1、肝癌細(xì)胞培養(yǎng)一、徽章1、RPMI-1640 10%胎兒牛血清培養(yǎng)基2、DMEM 15%胎兒牛血清培養(yǎng)基成分表二、實驗前的準(zhǔn)備：工人的皮膚，培養(yǎng)瓶蓋，外壁經(jīng)常用酒精消毒。實驗室空氣、工作臺和其他方法不能消毒的部分培養(yǎng)基。進(jìn)入無菌室之前或?qū)嶒灲Y(jié)束后，打開燈消毒30分鐘。如果紫外線照射60分鐘，大部分細(xì)菌就會在空氣中被清除。1、玻璃制品清洗和殺菌(5%鹽酸溶液，重鉻酸鉀120毫升，硫酸200毫升，蒸餾水200毫升):(1) :新使用或重復(fù)使用的玻璃器具要用5%鹽酸溶液或自來水浸泡一夜，或煮30分鐘沖洗。去除新購買的玻璃器皿中的灰塵、鉛、砷等，也去除了其弱堿性物質(zhì)。(2)浸泡：后，用柔軟的刷子和優(yōu)質(zhì)的

2、洗面奶擦拭。擦后逐行烘干。(3)酸浸：刷洗的玻璃制品，應(yīng)在酸浸前適當(dāng)烘干或烘干，使酸提取物稀釋，以免影響效果。把玻璃制品完全浸入清洗液中。清洗液酸性很強(qiáng)，操作過程中要戴保護(hù)套。(4)煤油：膽酸玻璃器皿首先用自來水充分沖洗，吸管10分鐘，碗各裝滿自來水，重復(fù)10次以上，用蒸餾水沖洗2-3次，不留下酸性殘渣，將清洗過的玻璃器皿放入烘干機(jī)，干燥的玻璃器皿干凈透明，沒有煙塵，有害物質(zhì)或化學(xué)(5)包裝滅菌：基材清洗干燥或干燥后，首先要嚴(yán)格包裝，進(jìn)行消毒滅菌處理，殺菌后防止再次污染。包裝材料經(jīng)常使用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉、鋁便當(dāng)、玻璃或金屬吸管、紙繩等。2、清潔和消毒橡膠制品：0.5mol/L NaO

3、H煮沸15分鐘，在流動的水中沖洗0.5mol/L HCl，在流動的水中沖洗15分鐘，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50 在干涸的水中煮沸3、塑料制品清洗和消毒(帽、離心管):使用器具后，立即用水沖洗，整夜浸泡在自來水中，用紗布、棉棒和50 的清潔劑擦拭，在流動的水中沖洗，晾干，在清潔液中浸泡15分鐘，沖洗(15-20次)，將蒸餾水浸泡3次，在24小時內(nèi)烘干兩次蒸的水泡，晾干草料。三、細(xì)胞恢復(fù)：冷凍保存細(xì)胞保存管被保存在液氮中(-196)，去除保存管后，要迅速冷凍，使冰晶重新結(jié)晶，避免對細(xì)胞造成傷害，使細(xì)胞死亡。冷凍儲存細(xì)胞的保存管中含有對細(xì)胞有毒的成分DMSO，解凍時應(yīng)立即去除。冷凍激活

4、前，在滅菌臺上正確對準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)液后，要從液氮中取出保存管，放入37 的溫水中，快速解凍細(xì)胞。解凍后，懸浮液迅速被培養(yǎng)液吸收，離心去除上等液，然后加入細(xì)胞培養(yǎng)液。實驗者們戴上滅菌實驗室，將酒精灑在手上消毒，然后用酒精棉棒在原地擦拭實驗臺(1)15毫升離心機(jī)滴管5-9毫升培養(yǎng)液(8毫升)。(2)從液氮瓶中取出冷凍保管管，快速放入37 的水浴，隨時搖動，使其快速融化，在30 60s內(nèi)完成。(3)冷凍保管管酒精70%擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到上述離心管(用培養(yǎng)基再次沖洗冷凍管，去除附著在墻上的所有細(xì)胞)。(4)拆卸低速離心(1000r/min) 5min后，用8ml培養(yǎng)液再次清潔離

5、心力。(5)離心后，滴上清液，將3ml培養(yǎng)液(RPMI-1640)放入離心管中，攪拌均勻(可以用滴管輕吹)。(6)將離心管的混合液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶后，在培養(yǎng)瓶上滴下15滴小牛的血清，蓋上瓶蓋，標(biāo)記細(xì)胞種類、日期、培養(yǎng)人的名字等，然后將培養(yǎng)瓶扁平地展開，放入37C培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2-3天換一次徽章。四、細(xì)胞系：如果觀察培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞擴(kuò)散到90%(細(xì)胞在代數(shù)期間生長)，就要解凍成功復(fù)活的細(xì)胞，分離培養(yǎng)。否則，細(xì)胞可能缺乏生存空間或密度過高，有營養(yǎng)障礙，影響細(xì)胞生長。細(xì)胞原來在培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后在新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱為繼代培養(yǎng)。多代細(xì)胞主義最大的意大利為便于實驗，提供了很多持續(xù)的實驗物質(zhì)。(1)準(zhǔn)

6、備試驗臺的消毒工作，廢棄舊培養(yǎng)液，用PBS溶液(鈣、鎂離子除外)沖洗1-2次，防止剩余培養(yǎng)液影響胰蛋白酶活性。(細(xì)胞附著生長)。(2)在瓶子里放入1毫升消化液(0.25%Trypsin-0.53mEDTA)，在37孵化箱或室溫(25 溫度)下消化，1-3min后將培養(yǎng)瓶倒放在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)收縮，細(xì)胞間距增大，應(yīng)立即停止消化注：如果細(xì)胞沒有脫壁，生長良好，直接倒入消化液，加入培養(yǎng)液8毫升，用離心力收集細(xì)胞；很多細(xì)胞被確認(rèn)為脫壁狀態(tài)(即過度分離)后，添加培養(yǎng)液，用離心力收集細(xì)胞。(4)倒入消化液，在瓶子里使用滴管，放少量培養(yǎng)液(約2毫升)，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，沖洗剩余胰腺蛋白質(zhì)液消化液，加入

7、3ml培養(yǎng)液15滴小牛血清。(5)利用吸管拉出瓶內(nèi)培養(yǎng)液，依次反復(fù)輕吹瓶壁細(xì)胞，從瓶壁上脫落，形成細(xì)胞懸浮液。吹的時候要用力，以防止細(xì)胞過度損傷。(6)將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸浮液放入離心管，離心(1000r/min) 5min。(7)離心后，在離心管中倒入液體，在離心管中加入3ml培養(yǎng)液，反復(fù)吹出細(xì)胞，形成細(xì)胞懸浮液。(8)取3個無菌培養(yǎng)瓶，擦拭酒精棉棒消毒，在酒精燈下過度消毒。(9)培養(yǎng)瓶中分別加入1ml細(xì)胞懸浮，2ml培養(yǎng)液(使用吸管)，15滴小牛血清，在酒精燈下過量填充。(10)細(xì)胞培養(yǎng)交換時間取決于細(xì)胞生長的狀態(tài)和實驗要求。通常在2 3d后需要更換一次生長液。細(xì)胞裝滿碗的底部后，就可以使用了

8、。也可以繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)或?qū)⑴囵B(yǎng)換成維持液的過程。五、細(xì)胞冷凍保存：細(xì)胞的冷凍保存最常用液氮凍結(jié)保存法，主要是加入適量的保護(hù)劑，慢慢冷凍的細(xì)胞。因為細(xì)胞不添加保護(hù)劑，細(xì)胞內(nèi)外的水分很快就會形成冰晶，引起一系列副作用。由于細(xì)胞脫水，局部電解質(zhì)濃度升高，PH值發(fā)生變化，部分蛋白質(zhì)因變性而擾亂細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致溶酶體被破壞，釋放大量酶，破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因此，細(xì)胞結(jié)冰時最重要的是盡量減少細(xì)胞內(nèi)水分，最小化細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。因此，冷凍保管時使用甘油或DMSO作為保護(hù)劑，分子量小、溶解度高，容易滲透細(xì)胞，降低冰點，提高水對細(xì)胞膜的通透性，對細(xì)胞毒性小，傾斜緩慢的凍結(jié)可以減少細(xì)胞內(nèi)水分滲入細(xì)胞外形成冰晶的細(xì)胞

9、損傷。細(xì)胞低溫保存是培養(yǎng)室的日常工作和一般技術(shù)。細(xì)胞凍存-196液氮中儲存時間幾乎是無限的。細(xì)胞冷凍保存和復(fù)蘇的原則是緩慢凍結(jié)和快速融化。(1)選擇代數(shù)增殖期細(xì)胞(細(xì)胞覆蓋90%左右時)，冷凍前1d交換。(2)準(zhǔn)備試驗臺的消毒工作，倒入培養(yǎng)瓶內(nèi)的舊培養(yǎng)液。(3)為了復(fù)蓋培養(yǎng)瓶底部，最好將1ml 0.25%胰蛋白酶溶液放入瓶內(nèi)。(4)在37 的孵化箱或室溫(25 的溫度)下，為消化放置1-3min后，用顯微鏡反向觀察培養(yǎng)瓶，細(xì)胞質(zhì)量收縮，細(xì)胞間距變大，應(yīng)立即停止消化。(5)吸出消化液，去除胰蛋白酶液，直接放入3ml培養(yǎng)液15滴小牛血清，結(jié)束消化。(6)使用彎頭吸管拉出瓶內(nèi)培養(yǎng)液，依次反復(fù)輕吹瓶壁細(xì)胞，從瓶壁上脫落，形成細(xì)胞懸浮液。翅膀軟化，防止細(xì)胞過度損傷，照常用懸浮液制造培養(yǎng)細(xì)胞。(7)從培養(yǎng)瓶將細(xì)胞懸浮輸送到15ml離心管，(1200r/min) 6min，去除上清液。添加3ml培養(yǎng)液，以現(xiàn)有方法形成細(xì)胞懸浮液。(8)準(zhǔn)備冷凍保存培養(yǎng)液(培養(yǎng)液7毫升，10%犢牛血清2毫升，10% DMSO 1毫升)，將1毫升細(xì)胞懸浮液放入離心管，加入適量冷凍保存培養(yǎng)液，用吸管輕輕拍打，均勻細(xì)胞。(9)將細(xì)胞懸浮液分別裝扮在滅菌冷凍管上1.5毫升(冷凍液先