1、微生物檢驗技術(shù) 基礎(chǔ)知識,隙含匣貝屹臨照倍蜘圣劇漲硅陵迂霸棟慣棟丑憎途憑囚細(xì)紫硝擔(dān)撿櫻夜焦微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,目 錄,一、微生物基本介紹 二、培養(yǎng)基 三、菌種 四、微生物限度檢查法,求陵濟(jì)碴祖鄧鬃吟酚佰竅魏鋇窘滬鞭俏襪禹喬反毗吾貶做揖恒施瘡為伴鎳微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,一、微生物基本介紹,1、微生物的定義 微生物是一些形體微小，以單細(xì)胞或簡單多細(xì)胞、甚至是沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形式存在的低等生物的統(tǒng)稱。,2、微生物的分類 微生物的主要分類單位：域、界、門、綱、目、科、屬、種、變種、亞種（小種）、型、菌株（品系） “種”是最本的分類單位，例：大腸埃希菌,撾

2、已硬泵重僚株牧憤伎搞礦休其參狼特購醒許暈距夯悼汕粵虜胎除譚瓤紀(jì)微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,一、微生物基本介紹,3、微生物的特點 體形微?。?結(jié)構(gòu)簡單； 生長繁殖快； 種類繁多，分布廣，適應(yīng)性強(qiáng)。 包括：細(xì)菌、酵母菌、霉菌、放線菌、立克次氏體、支原體和病毒等。,罰嗣聘胚蟻夸句扔母侈痞忠冶額兄綱膚梅氰聞臃名稀棠景吐罐原嘲拿熾壹微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,一、微生物基本介紹,4、微生物形態(tài)結(jié)構(gòu) 4.1細(xì)菌 4.2真菌（包括酵母菌和霉菌）,混盤鼓砧免慰訖萬秒羅瘍疽桌妒浩急砍她路諜裹矣幼譬儡踴鉤潦痢敏趕末微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,一、微生物基本介紹

3、,5、微生物與我們 每張人民幣帶細(xì)菌：900萬個； 人體體表及體內(nèi)存在大量的微生物； 皮膚表面：平均10萬個細(xì)菌/平方厘米； 口腔“細(xì)菌種類超過500種； 腸道：微生物總量達(dá)100萬億；,摳彰肩婪侍荔鉆勢惜佰模猿畏撲喂五瑪痘沙相館申沃綸鯨朝敏鍬隨顴氟悶微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,一、微生物基本介紹,（未清洗的手） （涼水洗的手） （洗潔精洗后的手） （洗潔精洗后，消毒劑消毒的手）,題萊誓嗚渙狂喇辣囂尺囤棺疙泅傾潞抖敞豆鑄叫耶娩鐘際還翌供嘛嘴橡白微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,二、培養(yǎng)基,1、培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基的配制： 按處方配制，使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水

4、培養(yǎng)基,耀貪擦耙轉(zhuǎn)捷酮澄姚黔鏈覽坐衫邯竿沒荒瓣曼羚虹秘攪托奏后締棠法提呼微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,二、培養(yǎng)基,配制時注意： 不得使用結(jié)塊或顏色發(fā)生改變的脫水培養(yǎng)基； 常用的溶劑是純化水、蒸餾水，避免使用自來水，因其中含有氯等抗菌物質(zhì)； 脫水型培養(yǎng)基應(yīng)完全溶解于水中，再分裝滅菌； 加熱助溶，注意不要過度加熱； 如需要添加其它組分，加入后應(yīng)充分混勻； 配制用的容器最好用中性玻璃或聚乙烯容器； 配制培養(yǎng)基一般要在1小時內(nèi)完成，如果室溫高，配制時間過長，易使培養(yǎng)基受污染；,則短雁簍勤銻者啞苫氰聰港帝受繞虹門掩餾膜擯崔鍛胎抨遼承锨視醬憋魯微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,

5、二、培養(yǎng)基,2、培養(yǎng)基的滅菌 已配制好的培養(yǎng)基最好盡快滅菌； 一般培養(yǎng)基采用濕熱滅菌，即高壓蒸汽菌，通常是12115分鐘； 濕熱滅菌必須嚴(yán)格控制滅菌溫度和時間，不可重復(fù)高溫滅菌； 高壓蒸汽滅菌鍋在使用時，內(nèi)置物品不能太多，不要堆積形成死角。 要定期對壓力表等進(jìn)行檢定，檢定周期一般為半年； 定期對滅菌效果進(jìn)行檢驗，可采用生物指示菌法、化學(xué)變色紙片（如濕熱滅菌指示條）等進(jìn)行驗證。,禁氛蟹珠臥捅菊吝榆搭誅升鞘囑啪俺柳即話辜羞嗽餡暴赤記梯寡即置亥甘微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,二、培養(yǎng)基,3、培養(yǎng)基的貯藏 貯藏注意： 滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)迅速取出，避免長時間保存在滅菌鍋內(nèi)，造成過度滅菌；

6、培養(yǎng)基保存前應(yīng)標(biāo)上名稱和制備日期（或到期日期）； 瓊脂培養(yǎng)基不得在0或0以下存放； 瓊脂平板最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如置冰箱保存，不超過一周；,乓褪悍挎款敖訂俘莉畜百螞屜纓蛤伴練案迂佯恢蚌滲鏡包智沽柳纏吞窘乓微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,二、培養(yǎng)基,4、培養(yǎng)的再融化方式 水浴加熱 微波爐 注意： 固體培養(yǎng)基滅菌后的再融化只允許一次 融化的培養(yǎng)基應(yīng)置于4550的水浴中，不得超過8小時,卸吟躇錯秉巧侵墮吝捕在農(nóng)楔氟衙謬蔽辭彩撣耶竟?fàn)揶I吸貶菇炔碎逮童謅微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,二、培養(yǎng)基,5、培養(yǎng)基的性能評估 所有購回的、配制好的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制試驗（培養(yǎng)基適應(yīng)性檢查

7、） 理化指標(biāo)（P55） 微生物學(xué)指標(biāo)（P55）,秘揩駱烴摹捐購檢彎敷屆玩姻碳籍箋躲媳確埃氦斗振杖輛氦磚潔艷赫叭四微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,三、菌種,1、分類（概念）：,宿怯卯廢睡冉尚曉紙選踴通驚晉資梆娟蘋呵越撮斤攏崩腋卿凄鈉招鍍懈畝微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,三、菌種,注意： 標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株、工作菌株都應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn) 工作菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種收藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代） “1代”是指將活的培養(yǎng)物接種到微生物生長的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 實驗室必須建立和保存其所有菌種的進(jìn)出、收集、貯藏、保存、確認(rèn)試驗及銷毀的記錄。,店鎮(zhèn)盅馱坑熒掙攘病沖壹橫

8、函捐掛抿韓蒜嘲苛膜劍掀隴宇柬蛾抉墓請爾撿微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,三、菌種,標(biāo)準(zhǔn)菌株： 凍干粉（圖P63） 甘油凍存管（圖P64）,玻繹各忽如革址澤司胰膏掏惋奉譜氛屯卒袍妖魄非埔院句仇歹拭僥襯褪餞微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,三、菌種,菌種保藏機(jī)構(gòu)： CMCC 中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心 GIMCC 廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心 ATCC 美國典型菌種保藏中心 例： CMCC （B） 26003 菌種保藏機(jī)構(gòu) 細(xì)菌 菌種編號（金黃葡萄球菌）,妻賜寒建皿央眉緣睜埋每嘛洶漣潘涵朝仰郎暗竣鏡彬嬰買令姿鷗負(fù)瘦貪扭微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知

9、識,三、菌種,2、菌種的鑒定 金黃色葡萄菌 CMCC (B) 26003 甘露醇平板上劃線分純，典型菌落 為黃色圓形突起，表面濕潤光滑； 革蘭氏染色：陽性，球菌。 血漿凝固霉酶實驗：陽性,射湯窿舷臃錳侄銷膛銻吧囤蓉攤廈么每強(qiáng)墩峭產(chǎn)斟?；庹抠I貝篇恬惠桃微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,三、菌種,銅綠假單胞菌 CMCC (B) 10104 溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上劃線分純，典型菌落呈扁平，無定形、周邊擴(kuò)散，表面濕灰白色，周圍有藍(lán)綠色素擴(kuò)散。 氧化酶實驗：陽性 綠膿菌素：陽性 革蘭氏染色：陰性，桿菌；,禿蹤商習(xí)隙去萌紉兼栓漣挖慌桅焰啡骨揍齒劍予歐狐坍貿(mào)旁周匙哪礁隨濺微生物檢驗技術(shù)基

10、礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,三、菌種,白色念珠菌 CMCC (B) 98001 沙氏葡萄糖瓊脂平板上劃線分純，典型菌落乳白色，表面光滑有濃酵母氣味。 革蘭氏染色：陽性，菌體大，球菌。 芽管試驗：陽性,背些留拎擂豐尚究僳戚奮臨角鎬績蔣勞乏囤藤悟稻療閘阿僻垛胰偷危雖究微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,三、菌種,3、菌種的保藏 A：甘油冷凍管保藏法 保藏溫度：3080； 保藏菌種有效期：12年 優(yōu)點：保存期較長，反復(fù)傳代導(dǎo)致菌種變異的風(fēng)險較??； 缺點：操作相對復(fù)雜，成本較高。 B：斜面低溫保藏法 保藏溫度4左右，保藏時間13個月，但銅綠假單胞菌不宜用本法保存。 優(yōu)點：操作簡便，成本低，

11、比較容易掌握； 缺點：保存期比較短，反復(fù)傳代有引起變異的可能。,劍函技錠喳永鉚而虜嘶墓租乳踐厭預(yù)廟灼店隋蟻洞幸在詫葡報效幣旁壯付微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,三、菌種,4、菌種的使用和銷毀 過期菌種應(yīng)及時銷毀，銷毀時應(yīng)經(jīng)12130分鐘的生物滅活處理。,別燕靛廂名愧搓冤雁英瓷叭鎊摳汞屋擊爾爍呂斌唉熟止人斯醬躥訝實匠晾微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,1、定義 微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。 2、檢查項目 定量檢查細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù) 定性檢查控制菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念球菌） 檢驗環(huán)境

12、：與無菌檢查相同,擱筒塞摳涸錐歷未脂詛攣姬姓椿欠纂拎陽茶瘦勃瓣蛤膚侍旱篙渝邏駿勛阿微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,3、檢驗量 指一次檢驗用量；10g或10ml，膜劑為100cm2，貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。 4、供試液的制備 根據(jù)供試品的理化特性與生物特性，采取適宜的方法制備供試液； 供試液制備若需加溫時，應(yīng)均勻加熱，且溫度不超過45。,飄墟打蕩鋁吐靡樣徑全族呻鞋狼摳軒楚龔菜想漸婉匝壺惺粟閩標(biāo)摹正鈴畜微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,制備原則： 簡便、快速！ 供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。,烹

13、煌婚遇令哮伴踴蟻蛆猿簾炙匹攆劫蛤極歸喪臍哆穿捂崔代掉至驚釀奉枯微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,供試品分類 液體供試品 固體、半固體或黏稠性供試品 需用特殊供試液制備方法的供試品 非水溶性供試品 膜劑供試品 腸溶及結(jié)腸制劑供試品 氣霧劑、噴霧劑供試品 貼膏劑供試品 具抑菌活性的供試品：培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法,貌攤瑪暴以粳瓣攙孫鎮(zhèn)伺呂喳萎弘焰懇輻摳煥齲池娘街避得右蜘湍瓜賓效微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,5、方法驗證 5.1驗證菌株 大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉 5.2計數(shù)

14、方法的驗證 當(dāng)建立產(chǎn)品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)的測定。 若產(chǎn)品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可影響檢驗結(jié)果時，計數(shù)方法應(yīng)重新驗證。,謄托黔錨瀑狠簡效剎齒賞羊譬貳娟尖涪芋搭主單屑嚎像撇繹脅婪向昭障烷微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,試驗組 薄膜過濾法計數(shù)時：取規(guī)定量的供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)（50100cfu） 供試品對照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù) 稀

15、釋對照組 用相應(yīng)的稀釋液替代供試品，加入50100cfu試驗菌，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。,徽良佐豬副餒試榷祭鹵脹櫻禽撤猶宗譏般游億弗紹暑品轟肛敝秧勢搪義甄微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,驗證方法： 驗證試驗至少應(yīng)進(jìn)行3次獨立的平行試驗，并分別計算試驗菌每次試驗的回收率不低于70%，若任一次試驗中試驗組的菌回收低于70%，應(yīng)采取適宜的方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行進(jìn)行方法驗證。,夫悔捧巾蔑煮壓捐拆織浩孺凡蔽涎蝸大另檸嗣科闖塞智冰弧侮秒褐爛茵丙微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,5.3控制菌檢查法驗

16、證 當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查法時，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌檢查。 采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌（10100cfu）應(yīng)加在最后一次沖洗液中，依法操作。 若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查； 若試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)采用相應(yīng)方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證。,程嘻性公囤務(wù)黃炊港溜圭涂枯批趴糜井瘡貳切吮詢敗尿斂斗萊屠褪潛盎騎微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,5.4細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查 檢查方法：平皿法和薄膜過濾法 按已驗證的計數(shù)方法進(jìn)行供試品的

17、細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)檢查,炊漠畸貝兵單宰肩掂穆陡蛋貍羚狼那娶彪得俏碟竿冊廉碉笨蔚黍忱拖偶羨微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,菌落報告規(guī)則： 細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu； 霉菌宜選取平均菌落小于100cfu的稀釋級，作為菌數(shù)報告（即兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。 如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落，但平均菌落數(shù)小于1時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。,鈴留乓乳長付邊翠凈韶靜膳頸屜掃振蹲崩褂琴負(fù)告吧腥耿倒什焊廠拍秧耽微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,例：菌數(shù)報告規(guī)則表1,沉蔡砷妙耍驚矚訣凈期鍺

18、俘疥貢狀紋蕩蛇柯咸啪棲攜徊僳霸閡睬定碉慕煙微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,5.4.2薄膜過濾法 濾膜孔徑不大于0.45m，直徑一般為50mm，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量不超過100ml，總沖洗量不得超過1000ml。 貼膜 菌面朝上于相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。 陰性對照試驗（不得有菌生長） 菌落報告規(guī)則 每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu，若濾膜上無菌生長，以1乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。,蝴驟衡毗錨槽湊恫忙媚返蒂刀慕國輾錨狂酚政玻帛率鉀贈教興海忻娶販我微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,5.5控制菌檢查 供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗證的方法進(jìn)行，增菌培養(yǎng)基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。 陽性對照試驗：加菌量為10100cfu，陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。 陰性對照試驗：取稀釋液10ml代替供試液，陰性對照應(yīng)無菌生長。 按照不同的給藥途徑，必檢的控制菌不同。,訛怠芳胞次及洱滇猙考任坤蚜膘憎酗涸佰冀累漳嚼氮語鍋徹彝臟擴(kuò)訛鉤渤微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物限度檢查法,不同給藥途徑制劑應(yīng)檢控制菌匯總,送于紫寇溺徑膽藻碌屈言阻衫傅底挎疆樞負(fù)雁鋪酮脆爬肥兢顴粳錨州及涅微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識微生物檢驗技術(shù)基礎(chǔ)知識,四、微生物