切成一些比基因略長的片段，然后再從中找出包含所需目的基因的DNA片段。到目前為止，人們用這種方法已分離出40種大腸桿菌蛋白質(zhì)基因、雞的組蛋白基因等。另一種獲得目的基因的方法是人工合

7、成，即基因模版合成。 基因模板合成法：就是先以信使RNA為模板，反向轉(zhuǎn)錄出一條DNA單鏈，再以互補(bǔ)的方式加倍成DNA雙鏈。用這種方法人們已先后合成了家兔、鴨和人的珠蛋白基因、羽毛角蛋白基因等。,目前克隆真核基因常用的方法有 逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法 一、逆轉(zhuǎn)錄法 逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行cDNA的克隆表達(dá)。為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽的DNA序列，可從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成該蛋白質(zhì)mRNA的互補(bǔ)DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶I作用下，最終合成編碼該

8、多肽的雙鏈DNA序列。 cDNA與模板mRNA序列嚴(yán)格互補(bǔ)，而不含內(nèi)含子。,一、逆轉(zhuǎn)錄法 1、mRNA的純化 2、cDNA第一鏈的合成 3、cDNA第二鏈的合成 4、cDNA克隆 5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 6、cDNA文庫的鑒定 7、目的cDNA克隆的分離和鑒定,cDNA克隆示意圖,ds-cDNA,逆轉(zhuǎn)錄酶,1、mRNA的純化,在真核細(xì)胞中mRNA的3末端常常含有一多聚腺苷酸polyA組成的末端，長達(dá)20250個(gè)腺苷酸，可采用寡聚脫氧胸苷Oligo dT-纖維素，以親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA中分離出來。洗脫方法是高濃度鹽溶液使mRNA特異結(jié)合于寡聚dT，再以低鹽溶液和蒸餾水將其洗脫，經(jīng)

9、過兩次寡聚dT，可得到較純的mRNA。,2、cDNA第一鏈的合成,一般mRNA都帶有3-polyA，所以可用寡聚dT作為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。在合成反應(yīng)體系中加入一種放射性標(biāo)記的dNTP；在凝膠電泳后，進(jìn)行放射自顯影分析產(chǎn)物的分子大小，探索最佳反應(yīng)條件。,3、cDNA第二鏈的合成,先用堿解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。由于第一鏈cDNA鏈3末端往往形成一個(gè)發(fā)夾形結(jié)構(gòu)，所以，可以從這一點(diǎn)開始合成cDNA第二鏈。此反應(yīng)是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1專一性切除單鏈DNA，因此用它可以切除

10、發(fā)夾結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)切除后，雙鏈cDNA分子的大小常用變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測定。,4、cDNA克隆,用于cDNA克隆的載體有兩類：質(zhì)粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌體DNA（如gt10、 gt11等）。根據(jù)重組后插入的cDNA是否能夠表達(dá)、能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又將載體分為表達(dá)型和非表達(dá)型載體。 pUC及gt11為表達(dá)型載體，在cDNA插入位置的上游具有啟動(dòng)基因順序；而pBR322及gt10為非表達(dá)型載體。在cDNA克隆操作中應(yīng)該根據(jù)不同的需要選擇適當(dāng)?shù)妮d體。,cDNA插入片段小于10kb，可選質(zhì)粒載體，如大于10kb則應(yīng)選用噬菌體DNA為載體。 選用表達(dá)型載體可以增加目的

11、基因的篩選方法，有利于目的基因的篩選。,cDNA文庫,R. Young和R. Davis設(shè)計(jì)的gt10和gt11是噬菌體克隆載體，可用于構(gòu)建cDNA文庫。一方面它們具有較高的克隆效率，1ng cDNA可產(chǎn)生5000個(gè)克隆，另一方面又可容納較大分子量的外源DNA片段。 因?yàn)楹Y選噬菌斑在技術(shù)操作上較篩選細(xì)菌菌落更方便，因此gt10和gt11類載體在構(gòu)建文庫時(shí)優(yōu)于質(zhì)粒載體pBR322。,cDNA片段與載體的連接,方法一：加同聚尾連接，用3末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化，使載體與cDNA的3末端帶上互補(bǔ)的同型多聚體序列，如載體加上polyC（或A）的尾巴，則cDNA加上polyG（或T）的尾巴，這兩種粘性末

12、端只能使載體與cDNA連接而不能自我環(huán)化，借助同型多聚體的退火作用形成重組分子，最后用T4DNA連接酶封口。,方法二：加人工接頭連接，用T4DNA連接酶在平末端接上人工接頭可以使DNA發(fā)生連接。所謂人工接頭是指人工合成的、連接在目的基因兩端的含有某些限制酶切位點(diǎn)的寡核苷酸片段。cDNA連上人工接頭后，用該種限制酶酶切就可得到粘性末端，從而能夠與載體連接；cDNA中也可能也帶有同樣的限制酶切點(diǎn)，為了保護(hù)cDNA不受限制酶破壞，可在加接頭前用甲基化酶修飾這些限制酶切位點(diǎn)。,5、將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞,體外包裝的噬菌體，感染感受態(tài)大腸桿菌形成噬菌斑；或轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌使質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。,6、cDNA

13、文庫的鑒定,根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑顏色改變法。然后采用凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析測定等方法進(jìn)行進(jìn)一步篩選和鑒定。,7、目的cDNA克隆的分離和鑒定,從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆，主要采用： 核酸探針雜交法。根據(jù)目的蛋白質(zhì)純品的氨基酸序列分析結(jié)果，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆。 免疫反應(yīng)鑒定法。用表達(dá)型載體構(gòu)建的cDNA文庫，可用免疫學(xué)方法分組逐一鑒定各cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆。,分離得到含有目的基因的陽性克隆后，必須對其作進(jìn)一步的驗(yàn)證和鑒定，主要是進(jìn)行限

14、制酶圖譜的繪制、雜交分析、基因定位、基因測序以及確定基因的轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)等。 1985，PCR發(fā)明以后，RT-PCR得到了廣泛的應(yīng)用。,二、化學(xué)合成法,人工化學(xué)合成的限制： 不能合成太長的基因，5060bp； 人工合成時(shí)，遺傳密碼的簡并性可導(dǎo)致中性突變； 費(fèi)用較高。,第四節(jié) 基因表達(dá),基因表達(dá)：是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以 及所有加工過程；外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)。 我們主要關(guān)心的問題主要有以下三點(diǎn)： 目的基因的表達(dá)產(chǎn)量； 表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性； 產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化； 因此在進(jìn)行基因表達(dá)設(shè)計(jì)時(shí)，需綜合考慮各種影響因素以建立最佳基因表達(dá)體系。,一、宿主細(xì)胞的選擇

15、,對于宿主細(xì)胞其應(yīng)該： 容易獲得較高濃度的細(xì)胞； 能利用易得廉價(jià)原料； 不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)； 容易進(jìn)行代謝調(diào)控； 容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作； 產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，產(chǎn)物容易提取純化。 基因表達(dá)有兩類宿主細(xì)胞： 原核細(xì)胞，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等； 真核細(xì)胞，常用的有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。,1、原核細(xì)胞-1,（1）大腸桿菌 大腸桿菌表達(dá)基因工程產(chǎn)物的形式：細(xì)胞不溶性表達(dá)（包含體）、細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)等，極少數(shù)情況下還可分泌到細(xì)胞外表達(dá)。不同的表達(dá)形式具有不同的表達(dá)水平，且雜質(zhì)的含量和種類也會(huì)變化。 大腸桿菌中的表達(dá)的

16、特點(diǎn)：不存在信號(hào)肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物；分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，產(chǎn)物須在下游處理過程中經(jīng)過變性和復(fù)性處理才能恢復(fù)其生物活性； 不存在翻譯后修飾作用；翻譯通常從甲硫氨酸的AUG密碼子開始，故目的蛋白質(zhì)的N端常多余一個(gè)甲硫氨酸殘基，容易引起免疫反應(yīng)；產(chǎn)生的內(nèi)毒素難以除去； 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)酶會(huì)破壞蛋白質(zhì)。,1、原核細(xì)胞-2,（2）枯草芽孢桿菌 它分泌能力強(qiáng)，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成包含體。該菌也不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化，另外由于它有很強(qiáng)的胞外蛋白酶，會(huì)對產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的降解，因此在外源基因克隆表達(dá)的應(yīng)用中受到影響。,1、原核細(xì)胞-3,（3）鏈霉菌 它是重要的工業(yè)微

17、生物，近年來作為外源基因表達(dá)體系正日益受到人們的重視。其主要特點(diǎn)是：不致病、使用安全，分泌能力強(qiáng)，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有糖基化能力，變鉛青鏈霉菌限制修飾能力弱，可以作為理想的受體菌。現(xiàn)已構(gòu)建了一系列有效的載體，下游培養(yǎng)工藝也已經(jīng)成熟。,2、真核細(xì)胞-1,（1）酵母 特點(diǎn)：真核生物細(xì)胞，故有后翻譯過程；基因組小，僅為大腸桿菌的4倍； 世代時(shí)間短，有單倍體和雙倍體兩種形式；基因操作與原核生物相似；可以建立有分泌功能的表達(dá)系統(tǒng)，將產(chǎn)物分泌出胞外，分離純化工藝相對簡單。 在各種酵母中以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的應(yīng)用歷史最為悠久，研究資料也最豐富。,2、

18、真核細(xì)胞-2,（2）絲狀真菌 近年來，已在約30種以上絲狀真菌中建立了DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其特點(diǎn)是：有很強(qiáng)的蛋白分泌能力；能正確進(jìn)行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化等，而且其糖基化方式與高等真核生物相似；絲狀真菌（如曲霉等）等又確認(rèn)是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。,2、真核細(xì)胞-3,（3）哺乳動(dòng)物細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞由于外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)成分完全由人控制，從而使產(chǎn)物純化變得容易。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的基因產(chǎn)物是糖基化的，接近或類似于天然產(chǎn)物。但動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)慢，產(chǎn)率低，且培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高，培養(yǎng)液濃度較稀。,二、大腸桿菌中的基因表達(dá),1、表達(dá)載體所必須具備

19、的條件 載體能獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制：分嚴(yán)緊型和松弛型，前者在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)僅13個(gè)，后者在宿主細(xì)胞中拷貝數(shù)可高達(dá)3000個(gè)。 應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆、鑒定和篩選，且克隆位點(diǎn)位于啟動(dòng)子序列后，以便外源基因表達(dá)。 應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA酶所識(shí)別。,表達(dá)載體必須具備的條件,應(yīng)具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 阻遏子的阻遏作用可以由物理（如溫度）、化學(xué)（如IPTG、IAA等）因素進(jìn)行調(diào)節(jié)，因而可人為地選擇啟動(dòng)子啟始轉(zhuǎn)錄mRNA的時(shí)機(jī)，以獲得外源蛋白質(zhì)表達(dá)合成的最佳時(shí)機(jī)。 外源基因的高效表達(dá)往往會(huì)抑制宿主細(xì)胞的生長、增殖，而阻遏子可

20、使宿主細(xì)胞免除此不良影響。,表達(dá)載體必須具備的條件,應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄其他無關(guān)的基因，同時(shí)，很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，由于強(qiáng)啟動(dòng)子所致的高水平轉(zhuǎn)錄反過來還會(huì)影響質(zhì)粒DNA本身的復(fù)制，從而引起質(zhì)粒的不穩(wěn)定或脫質(zhì)?，F(xiàn)象，因此表達(dá)載體需在外源基因的下游安置一個(gè)強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止子，以克服由質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄引進(jìn)的質(zhì)粒不穩(wěn)定。 所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列（Shine-Dalgarno sequence），以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。,2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素,1、外源基因的拷貝數(shù) 2、外源基

21、因的表達(dá)效率：啟動(dòng)子的強(qiáng)度、核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性、SD序列和起始密碼ATG的間距、密碼子的組成等都會(huì)不同程度地影響外源基因的表達(dá)效率。 3、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：組建融合蛋白；利用大腸桿菌的信號(hào)肽或真核多肽中自身的信號(hào)肽； 采用位點(diǎn)突變的方法；選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞，可能會(huì)減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解。如黃嘌呤核苷（Ion）是大腸桿菌合成蛋白酶的主要底物，Ion-營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌不能合成黃嘌呤核苷，從而不能合成蛋白酶，減少了表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞體內(nèi)的降解。,2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素,4、細(xì)胞的代謝負(fù)荷 外源基因的表達(dá)產(chǎn)物屬于異己物質(zhì)，并可能對宿主細(xì)胞有毒性。 調(diào)節(jié)表達(dá)物質(zhì)的積累與細(xì)胞

22、的生長和代謝之間的平衡有利于外源基因的高效表達(dá)。 另外通過將細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，或?qū)⑺拗骷?xì)胞的生長與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開兩種手段也可以減輕細(xì)胞代謝的負(fù)荷。 形成不溶性的包含體可以降低表達(dá)產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的毒害作用,2、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素,5、工程菌的培養(yǎng)條件 除宿主、載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達(dá)外，培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素。,3、真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式,（1）融合蛋白的形式,3、真核基因早大腸桿菌中的表達(dá)形式,（2）非融合蛋白的形式：指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含任何細(xì)菌多肽序列

23、。為此，表達(dá)非融合蛋白的操縱子必須改建成：細(xì)菌或噬菌體的啟動(dòng)子細(xì)菌的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）真核基因的起始密碼子結(jié)構(gòu)基因終止密碼。要表達(dá)非融合蛋白，要求SD序列與翻譯起始密碼ATG之間的距離要適合，SD序列與翻譯起始密碼ATG之間即使只改變23個(gè)堿基，表達(dá)效率也會(huì)受到很大的影響。非融合蛋白易被蛋白酶破壞，其N端常帶有甲硫氨酸，可引起人免疫反應(yīng)。 （3）分泌型表達(dá)蛋白藥物基因：外源蛋白的表達(dá)是通過將外源基因融合到編碼原核蛋白信號(hào)肽序列的下游來實(shí)現(xiàn)的。利用大腸桿菌的信號(hào)肽，構(gòu)建分泌型表達(dá)質(zhì)粒，常用的信號(hào)肽有堿性磷酸酶信號(hào)肽（phoA）、膜外周質(zhì)蛋白信號(hào)肽（OmpA）、霍亂弧菌毒素B亞單位（CTX

24、B）等。,特點(diǎn)：一些可被胞內(nèi)蛋白酶所降解的蛋白質(zhì)在周質(zhì)中是穩(wěn)定的；由于有些蛋白質(zhì)能按一定的方式折疊，所以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)無活性的蛋白質(zhì)分泌表達(dá)時(shí)卻具有活性；蛋白信號(hào)肽和編碼序列之間能被切割，因而分泌蛋白質(zhì)不含起始密碼ATG所編碼的甲硫氨酸等。但是，產(chǎn)量不高、信號(hào)肽不被切割或不在特定位置上切割等。,3、真核基因早大腸桿菌中的表達(dá)形式,三、酵母中的基因表達(dá),酵母表達(dá)系統(tǒng)是隨著酵母質(zhì)粒和酵母轉(zhuǎn)化技術(shù)的建立而逐步發(fā)展起來的，其與其它表達(dá)系統(tǒng)一樣，包括載體、啟動(dòng)子等控制序列和宿主細(xì)胞3個(gè)部分。,2、影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素,（1）外源基因的拷貝數(shù) 外源基因通常是由多拷貝的質(zhì)粒載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的，質(zhì)

25、粒的拷貝數(shù)及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性對外源基因的表達(dá)起決定作用。有些質(zhì)粒在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，在傳代培養(yǎng)中很快丟失，不能用于工業(yè)生產(chǎn)。通過整合質(zhì)粒，將外源基因整合到宿主染色體上，雖然很穩(wěn)定，但通常只有一個(gè)拷貝，不能高效表達(dá)。高穩(wěn)定的高拷貝數(shù)的質(zhì)?？墒雇庠椿蚋咝П磉_(dá)，但高拷貝數(shù)通常會(huì)引起細(xì)胞生長量的降低；而單拷貝數(shù)的質(zhì)粒對細(xì)胞的最大生長沒有影響，因而也能達(dá)到高效表達(dá)。,（2）外源基因的表達(dá)效率啟動(dòng)子,外源基因在酵母中表達(dá)的效率主要與啟動(dòng)子、分泌信號(hào)和終止序列有關(guān)。 啟動(dòng)子 “表達(dá)框架”。啟動(dòng)子是由上游激活序列和保留的近端啟動(dòng)子組成。近端啟動(dòng)子含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄所必需的TATA序列和mRNA起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)起始

26、密碼子。終止區(qū)含有終止mRNA轉(zhuǎn)錄所需的信號(hào)。在酵母菌中經(jīng)常利用的啟動(dòng)子有組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，不同啟動(dòng)子對不同外源基因的表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用明顯不同。,分泌信號(hào)的效率。分泌信號(hào)包括信號(hào)肽部分以及前導(dǎo)肽部分的編碼序列，它幫助后面的表達(dá)產(chǎn)物分泌出酵母細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)牟课挥砂麅?nèi)蛋白酶加工切斷表達(dá)產(chǎn)物和前導(dǎo)肽之間的肽鍵，產(chǎn)生正確的表達(dá)產(chǎn)物。分泌信號(hào)是酵母菌表達(dá)蛋白的起始分泌、糖基化和蛋白折疊加工等不可缺少的因素。 終止序列的影響：終止序列保證產(chǎn)物（mRNA）在適當(dāng)部位終止和加上polyA尾部，這樣形成的mRNA可能比較穩(wěn)定并被有效地翻譯。在酵母中表達(dá)的人工合成基因一般不含終止序列，必須借用外加的終止序

27、列或載體上現(xiàn)有的終止序列。常用的外加終止序列有ADH1、CYC1、MF1和PGK。,（2）外源基因的表達(dá)效率啟動(dòng)子,（3）外源蛋白的糖基化,外源蛋白在酵母細(xì)胞中可發(fā)生N-糖苷鍵（天冬酰胺連接）和O-糖苷鍵（絲氨酸或蘇氨酸連接）的兩種不同的糖基化，與哺乳動(dòng)物中發(fā)生的糖基化相同。外源蛋白經(jīng)釀酒酵母合成、氨基末端修飾、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)折疊和糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培養(yǎng)基中，而且某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定，便于分離精制。,（4）宿主菌株的影響,不同的酵母菌株及其生理狀況對外源基因的表達(dá)有明顯的影響。表達(dá)用的酵母宿主菌株應(yīng)具備下列要求：菌體生長力強(qiáng)； 菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱； 菌株性能穩(wěn)定，常

28、用的幾乎是突變株，避免使用回復(fù)突變率高的不穩(wěn)定體系；最好使用二倍體或多倍體菌株； 分泌能力強(qiáng)。,四、動(dòng)物中的基因表達(dá),優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物，容易分離純化 缺點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞生長慢，培養(yǎng)條件苛刻，費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小。 書中第82頁表3-2對大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞3類主要基因工程表達(dá)體系簡要進(jìn)行了比較。,課堂作業(yè),1.影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素有哪些？ 2.質(zhì)粒不穩(wěn)定分為哪兩類，如何解決質(zhì)粒不穩(wěn)定？,第五節(jié) 基因工程菌生長代謝的特點(diǎn),菌體生長是菌體各成分尤其是生物大分子核酸和蛋白質(zhì)合成的綜合表現(xiàn)，通常用比生長速率表示。 碳源、補(bǔ)料或稀釋速率可調(diào)控菌體生長。控制菌體生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)

29、定性、減少代謝副產(chǎn)物的積累、提高外源蛋白產(chǎn)率方面都具有一定的意義。,對菌體生長地調(diào)控主要有兩種觀點(diǎn)：1.認(rèn)為能量地供應(yīng)決定了菌體的最大比生長率；2.認(rèn)為是小分子前體和催化組分的限制決定了菌體地最大生長速率。 一、菌體的生長和能量的關(guān)系 各種碳源通過有限地呼吸能力所能提供地最大能量決定了菌 體在這種培養(yǎng)基中的最大比生長速率。 當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝所能提供地能量 時(shí)，由于呼吸鏈或三羧酸循環(huán)地供應(yīng)不足，使部分乙酰輔酶A 通過轉(zhuǎn)化為乙酸來功能功能，菌體往往會(huì)產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙 酸。高濃度地乙酸能明顯地抑制菌體的生長。 分批培養(yǎng)中選用不同的碳源，補(bǔ)料培養(yǎng)中通過控制補(bǔ)料速 度，連續(xù)培養(yǎng)中通過控

30、制稀釋速率等培養(yǎng)方法，提高菌體攝氧 能力，改變TCA中的關(guān)鍵酶活性，關(guān)閉乙酸合成途徑等，從而 控制乙酸的產(chǎn)生，在一定范圍內(nèi)控制菌體生長，減少它的抑制 作用，以實(shí)現(xiàn)工程菌的高密度培養(yǎng)和提高重組產(chǎn)物的表達(dá)平。,二、菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系 基因表達(dá)在各個(gè)水平的競爭是各個(gè)基因互相競 爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu)的結(jié)果。 對于基因工程菌來說，外源基因與宿主菌自身 基因的競爭表達(dá)。 質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響：中拷貝質(zhì)粒，三 羧酸的關(guān)鍵酶相對增加。原因：終產(chǎn)物反饋調(diào)節(jié)。 前體濃度的降低，導(dǎo)致這些酶濃度增加。 高拷貝質(zhì)粒：前體、關(guān)鍵酶、延伸因子濃度下 降，菌體比生長速率，總蛋白合成均減少，這與 大量前體被利用，前

31、體不足，“嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)”。,第六節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性,分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 一、質(zhì)粒不穩(wěn)定產(chǎn)生的原因 分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。 與兩個(gè)因素有關(guān)：一是含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒菌的頻率，質(zhì)粒丟失率與宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件有關(guān)；二是兩種菌比生長速率差異的大小。,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定是DNA從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。同源重組、串聯(lián)啟動(dòng)子、培養(yǎng)條件等。 質(zhì)粒穩(wěn)定性分析方法：先在不含抗性標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再于含抗性標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)比值計(jì)算質(zhì)粒的穩(wěn)定性。,二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法,1.選擇合適的菌株 2.選擇合適的載體 低拷貝質(zhì)粒載體，要增加拷貝數(shù)

32、。 高拷貝質(zhì)粒載體，適當(dāng)提高比生長速率，使拷貝數(shù)降低，增加穩(wěn)定性。 3.在培養(yǎng)基中加入選擇性壓力如抗生素等，以抑制質(zhì)粒丟失菌的生長，也是提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法。,4.分階段控制培養(yǎng) 為提高培養(yǎng)過程中質(zhì)粒的穩(wěn)定性，一般采用兩階段法，第一階段先使菌體生長至一定密度，第二階段誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。 5.采用適當(dāng)?shù)牟僮鞣绞娇墒构こ叹L速率具有優(yōu)勢，并使工程菌和質(zhì)粒丟失菌生長競爭趨于極端化?？烧{(diào)控的環(huán)境參數(shù)為溫度、pH、培養(yǎng)基組分和溶解氧濃度。通過間隙供氧和改變稀釋速率都可以提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性。,二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法,6.固定化 可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性。固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的基因產(chǎn)物的產(chǎn)

33、率都有了很大提高。,二、提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法,第八節(jié) 重組基因工程菌培養(yǎng),基因工程菌的培養(yǎng)過程主要包括：通過搖瓶操作了解工程菌生長的基礎(chǔ)條件，如溫度、pH、培養(yǎng)基各種組分以及碳氮比，分析表達(dá)產(chǎn)物的合成、積累對受體細(xì)胞的影響；通過培養(yǎng)罐操作確定培養(yǎng)參數(shù)和控制的方案和順序。,一、基因工程菌的培養(yǎng)方式,1、分批培養(yǎng) 2、補(bǔ)料分批培養(yǎng) 3、連續(xù)培養(yǎng) 4、透析培養(yǎng) 5、固定化培養(yǎng),二、基因工程菌的發(fā)酵工藝,探索基因工程菌的培養(yǎng)影響因素，并進(jìn)行優(yōu)化或改進(jìn)： 1、培養(yǎng)基：選擇好 2、接種量的影響：確定接種量是否優(yōu)化； 3、溫度：選擇適當(dāng)?shù)臏囟?4、溶解氧的影響 5、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇 6、pH的影響,三、基因工

34、程菌的培養(yǎng)設(shè)備,發(fā)酵罐組成：發(fā)酵罐體、保證高傳質(zhì)作用 的攪拌器、溫度控制和滅菌系統(tǒng)、空氣無 菌過濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數(shù)測 量與控制系統(tǒng)以及培養(yǎng)液配置和連續(xù)操作 裝置等。,第十節(jié) 基因工程藥物的分離純化,生物技術(shù)產(chǎn)品一般是活性肽或蛋白質(zhì)，它們具有如下特點(diǎn)：初始物料中含量低；基體組成復(fù)雜；穩(wěn)定性差；種類多，包括大、中、小分子、結(jié)構(gòu)簡單或復(fù)雜的有機(jī)化合物，以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜而又性質(zhì)各異的生物活性物質(zhì)；應(yīng)用面廣，要求質(zhì)量、純度高，無菌無熱源等。,一、建立分離純化工藝需了解的各種因素,蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)是增加制品純度或比活性，即增加單位蛋白質(zhì)重量中所要蛋白質(zhì)的含量或生物活性（活性單位/毫克蛋白）；并設(shè)

35、法除去變性的或不要的蛋白質(zhì)，并且希望所得蛋白質(zhì)的產(chǎn)量達(dá)到最高值。 1、含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn)： 上游過程中的各種因素均對分離純化使用的技術(shù)和工藝有直接影響。a.菌種類型、形式、性質(zhì)等；b.原材料和培養(yǎng)基的來源及質(zhì)量是否穩(wěn)定；c.生產(chǎn)工藝和條件；d.初始物料的特性。,2、物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì) 性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、分子量、電荷、穩(wěn)定性、溶解 度等 3、目的產(chǎn)物特性 4、產(chǎn)品質(zhì)量要求 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)、產(chǎn)品用途、對純度、生物活性、比活的要求等。,一、建立分離純化工藝需了解的各種因素,二、分離純化的基本過程,一般包括如下幾個(gè)方面的過程：細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工。,

36、三、細(xì)胞的破碎方法,分離需經(jīng)細(xì)胞收集、細(xì)胞破碎、細(xì)胞碎片分離等步驟。 細(xì)胞收集一般采用離心分離的方法： 沉降作用懸浮液靜置時(shí)，在重力作用下，密度大于周圍溶液的 固體顆粒逐漸下沉，成為沉降作用。 離心技術(shù)在離心力場作用下，加速懸浮液中固體顆粒沉降速度 的方法稱為離心技術(shù)。,三、細(xì)胞的破碎方法,細(xì)胞破碎分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩類（或分為物理、化學(xué)和生物法） 物理法主要是勻漿法、珠磨法、超聲法和高壓 擠壓法 化學(xué)法主要是滲透沖擊、增溶法和脂溶法 是一類利用化學(xué)試劑改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)或完全破除細(xì)胞壁形成原生質(zhì)體后，在滲透壓作用下使細(xì)胞膜破裂而釋放胞內(nèi)物質(zhì)的方法。 生物法主要是酶溶法,四、固液分離,

37、分離細(xì)胞碎片：a.離心沉淀（高速、超速離心）；b.膜過濾（微濾、超濾、反滲透）c.雙水相萃取（聚乙二醇葡聚糖，聚乙二醇 無機(jī)鹽）,五、重組蛋白質(zhì)的分離純化,分離純化主要依賴色譜分離方法。 色譜技術(shù)分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜及高壓液相色譜等。 蛋白質(zhì)純化方法的設(shè)計(jì)通常根據(jù)產(chǎn)物分子的物理、化學(xué)參數(shù)和生物學(xué)特性來決定。 等電點(diǎn)決定離子交換的種類和條件 相對分子量選擇不同孔徑及分級(jí)分離范圍的介質(zhì) 疏水性與疏水、反相介質(zhì)結(jié)合的程度 生物特異性決定親和配基,溶解性決定分離體系及蛋白濃度 穩(wěn)定性決定工藝采用的溫度及流程時(shí)間等,五、重組蛋白質(zhì)的分離純化,1、離子交換層析（io

38、n-exchange column chromatography) 這是一種用離子交換樹脂作支持劑的層析法。離子交換樹脂是具有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成的聚苯乙烯-苯二乙烯等不溶性的高分子化合物。聚苯乙烯-苯二乙烯是由苯乙烯（單體）和苯二乙烯（交聯(lián)劑）進(jìn)行聚合和交聯(lián)反應(yīng)生成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高聚物。它是離子交換樹脂的基質(zhì)，帶電基團(tuán)是通過后來的反應(yīng)引入基質(zhì)的，樹脂一般都制成球形顆粒。,CH2CH2CHCH2CH2CH,SO3,CH CH2CH2CH,苯環(huán)SO3,有氫型和鈉型,H+或Na+,H+或Na+,帶電粒子與離子交換劑間的作用力是靜電力。它們結(jié)合是可逆的，在一定條件下能夠結(jié)合，條件改變后也能被釋

39、放出來。離子交換劑由惰性的不溶性載體，功能基團(tuán)和平衡離子組成。 樹脂分陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂含有的酸性基團(tuán)如SO3H（強(qiáng)酸型）或COOH（弱酸型）可解離出H+離子，當(dāng)溶液中含有其它陽離子時(shí)，例如酸性環(huán)境中的氨基酸陽離子，它們可以和H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。同樣地陰離子交換樹脂含有的堿性基團(tuán)如N（CH3）3OH（強(qiáng)堿型）或NH3OH（弱堿型）可解離出OH-，它能和溶液中的陰離子如堿型環(huán)境中的氨基酸陰離子發(fā)生交換而結(jié)合在樹脂上。,五、重組蛋白質(zhì)的分離純化,X,Z,Z,X,X,X,Y,Z,Y,Z,XOH,nX,平衡上樣,吸附,洗雜,洗脫,離子交換層析洗脫方式：一般采用改變洗

40、脫劑的鹽濃度或PH的方式洗脫，分為分段洗脫和梯度洗脫兩種情況。 改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫通常是逐步加大離子強(qiáng)度，使與離子交換劑結(jié)合的各組分洗脫下來；而pH梯度洗脫，對陽離子交換劑一般是pH從低到高，陰離子交換劑pH從高到底洗脫。 分段洗脫是用具有不同洗脫能力的緩沖液相繼進(jìn)行洗脫。,2、 吸附法 吸附是物質(zhì)分子在兩相界面上濃度的增加。 由于界面上的分子同時(shí)受到不相等的兩相分子的作用力，因此界面分子的力場是不飽和的，即存在一種固體的表面力，它能從外界吸附分子、原子或離子，并在吸附劑表面附近形成多分子層或單分子層。我們稱物質(zhì)從流動(dòng)性（氣或液相）濃縮到固體表面從而達(dá)到分離的過程稱為吸附作用。把在表面上能

41、發(fā)生吸附作用的固體稱為吸附劑；將被吸附的物質(zhì)稱為吸附物。,常用吸附劑： 1)活性炭是一種吸附能力很強(qiáng)的非極性吸附劑，其吸附作用在水溶液中最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中較弱，吸附能力的順序：水乙醇甲醇乙酸乙酯丙酮氯仿。 2)人造沸石 人造沸石是一種人工合成的無機(jī)陽離子交換劑。用于細(xì)胞色素C的分離。 3)磷酸鈣凝膠 在蛋白質(zhì)的分離、精制中，較為常用的吸附劑為磷酸鈣凝膠。（羥基磷灰石）活性部位為鈣離子。 4)白陶土 5)氫氧化鋁凝膠 用于蛋白質(zhì)及酶的分離。,6)氧化鋁 活性氧化鋁是最常用的一種吸附劑，特別適于親脂性成分的分離，廣泛地用于在醇，酚，生物堿，染料，甾體化合物，苷類，氨基酸，蛋白質(zhì)以及維生素等物質(zhì)的分

42、離。 7)硅膠 最常用 8)滑石粉 惰性 助濾劑 9)硅藻土 惰性 助濾劑 10)皂土 11)聚酰胺粉 12)大孔網(wǎng)格聚合物吸附樹脂 極性，弱極性，非極性大孔吸附樹脂 強(qiáng)酸性，弱酸性，強(qiáng)堿性，弱堿性等,蛋白質(zhì)的選擇吸附分離：蛋白質(zhì)可和具有吸附能力的物質(zhì)結(jié)合而達(dá)到分離的目的 。一般認(rèn)為與非極性吸附劑的結(jié)合可能主要是范德華力和疏水作用；而與極性吸附劑的作用的主要力可能是離子吸引或氫鍵鍵和。 現(xiàn)在蛋白質(zhì)提純中使用最廣泛和最有效的吸附劑是結(jié)晶磷酸鈣，即羥磷灰石。此外，活性炭、硅膠、氧化鋁和磷酸鈣凝膠也常用于吸附層析。,3、 凝膠層析 它是將樣品化合物通過一定孔徑的凝膠固定相，用于流經(jīng)體積的差異，使不同

43、分子量的組成得以分離的層析。 其介質(zhì)是凝膠珠，內(nèi)部是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的交聯(lián)度（網(wǎng)孔大小）決定了凝膠的分離范圍；有時(shí)也用排阻極限來表示分級(jí)范圍的上限。例如SephadexG-50的分級(jí)范圍是1500-30000。凝膠的粒度和洗脫速度及分辨率有關(guān)。 目前經(jīng)常使用的凝膠有：交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖等。交聯(lián)葡聚糖是由線性-1，6-葡聚糖與1-氯-2，3-環(huán)氧丙烷反應(yīng)交聯(lián)而成的化合物，它的商品名為Sephadex。聚丙烯酰胺凝膠（商品名是Bio-gel P）是一種人工合成的凝膠。瓊脂糖是一種天然凝膠，它是從一種海藻多糖瓊脂或種洋菜中分離得到的。,凝膠過濾原理 當(dāng)不同大小的蛋白質(zhì)顆粒流經(jīng)凝膠

44、柱時(shí)，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入凝膠珠內(nèi)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下移動(dòng)并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度地自由出入凝膠珠的內(nèi)外。這樣由于不同大小的分子所經(jīng)的路徑不同而得到分離，大分子物質(zhì)先被洗脫出來，小分子物質(zhì)后被洗脫出來 ，如下圖。,大分子,小分子,凝膠顆粒,凝膠排阻示意圖解,V,C,大分子,小分子,4、 親和層析 它是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法。它經(jīng)常只需要經(jīng)過一步的處理即可使某種蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的混合物中分離出來，并且純度很高。 這種方法是基于某種蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特性，即它與另一種稱為配基的分子能特異而非共價(jià)的結(jié)合。所謂配基是指能被生物大分

45、子所識(shí)別并與之結(jié)合的原子、原子團(tuán)和分子，例如酶的作用底物、輔酶、調(diào)節(jié)效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類似物。激素和受體蛋白，抗原與抗體互為配基，原則上任何一種蛋白質(zhì)都能使用親和層析分離。,4、 親和層析 其原理是：先將待提純蛋白質(zhì)的特異配基，通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)地連接到象瓊脂糖凝膠一類的載體的功能基上。一般在配基與多糖基質(zhì)之間插入一段所謂連接臂使配基與凝膠之間保持足夠的距離，不致因載體表面的空間位阻而防礙待分離的大分子與配基的結(jié)合。當(dāng)待提純的蛋白質(zhì)樣品加到這種多糖材料的層析柱上時(shí)，待提純的蛋白質(zhì)就會(huì)有特異的配體結(jié)合，而其他的蛋白質(zhì)，因?qū)@個(gè)配體不具有特異的結(jié)合位點(diǎn)，將通過柱子 而流出。而特異地結(jié)合到柱子上的蛋

46、白質(zhì)可用自由配體分子（含游離配體的溶液）洗脫下來。,4、 親和層析 親和層析的設(shè)計(jì)過程： 1)配基固定化 選擇合適的配基與不溶性的支撐載體偶聯(lián)，或共價(jià)結(jié)合成具有特異性親和性分離介質(zhì)。 2)吸附樣品 親和層析介質(zhì)選擇性吸附酶或其它生物活性物質(zhì)，雜質(zhì)與層析間沒有親和作用，故不能被吸附而被洗滌去除。 3)樣品洗脫 選擇適宜的條件使被吸附的親和介質(zhì)上的酶或其它生物活性物質(zhì)洗脫。,L,S,L,L,S,S,S,雜質(zhì),S,S,L,L,L,L,L,配基,樣品,配基固定化,吸附樣品,樣品洗脫,+,C,C,C,配基,蛋白質(zhì),1.配基固相化,2.親和吸附,固體載體,3.解吸附,第十一章 變性蛋白的復(fù)性,包涵體表達(dá)的

47、有利因素： 1、可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達(dá)可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解。 2、降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達(dá)量的提高。 3、包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于分離純化。 4、對機(jī)械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細(xì)胞膜碎片分離。,一、包含體形成的原因 包涵體的形成： 主要因?yàn)樵谥亟M蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助 因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級(jí)鍵等原因形成的。 1、表達(dá)量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正

48、確的配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。 2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。 3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。 4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。,二、包含體的分離和溶解 1.包含體的分離 破碎細(xì)菌（超聲、勻漿等）、加入變性劑。 2.包含體的溶解 強(qiáng)變性劑（脲、鹽酸胍、SDS等），對于含半 胱氨酸的蛋白質(zhì)，還需加入巰基乙醇、二硫蘇 糖醇等還原劑。,三、包含體蛋白復(fù)性方法 一個(gè)

49、有效的、理想的折疊復(fù)性方法應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：活性蛋白質(zhì)的回收率高；正確復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)分離；折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品；折疊復(fù)性方法易于放大；復(fù)性過程耗時(shí)較少 。 1.稀釋、透析復(fù)性法 稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。 透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，易形成沉淀（聚集時(shí)疏水簇外露，分子間的疏水相互作用引起蛋白聚集），且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。,2.含二硫鍵的蛋白的復(fù)性 常用的氧化方法有： 空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，加入二價(jià)銅離子作為催發(fā)劑，氧化巰基，正

50、確形成二硫鍵。但是復(fù)性率低且難以準(zhǔn)確控制。氧化還原電對（redox）：常采用GSSG/GSH，通過調(diào)整兩者的比例來控制較精確的氧化還原電勢。 3.分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性 分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒有蛋白質(zhì)特異性的促進(jìn)折疊的蛋白因子，研究發(fā)現(xiàn)很多蛋白在缺乏分子伴侶時(shí)無法自己正確的折疊。 4.小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)、降低非正確折疊的穩(wěn)定性、增加折疊中間體的穩(wěn)定性、增加解折疊狀態(tài)的穩(wěn)定性 5.人工伴侶：為模仿分子伴侶而發(fā)展的一種方法：首先，變性蛋白被復(fù)性液中的去污劑捕獲，形成蛋白-去污劑復(fù)合體，

51、復(fù)合體的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入環(huán)糊精從復(fù)合體中去除去污劑，使得蛋白質(zhì)正確折疊。,第十二節(jié) 基因工程藥物的 質(zhì)量控制,醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般性要點(diǎn) 原材料的控制 培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制 純化工藝的質(zhì)量控制 目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制 產(chǎn)品的保存,醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品質(zhì)量保證的一般性要點(diǎn) 產(chǎn)品安全性評價(jià) 產(chǎn)品本身的結(jié)構(gòu) 嚴(yán)格控制條件 生物材料的質(zhì)量控制 目的基因 來源，克隆經(jīng)過，修飾基因或肽段的序列，PCR擴(kuò)增所用的引物、模板、酶反應(yīng)條件等 表達(dá)載體 名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性、各組份的來源與功能，所用的酶切位點(diǎn)、抗生素抗性標(biāo)記物 宿主細(xì)胞 名稱、來源、傳代歷史、生物學(xué)特性等，在宿主中的狀態(tài)、表達(dá)方法與

52、水平等,培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制 在貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。 純化過程的質(zhì)量控制 純化方法的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮到盡量去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白、糖以及純化過程帶入的其它有害物質(zhì)。（如柱層析技術(shù)）,目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制 主要包括：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致 性。 1.生物活性測定 放射性免疫分析或酶聯(lián)免疫吸附法測定其免疫學(xué)活性 細(xì)胞計(jì)數(shù)法等檢測生物學(xué)活性 2.理化性質(zhì)鑒定 免疫印跡、免疫電泳等免疫學(xué)方法確定蛋白質(zhì)的抗原性幻燈片 117 凝膠過濾法和SDS-PAGE法測定蛋白質(zhì)相對分子量幻燈片 116 等電聚焦法測定等電點(diǎn)：等電聚焦時(shí)，蛋白質(zhì)混合物的分離是在具有PH梯度的蔗糖介質(zhì)中進(jìn)行的。在電場中，每種蛋白質(zhì)成分將移向并“聚焦”（停留在等于其等電點(diǎn)的PH梯度處，形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。它的分辨率很高，可以把人的血清分成40多個(gè)區(qū)帶。適于做同工酶的鑒定。 肽圖分析、氨基酸組成分析以及氨基酸序列分析來檢測肽段或蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化。,蛋白質(zhì)含量測定 含量測定：Folin-