1、第五章 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥,第一節(jié) 概述 第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特性 第三節(jié) 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得 第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基 第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 第六節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式 第七節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器 第八節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求 第九節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞制藥的前景與展望,目 錄,Robert Hooke 及其制作的顯微鏡,第一節(jié) 概述,Leeuwenhoek首次觀察到了活的細(xì)胞,德國植物學(xué)家Schleiden和動(dòng)物學(xué)家Schwann創(chuàng)立了細(xì)胞學(xué)說 1885年Roux用生理鹽水成功培養(yǎng)雞胚組織 1907年Harrison成功培養(yǎng)了離體的蛙胚神經(jīng)

2、組織，并觀察到神經(jīng)細(xì)胞突起的生長過程。開創(chuàng)現(xiàn)代細(xì)胞培養(yǎng)的新紀(jì)元。,細(xì)胞工程是以細(xì)胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進(jìn)行精心設(shè)計(jì)，精心操作，使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達(dá)到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出對人類有用的產(chǎn)品。,二、動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝,動(dòng)物細(xì)胞的化學(xué)組成 無機(jī)成分：水、無機(jī)鹽 有機(jī)成分：蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸 動(dòng)物細(xì)胞的代謝 糖，脂肪和蛋白質(zhì)的代謝分為三個(gè)降解階段 （大分子降解為小分子，小分子代謝產(chǎn)生三個(gè)主要 的中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)）,三

3、、動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn),細(xì)胞的分裂周期長：一般1248 h 細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象 接觸抑制現(xiàn)象：指細(xì)胞在生長過程中達(dá)到相互接觸時(shí)停 止分裂的現(xiàn)象。 正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的:時(shí)間長短決定 于細(xì)胞來源的種族和年齡 原代培養(yǎng) 有限細(xì)胞系 無限細(xì)胞系（連續(xù)細(xì)胞系）,動(dòng)物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感 對理化因素敏感：如滲透壓、pH、離子強(qiáng)度、剪切 力、微量元素等。 動(dòng)物細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求高 必需氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、微量元素、葡萄糖、 細(xì)胞生長因子、貼壁因子等。 動(dòng)物細(xì)胞對蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同,動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)藥物 缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低 優(yōu)點(diǎn)：分泌胞外、收集

4、純化方便，較完善的翻譯后 修飾，與天然產(chǎn)品一致,第三節(jié) 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得,一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求 二、生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞的獲得 三、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選 四、常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的特性 五、細(xì)胞庫的建立,一、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求,只有從正常組織中分離的原代細(xì)胞才能用來生產(chǎn)生物制品，如雞胚細(xì)胞、兔腎細(xì)胞等 二倍體細(xì)胞，即使經(jīng)過多次傳代也可用于生產(chǎn)，如WI-38，2BS細(xì)胞等 用異倍體傳代細(xì)胞生產(chǎn)重組基因產(chǎn)品，如t-PA、EPO、因子等 按照FDA對細(xì)胞株的要求，控制最終產(chǎn)品中DNA殘留量,二、生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的獲得,原代細(xì)胞：直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過粉碎、消化而獲得的細(xì)胞懸液。如雞胚細(xì)

5、胞、原代兔腎細(xì)胞或鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等 用原代細(xì)胞生產(chǎn)生物制品常需要大量的動(dòng)物，費(fèi)錢費(fèi)力,二倍體細(xì)胞系：原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選、克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株 由于該類細(xì)胞壽命有限，一般從動(dòng)物的胚胎組織中獲取。如WI-38、MRC-5、2BS等,轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：失去了正常細(xì)胞的特點(diǎn)，獲得了無限增殖的能力 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系具有無限生命力，常常倍增時(shí)間較短，對培養(yǎng)條件和生長因子等要求較低，更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。如Namalwa、CHO、BHK-21、Vero細(xì)胞等,融合細(xì)胞系 細(xì)胞融合：指兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并成一個(gè)細(xì)胞的過程 目前常用的融合方法有：仙臺病毒融合法、聚乙

6、二醇融合法、電融合法,仙臺病毒融合法（很少使用） 融合過程： 病毒加入兩種細(xì)胞（4），附膜，細(xì)胞凝聚 37，病毒與細(xì)胞膜反應(yīng)，細(xì)胞膜被破壞 兩細(xì)胞連接部穿通，周邊連接部修復(fù) 細(xì)胞融合,聚乙二醇（PEG）融合法 常用相對分子量為1000，濃度為50%，pH在8.08.2時(shí)融合率可達(dá)100% 目前主要用于產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備,電融合法：在短時(shí)間的強(qiáng)電場作用下，細(xì)胞膜發(fā) 生可逆性的電擊穿，使相鄰細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生繼發(fā) 性融合。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，無化學(xué)毒性、對細(xì)胞損傷小、融 合同步、融合率高，可在顯微鏡下直接觀察 決定因素：電場強(qiáng)度、脈沖寬度、溫度、緩沖液的 性質(zhì)（pH、離子強(qiáng)度、滲透壓）,

7、重組工程細(xì)胞系 可采用基因工程的手段構(gòu)建各種工程細(xì)胞,三、基因工程細(xì)胞的構(gòu)建和篩選,1.真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建 病毒載體：如牛痘病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)率病毒、桿 狀病毒等 質(zhì)粒載體：穿梭質(zhì)粒載體,用桿狀病毒做載體的優(yōu)點(diǎn),該病毒基因組是雙鏈DNA，容易進(jìn)行重組； 插入78kb的DNA不影響正常病毒粒子的形成； 多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子； 多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的2030%； 用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，容易以此為標(biāo)記物來挑選陽性克?。?如果用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體直接表達(dá)外源基因。,構(gòu)建

8、質(zhì)粒載體一般含有如下基本成分： 允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。 含有能使基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控元件。 能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。 僅適用于密切相關(guān)的突變細(xì)胞株，如tk基因 顯性作用基因，如neo基因 有時(shí)還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。,2.基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選,DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的常用方法,磷酸鈣沉淀法：將溶解的DNA加在Na2HPO4 中，逐漸加入CaCl2溶液，當(dāng) Na2HPO4和CaCl2形成 沉淀，DNA包裹在沉淀中，形成DNA-磷酸鈣共沉 淀物，當(dāng)沉淀物與細(xì)胞表面接觸時(shí)，通過吞噬作用 將DNA導(dǎo)入胞內(nèi)。 優(yōu)點(diǎn)：方法簡單，可進(jìn)行共轉(zhuǎn)化,電穿孔法：借助

9、電穿孔儀產(chǎn)生的高壓脈沖電場， 使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時(shí)可逆性的小孔，外源DNA沿小孔 進(jìn)入細(xì)胞。 特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率較高，但進(jìn)入的DNA拷貝數(shù)較低,如何篩選工程細(xì)胞？,依靠構(gòu)建載體內(nèi)的選擇標(biāo)記采用相應(yīng)的篩選系 統(tǒng)：如用HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶） 選擇系統(tǒng)，篩選tk+、hgprt+的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；用G418 （Geneticin）選擇系統(tǒng)，篩選neor的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 對選出的細(xì)胞進(jìn)行克隆和亞克隆使其純化。 利用擴(kuò)增系統(tǒng)，不斷增加其基因拷貝數(shù)，獲得高 效表達(dá)而穩(wěn)定的工程細(xì)胞株。,四、常用生產(chǎn)用細(xì)胞的特性,（1）WI-38： 1961年來源于女性高加索人正常胚肺組織的二 倍體細(xì)胞系。 該細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，

10、能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用 BME（Eagles basal medium）加小牛血清，pH控制在7.2。細(xì)胞的倍增時(shí)間為24h，有限壽命為50代，上世紀(jì)60年代被廣泛用于制備疫苗。,（2）BHK-21： 1961年從5只生長1天的地鼠幼鼠的腎臟中分離的?，F(xiàn) 在廣泛采用的是1963年用單細(xì)胞分離的方法經(jīng)13次的克隆的 細(xì)胞。 成纖維細(xì)胞，2n=44。通常用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng) 基，添加7%胎牛血清。過去多用于增殖病毒，包括多瘤病 毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，現(xiàn)在已被用于構(gòu)建工程細(xì) 胞。,（3）Vero： 1962年來源于正常的成年非洲綠猴腎。 是貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，2n=60，高倍體率 為1.7

11、%，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)。通常用的培養(yǎng)基為 199培養(yǎng)基，添加5%胎牛血清。該細(xì)胞可支持多種 病毒的增殖，包括脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病病毒，已被 批準(zhǔn)用于人體。,（4）Namalwa： 1972年來源于肯尼亞患有Burkitt淋巴瘤的病人 體中，后在瑞典構(gòu)建的一株人的類淋巴母細(xì)胞。 該細(xì)胞有2.8%的高倍體率，多數(shù)細(xì)胞有1214 條標(biāo)記染色體，單條X染色體，無Y染色體。通常用 的培養(yǎng)基為RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于大 規(guī)模生產(chǎn)-干擾素。,五、細(xì)胞庫的建立,用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫： 1. 原始細(xì)胞庫（master cell bank， MCB） 2. 生產(chǎn)用細(xì)胞庫（manuga

12、ctures working cell bank，MWCB），或稱工作細(xì)胞庫（working cell bank， WCB）。,原始細(xì)胞庫是單一來源的均質(zhì)的細(xì)胞，對于二倍體細(xì)胞 應(yīng)該是群體倍增水平盡可能低的細(xì)胞。貯存時(shí)須有該細(xì)胞的 詳細(xì)檔案，包括： 該細(xì)胞系的歷史：來源、年齡和性別、細(xì)胞分離的方法、所用的培養(yǎng)材料等； 該細(xì)胞系的特性：形態(tài)、生長的特性、種源的特性等； 對各種有害因子檢查的結(jié)果。,生產(chǎn)用細(xì)胞庫：從原始細(xì)胞庫來，或從單一安瓿來，或從多個(gè)安瓿在融化即刻混合在一起的，然后經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增到一定數(shù)量后，再分裝儲(chǔ)存形成的細(xì)胞庫。 生產(chǎn)用細(xì)胞庫也必須建立檔案，而且需要進(jìn)行無菌性和無細(xì)胞交叉污染的檢

13、查，生產(chǎn)時(shí)需確定其最高使用的傳代數(shù)。,第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基,培養(yǎng)成功必備條件： 所有與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液，都必須保持絕對無菌，避免細(xì)胞外微生物的污染 必須有足夠的營養(yǎng)供應(yīng)，絕對不可有有害的物質(zhì)，避免即使是極微量的有害離子的摻入 保證有適量的氧氣供應(yīng) 需要隨時(shí)清除細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的有害產(chǎn)物 有良好的適于生存的外界環(huán)境 及時(shí)分種，保持合適的細(xì)胞密度,一、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件,器材的清洗和消毒 水質(zhì) pH 滲透壓 溫度 空氣,1. 器材的清洗和消毒,（1）器材的清洗： 浸泡（3%磷酸三鈉） 刷洗 泡酸（重鉻酸鉀、硫酸、水） 沖洗（自來水、蒸餾水、去離子水） （2）器材的消毒滅菌：

14、物理方法：如紫外線、干熱、濕熱、過濾 化學(xué)方法：如化學(xué)消毒劑、抗生素,2. 水質(zhì),細(xì)胞培養(yǎng)的水必須進(jìn)行特殊的處理，才能使用。 除微生物、有毒元素、金屬離子、熱原質(zhì) 當(dāng)前處理水質(zhì)的方法有：蒸餾、離子交換、電滲透、反滲透、中空纖維過濾等,3. pH,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適pH為7.27.4，低于6.8或高于7.6會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，嚴(yán)重時(shí)可引起細(xì)胞退變甚至死亡。 培養(yǎng)基應(yīng)具有一定的緩沖能力，必須加入緩沖系統(tǒng)： 如HEPES、 Na2HPO4/ NaH2PO4緩沖系統(tǒng)、 NaHCO3/CO2緩沖系統(tǒng)等,4. 滲透壓,細(xì)胞必須生活在等滲環(huán)境中，大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞對滲透壓有一定耐受性。 最理想的滲透壓為290

15、300mOsm/kg 為調(diào)整培養(yǎng)液的滲透壓，一般采用加減NaCl的方法： 1mg/ml NaCl-32mOsm/kg 在細(xì)胞培養(yǎng)操作中，為保持合適的滲透壓和pH，一般都使用平衡鹽溶液（BBS），由無機(jī)鹽和葡萄糖組成。,5. 溫度,動(dòng)物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：370.5 昆蟲細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：27 溫度過高：細(xì)胞退變甚至死亡 溫度過低：降低代謝和生長速度，影響產(chǎn)量,6. 空氣,方瓶和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)時(shí)，保持瓶內(nèi)有足夠的空間，即培養(yǎng)的液體量不超過總體積的30%。 采用生物反應(yīng)器需通氣，采用不同比例的O2、N2、CO2和空氣。,無毒、無污染,體外生長的細(xì)胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有任何抵抗能力，因此培養(yǎng)基應(yīng)達(dá)

16、到： 無化學(xué)物質(zhì)污染 無微生物污染（如細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等） 無對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補(bǔ)體） 對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格選材，嚴(yán)格操作 對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配置過程，配制所用的水、器皿應(yīng)十分潔凈，配置后應(yīng)嚴(yán)格過濾除菌。,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成,1.天然培養(yǎng)基 指來自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類培養(yǎng)基，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。 缺點(diǎn)：成分復(fù)雜，制作過程復(fù)雜，組分不穩(wěn)定，批間差異大，來源有限，不適于大量培養(yǎng)和生產(chǎn)的需要，逐漸為合成培養(yǎng)基所替代。,2.合成培養(yǎng)基 優(yōu)點(diǎn)：成分明確，組分穩(wěn)

17、定，可大量生產(chǎn)供應(yīng) 其組成大致如下： 氨基酸：是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料。所有細(xì)胞都需要12種必需氨基酸： 纈、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精、胱。 此外還需要谷氨酰胺，它在細(xì)胞代謝過程中有重 要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的來 源，同樣也是合成三、二、一磷酸酰苷所需要的基 本物質(zhì)。,維生素：主要是形成酶的輔酶、輔基，維持細(xì)胞生命活動(dòng)的低分子活性物質(zhì)。脂溶性（A、D、E、K），水溶性維生素（C、B1、B2、B12、生物素、葉酸、膽堿）等都是常用的成分。 糖類:培養(yǎng)中的細(xì)胞可以進(jìn)行有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細(xì)胞對葡萄糖的

18、吸收能力最高，半乳糖最低。,無機(jī)鹽：保持細(xì)胞的滲透壓，緩沖pH的變化，并積極參與細(xì)胞的代謝。細(xì)胞生長除需Na、K、Ca、Mg、N、P等基本元素，還需要Fe、Cu、Zn、Mn等微量元素。 其它成分：有些合成培養(yǎng)基中還加有核酸的前體、氧化還原劑等。一般都需要加入510%的小牛血清。 除了以上與細(xì)胞生長有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還 要加入一種pH指示劑酚紅。當(dāng)溶液酸性時(shí)pH6.8呈黃色， 當(dāng)溶液堿性時(shí)pH8.4呈紅色。,血清的主要成分,血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機(jī)物等,血清的種類,小牛血清：取自出生10-30天的小牛 新牛血

19、清：取自出生24h之內(nèi)的新生牛 胎牛血清：取自剖腹產(chǎn)的胎牛，血清中所含的抗體、補(bǔ)體等對細(xì)胞有害的成分最少。,血清的外觀,好的血清應(yīng)該是透明清亮，土黃色或棕黃色，無沉淀或極少沉淀，比較粘稠。 如血清渾濁、不透明、含許多沉淀物，說明血清污染或血清中的蛋白質(zhì)變性。 若血清呈棕紅色，說明血清中的血紅蛋白含量太高，取材時(shí)有溶血現(xiàn)象。 搖晃時(shí)感覺液體稀薄，說明血清中摻入的生理鹽水太多。,血清的作用機(jī)制,提供有利于細(xì)胞生長增殖所需的各種生長因子和激素 提供有利于細(xì)胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子 提供可識別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白 提供細(xì)胞生長所必需的脂肪酸和微量元素 提供良好的pH緩沖系統(tǒng),3.無

20、血清培養(yǎng)基 優(yōu)點(diǎn)： 提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批次之間差異的影響； 減少了由血清帶來病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)； 供應(yīng)充足、穩(wěn)定； 細(xì)胞產(chǎn)品容易純化； 避免了血清中某些因素對有些細(xì)胞的毒性； 減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。,無血清培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基+不同種類的添加劑 添加劑大致有以下幾類： 激素和生長因子： 各種激素、生長因子的功能 維持細(xì)胞的功能 保持細(xì)胞的狀態(tài)（分化或未分化） 使用最多的是胰島素，促進(jìn)糖原和脂肪酸的合 成，對細(xì)胞生長有刺激作用。,無血清培養(yǎng)基,結(jié)合蛋白：最經(jīng)常被補(bǔ)充的是鐵傳遞蛋白和白蛋白。為了便于純化，有時(shí)可用硫酸亞鐵、檸

21、檬酸鐵、葡萄糖酸鐵代替鐵傳遞蛋白。 貼附和伸展因子：目前多數(shù)無血清培養(yǎng)基只適用于懸浮細(xì)胞，真正能用以培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的很少，也很貴，原因在于它們均缺少必需的貼附和伸展因子。除貼附因子（纖維結(jié)合蛋白、膠原）、多肽生長因子，有的還添加維生素A酸和重組的小肽，它可與細(xì)胞的受體結(jié)合。 其它有利于細(xì)胞生長的因子和元素：它們包括有消除氧自由基損害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。,如何選擇培養(yǎng)基,選擇培養(yǎng)基沒有一定的標(biāo)準(zhǔn)，有幾點(diǎn)建議可供參考： 建立某種細(xì)胞株所用的培養(yǎng)基應(yīng)該是培養(yǎng)這種細(xì)胞首選的培養(yǎng)基?？梢圆殚唴⒖嘉墨I(xiàn)，或在購買細(xì)胞株時(shí)咨詢。 根據(jù)細(xì)胞株的特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)的需要來選擇培養(yǎng)基。 用多種培養(yǎng)基培養(yǎng)目的細(xì)胞

22、，觀察其生長狀態(tài)，可以用生長曲線、集落形成率等指標(biāo)判斷，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基，這是最客觀的方法。,培養(yǎng)細(xì)胞的種類： 原代細(xì)胞培養(yǎng) 傳代細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)基不同： 液體培養(yǎng) 固體培養(yǎng) 培養(yǎng)容器和方式不同： 靜止培養(yǎng) 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 微載體培養(yǎng) 中空纖維培養(yǎng) 固定化培養(yǎng),第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法,一、細(xì)胞分離,離心分離法：主要用于從含有細(xì)胞的體液，如血液、羊水、胸腹水中分離細(xì)胞，8001000 r/min離心510min 消化分離法：將生物體的組織塊剪碎-用消化液消化，使組織松散成細(xì)胞懸液-用緩沖液洗滌、離心、去除殘留的消化液-獲得所需細(xì)胞,消化液的用途：取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)需要將組織塊消化解離形

23、成細(xì)胞懸液；傳代培養(yǎng)時(shí)將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來。 常用的消化液:胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA、膠原酶、鏈酶蛋白酶、木瓜蛋白酶等,二、細(xì)胞計(jì)數(shù),自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù) 原理：讓一定體積的細(xì)胞懸液流經(jīng)一個(gè)小孔，并在兩個(gè)電極間通過，此時(shí)通過的細(xì)胞就會(huì)對電極間的電流產(chǎn)生干擾而使電壓發(fā)生改變，這樣就會(huì)在電子計(jì)數(shù)器上形成一個(gè)信號被記錄下來。 優(yōu)點(diǎn)：計(jì)數(shù)速度快 缺點(diǎn)：無法分辨活細(xì)胞和死細(xì)胞，誤將細(xì)胞結(jié)團(tuán)記錄為單個(gè)細(xì)胞，使計(jì)數(shù)值偏低,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),2.血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),臺酚藍(lán)染色：死細(xì)胞呈藍(lán)色 苯胺黑染色：負(fù)染色法，細(xì)胞本身不染色,結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計(jì)數(shù)法 原理：結(jié)晶紫染液屬

24、堿性染料，低滲，有螯合鈣離子的作用，可使細(xì)胞分散解離和破碎，將細(xì)胞核染成藍(lán)色。染色后取樣在血球計(jì)數(shù)板上鏡檢，計(jì)數(shù)細(xì)胞核即細(xì)胞數(shù)。,MTT染色計(jì)數(shù)法 MTT:3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。 原理：活細(xì)胞內(nèi)的線粒體脫氫酶能將MTT轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄缘淖仙募着H結(jié)晶，可溶于二甲亞砜（DMSO）。 MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。用酶標(biāo)儀在490nm處測定其吸光值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。 靈敏度高；MTT有致癌性，DMSO極易滲透皮膚,三、細(xì)胞傳代,懸浮細(xì)胞的傳代：加入一倍或幾倍的生長液，然后分種兩只或多只培養(yǎng)瓶 貼壁細(xì)胞的傳代：先消化再分

25、種,貼壁細(xì)胞傳代的注意事項(xiàng),消化前確定細(xì)胞有無污染 加入消化液量要適當(dāng)，搖動(dòng)時(shí)能蓋滿單層細(xì)胞即可 消化時(shí)間不宜過長，室溫靜置2-5min 終止消化要先去掉消化液，然后加入有血清的培養(yǎng)基 分種數(shù)量取決于細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞特性，多數(shù)以20-30萬個(gè)/ml，每次1傳2或1傳3為宜； 已培養(yǎng)過的瓶子可再次使用，但不要超過2-3次 二倍體細(xì)胞每次傳代時(shí)應(yīng)寫上傳代次數(shù) 傳代后每天或隔一天換液，3-5d傳代一次,四、細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇,1.細(xì)胞的凍存 采用液氮低溫（-196）凍存：加保護(hù)劑如甘油和二甲亞砜；冷凍速度以1/min的速度下降為宜 注意事項(xiàng)： 凍存前一天換液培養(yǎng)； 細(xì)胞密度以1-2106個(gè)/ml為宜； 凍

26、存用培養(yǎng)基應(yīng)與實(shí)際使用的一致，DMSO過濾除菌； 檢查安踣的密封性； 標(biāo)簽要寫上細(xì)胞名稱，編號和凍存日期。,2.細(xì)胞的復(fù)蘇（總的要求是快融） 注意事項(xiàng)： 操作中注意防護(hù)，戴面罩和手套； 從液氮中取出后，立即丟入37-40溫水的搪瓷杯中，并攪動(dòng)加速融化； 用乙醇消毒安踣外表； 盡早除去二甲亞砜，離心，換新鮮培養(yǎng)液； 隔天觀察細(xì)胞生長情況，再換液一次。,一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法 二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式,第六節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式,一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法,依細(xì)胞種類： 原代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng) 依培養(yǎng)基： 液體培養(yǎng) 固體培養(yǎng),依培養(yǎng)容器和方式： 靜止培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、 攪拌培養(yǎng)、

27、微載體培養(yǎng) 中空纖維培養(yǎng)、 固定床或流化床培養(yǎng),從生產(chǎn)實(shí)際分為： 懸浮培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng) 貼壁-懸浮培養(yǎng),1.懸浮培養(yǎng),懸浮培養(yǎng)：即讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖。適用 于一切種類的非貼壁依賴性細(xì)胞（懸浮細(xì)胞）， 也適用于兼性貼壁細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，培養(yǎng)條件比較單一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)和實(shí)際操作中可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)；可連續(xù)收集部分細(xì)胞進(jìn)行移植繼代培養(yǎng)，傳代時(shí)無需消化分散，免遭酶類、EDTA及機(jī)械損害；細(xì)胞收率高，并可連續(xù)測定細(xì)胞濃度，還有可能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模直接克隆培養(yǎng)。 缺點(diǎn)：細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度較低,培養(yǎng)過程中，為確保細(xì)胞呈單顆粒均勻懸浮

28、狀態(tài)，需采用攪拌或氣升式反應(yīng)器，以較低攪拌速度及一定速度通入含5%CO2的無菌空氣，保持細(xì)胞懸浮狀態(tài)并維持培養(yǎng)液溶解氧和pH。 不同細(xì)胞懸浮條件不同。為使細(xì)胞不致凝集、成團(tuán)或沉淀，在配制培養(yǎng)基的基礎(chǔ)鹽溶液中不加鈣和鎂離子。間歇或連續(xù)更換部分培養(yǎng)液，可維持pH值，若使用HEPES緩沖鹽溶液可不必連續(xù)通入含5%CO2的空氣。,2.貼壁培養(yǎng),貼壁培養(yǎng)：是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁 殖的培養(yǎng)方法。適用于一切貼壁依賴性 細(xì)胞，也適用于兼性貼壁細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：適用的細(xì)胞種類廣，較容易采用灌流培養(yǎng) 缺點(diǎn)：操作麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面 積，傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)需先消化，培養(yǎng)條件不易均 一，傳質(zhì)和傳氧

29、較差。,3.貼壁-懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）,微載體培養(yǎng) 包埋和微囊培養(yǎng) 結(jié)團(tuán)培養(yǎng),（1）微載體培養(yǎng),微載體培養(yǎng)法：將動(dòng)物細(xì)胞吸附于微載體表面，在 培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，使細(xì)胞在微載體表面長成 單層的培養(yǎng)方法，或稱微珠培養(yǎng)法。 制備微載體的材料主要有： 葡聚糖 明膠 玻璃 纖維素等,微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：既可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長增殖，滿足絕大多數(shù)細(xì)胞的基本要求，又由于載體體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)，充分發(fā)揮了懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)。,理想微載體需具備的條件,微載體表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容性； 微載體的材料無毒性； 微載體的材料是惰性材料； 材料比重為1.

30、030-1.045g/ml； 粒徑60-250m（溶脹后），大小均一； 具有好的光學(xué)透明性； 基質(zhì)的性質(zhì)是軟性的； 可耐120高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌 原料充分，制作簡便，價(jià)格低廉，可反復(fù)使用,從固體微載體發(fā)展到多孔微載體（porous microcarrier）或多孔微球：極大增大了供細(xì)胞貼附的比表面積，同時(shí)適用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。,（2）包埋和微囊培養(yǎng),包埋法：將細(xì)胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中 微囊法：由包埋法衍生而來，將包埋的顆粒經(jīng)液化處理而成為微囊 可用于包埋細(xì)胞的載體材料：人工合成的高分子聚合物（聚丙烯酰胺、環(huán)氧樹脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等）、糖類（如纖維素、瓊

31、脂、瓊脂糖、K-卡拉膠、海藻酸鈣、殼聚糖等）、蛋白質(zhì)（如膠原、明膠、纖維蛋白等）,包埋或微囊培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn),包埋或包裹在載體或微囊內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害。 可以獲得較高的細(xì)胞密度，一般都在107-108個(gè)/ml以上。 當(dāng)控制微囊膜的孔徑后，可使產(chǎn)品濃縮在微囊內(nèi)，從而有利于下游產(chǎn)物的純化。 可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。,（3）結(jié)團(tuán)培養(yǎng),利用細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法培養(yǎng)，可獲得高密度的細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，節(jié)省了用于微載體的成本,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式,分批式操作 補(bǔ)料-分批（或流加式）操作（細(xì)菌生產(chǎn)中常用） 半連續(xù)式操作 連續(xù)式操作（個(gè)別情況下用于

32、懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)） 灌流式操作,1.分批式操作,將細(xì)胞和培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，此后細(xì)胞不斷增長，產(chǎn)物不斷形成和積累，最后將條件培養(yǎng)基，即經(jīng)培養(yǎng)已含有細(xì)胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞一并取出，培養(yǎng)結(jié)束。 先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器，待細(xì)胞生長至一定密度后，向反應(yīng)器內(nèi)加入誘導(dǎo)劑或病毒等，經(jīng)一段時(shí)間作用后，將反應(yīng)物取出。,2.半連續(xù)式操作,定義：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時(shí)間，取出部分培養(yǎng)物，或單純是條件培養(yǎng)基，或連同細(xì)胞、載體一起，然后補(bǔ)充同樣數(shù)量的新鮮培養(yǎng)基，或另加新鮮載體，繼續(xù)培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，而

33、且可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。,3.灌流式操作,定義：當(dāng)細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)不斷地補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營養(yǎng)狀態(tài)。,細(xì)胞可處在較穩(wěn)定的良好的環(huán)境中，營養(yǎng)條件好，有害代謝廢物濃度低； 可極大地提高細(xì)胞密度，從而極大地提高了產(chǎn)品產(chǎn)量； 產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間縮短，可及時(shí)收留在低溫下保存，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高； 培養(yǎng)基的比消耗率較低，加之產(chǎn)量質(zhì)量的提高，生產(chǎn)成本明顯降低。,灌流式操作的優(yōu)點(diǎn),一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型 二、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測控制系統(tǒng),第七節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器,

34、生物反應(yīng)器必備條件,制造生物反應(yīng)器所采用的一切材料，尤其是與培養(yǎng)基、細(xì)胞直接接觸的材料，對細(xì)胞必須是無毒性的 生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)必須使之具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能 密封性能良好，可避免一切外來的不需要的微生物的污染 對培養(yǎng)環(huán)境中多種物理化學(xué)參數(shù)能自動(dòng)檢測和調(diào)節(jié)控制，控制的精確度高，能保持環(huán)境質(zhì)量的均一,可長期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn) 容器加工制造時(shí)要求內(nèi)面光滑，無死角，以減少細(xì)胞或微生物的沉積 拆裝、連接和清潔方便，耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修 設(shè)備成本盡可能低,生物反應(yīng)器必備條件,按規(guī)模大小可分為： 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：20L，用于培養(yǎng)工藝的研究; 中試規(guī)模：20100L，提供一定量的產(chǎn)品，供純 化、臨床前的各

35、種檢測和臨床觀察，也包括進(jìn)一步 的工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn); 生產(chǎn)規(guī)模：100L，用于生產(chǎn)，提供產(chǎn)品。,動(dòng)物生物反應(yīng)器,一、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的類型,攪拌罐式生物反應(yīng)器 氣升式生物反應(yīng)器 透析袋或膜式生物反應(yīng)器 中空纖維生物反應(yīng)器 固定床或流化床式生物反應(yīng)器,二、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測控制系統(tǒng),培養(yǎng)過程中需檢測的物化參數(shù)：有些需要在線檢測，如溫度、pH、攪拌速度、溶氧等；有些則需要取樣離線檢測，如活細(xì)胞數(shù)、氨基酸濃度分析、葡萄糖乳酸和銨離子的檢測等，有些則需在檢測后計(jì)算后才能獲得，如細(xì)胞的群體倍增時(shí)間、細(xì)胞的比增長率、葡萄糖消耗率、乳酸產(chǎn)率、生物反應(yīng)器生產(chǎn)率等。,動(dòng)物細(xì)胞對攪拌引起的剪切力和氣泡很敏感，

36、要保持所 需的溶氧很困難，常采用的措施有： 改變進(jìn)氣的組成：不同比例的O2、N2、CO2和空氣 加大通氣流量 適當(dāng)提高轉(zhuǎn)速 在反應(yīng)器外通氣 加入血紅蛋白 適當(dāng)提高罐壓,一、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品常用的純化方法 二、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量要求,第八節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量要求,下游純化工作費(fèi)錢、難度大,成分復(fù)雜：工程細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)品，常常和細(xì)胞內(nèi)容物、培養(yǎng)基成分，特別當(dāng)采用有血清培養(yǎng)基時(shí)小牛血清中的各種蛋白成分都將與產(chǎn)物混雜在一起，這些成分的物化性質(zhì)常常和目的產(chǎn)物非常相似，因此很難將他們分離開 作用于人體的藥物純度要求高：由于產(chǎn)品多數(shù)用于人體，為防雜質(zhì)對人體的有害作用，對產(chǎn)品的純度要求很高,大多數(shù)動(dòng)物細(xì)

37、胞表達(dá)的產(chǎn)物產(chǎn)量低，生物活性不穩(wěn)定，因此要求純化過程中所有的操作都應(yīng)該非常溫和、精細(xì)，包括溶液的溫度、pH和鹽離子強(qiáng)度等都需要嚴(yán)格控制，要有相當(dāng)精密的設(shè)備和檢測儀器。 由于細(xì)胞產(chǎn)品多種多樣，它們的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)、相對分子質(zhì)量大小和等電點(diǎn)等都不盡相同，因此分離純化技術(shù)的通用性差，必須根據(jù)每一種產(chǎn)品的特點(diǎn)研究開發(fā)出適合于該產(chǎn)品的專用的分離純化技術(shù)。,一、動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品常用的純化方法,離心（低溫離心） 離子交換層析 凝膠層析 親和層析 鹽析和有機(jī)溶劑沉淀 透析 高壓液相層析,鹽析和有機(jī)溶劑沉淀,鹽析：溶液中加入無機(jī)鹽類，破壞蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜，使蛋白質(zhì)溶解度降低而析出。最常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等。調(diào)節(jié)鹽濃度和pH常同時(shí)使用。鹽析時(shí)蛋白不易變性，結(jié)束后需要進(jìn)行透析、超濾脫鹽。 有機(jī)溶劑沉淀：加入與水可混溶的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，也可使蛋白質(zhì)沉淀。為了避免蛋白質(zhì)變性必須在低溫下操作。,透析,原理：蛋白質(zhì)分子較大，不能通過半透膜，可以據(jù)此將蛋白質(zhì)與相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)分開。,高壓液相層析 （HPLC，high-pressure liquid chromatography）,使用顆粒極細(xì)的介質(zhì)，在高壓