1、.,RT-PCR常見問題分析,.,一 、 RT-PCR反應(yīng)原理與方法 RT-PCR是將RNA反轉(zhuǎn)錄（RT）和以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的DNA片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因的表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因cDNA序列等研究。,.,1 RT-PCR反應(yīng)步驟： 第一，RNA提純； 第二，RT逆轉(zhuǎn)錄； 第三，PCR聚合酶反應(yīng),.,.,2 RT-PCR方法 2.1 一步法：即反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增在同一管內(nèi)完成， 有助于減少污染，靈敏度更高 2.

2、2 兩步法：即反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增分兩步進(jìn)行，首先從RNA模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，得到的cDNA再進(jìn)行一次或多次不同的PCR反應(yīng)。,.,2.3 一步法與兩步法區(qū)別： 一步法RTPCR反應(yīng)更加快速、靈敏，操作簡便，污染率低，RNA二級結(jié)構(gòu)減少，并且因為聚合酶有校正活性，從而降低了PCR反應(yīng)的錯配率。而在兩步法中，兩步法在選擇聚合酶和引物時具有更大的靈活性，同時可由一次反轉(zhuǎn)錄樣品獲得多個遺傳信息，并且由于在第一步中將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，從而更易于保存。另外，兩步法的整個過程比一步法更節(jié)省費用。,.,3 提高RT-PCR反應(yīng)的靈敏度與特異性： 3.1 首先應(yīng)確定模板RNA完整性好，無DNA污染。

3、3.2 RNA模板中不應(yīng)含有擴(kuò)增反應(yīng)抑制劑。 3.3 為了防止模板降解，可以在反應(yīng)體系中加入RNase抑制劑RNasin。 3.4 使用適量的模板RNA，模板量太多會降低特異性，太少會導(dǎo)致擴(kuò)增不出條帶或條帶太弱。 3.5 如果由于模板有二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致擴(kuò)增效果不好，可提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度。 3.6 設(shè)計引物時，避免在引物3端含有互補(bǔ)序列，避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列。,.,RT-PCR常見問題,.,問題一：RT-PCR僅有少量或沒有產(chǎn)物,1.RNA被降解,分離無污染或高質(zhì)量的RNA；提取RNA材料要盡量新鮮，防止RNA降解。 RNA提取后，應(yīng)儲存在100甲酰胺中，如果使用RNase抑制劑，加熱時

4、45；pH8.0，否則抑制劑會釋放所有結(jié)合的RNase。而且，在0.8mM DTT時加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。,物,對策,.,2. RNA中包含 逆轉(zhuǎn)錄抑制劑,過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70%(v/v)乙醇對RNA沉淀進(jìn)行清洗?？梢约尤胩窃?0.25g到0.4g/l)以幫助小量樣品RNA的恢復(fù);逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，亞精胺，甲酰胺和胍鹽;將對照RNA同樣品混合，同對照RNA反應(yīng)比較產(chǎn)量以檢驗抑制劑;,對策,.,3.用于合成 cDNA第一鏈 合成的引物 的退火不充分,1.確定退火溫度適合實驗中所用的引物。對于隨機(jī)六聚體，建議在反應(yīng)溫度保溫之前先在2

5、5保溫10分鐘。 2.對于基因特異性引物（GSP），可以試以下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨即六聚體確定GSP是反義序列。,對策,.,4.起始RNA量 不夠 5. 多糖同RNA 共沉淀,增加RNA量;對于60時使用oligo(dT)引物，選擇一個在反應(yīng)溫度可以退火的GSP;對于1kb的RT- PCR產(chǎn)物，保持反應(yīng)溫度65。不要在高于37時使用M-MLV;如果不需要全長cDNA，在第一鏈反應(yīng)中使用隨機(jī)引物;,對策,.,7.引物或模板 對殘余的RNA 模板敏感 8.靶序列在分 析的組織中不 表達(dá) 9.PCR沒有起 作用,在PCR前用RNaseH處理。 嘗試其他靶序列或組織 對兩步法RT-

6、PCR，不要在PCR步驟中使用超過1/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物;,對策,對策,對策,.,10.PCR引物設(shè) 計較差,避免在引物3端含有互補(bǔ)序列。避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列。設(shè)計Tm類似的引物。最佳引物濃度介于0.1M到0.5M之間。為了精確確定引物濃度，在260nm測量光密度，然后使用光吸收值和消光系數(shù)計算濃度。,對策,.,11.富含GC的 模板,于GC含量50%的模板，使用PCRx Enhancer Solution。,對策,.,12. 鎂離子濃度 太低,從1mM到3mM，間隔0.5mM進(jìn)行一系列反應(yīng)，確定對于每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。注意：對實時定量PCR，使用3mM到5mM的鎂離子

7、濃度。,對策,.,13.退火溫度 太高,使用公式估算Tm，把退火溫度設(shè)定為低于Tm 5。因為這些公式只是估算Tm值，所有真正的退火溫度實際會高些或低些。,對策,.,問題二：產(chǎn)生非特異性條帶,.,1.引物和模版 的非特異性 退火,1.避免引物3端含有2個到3個dG或dC 2.在第一鏈合成中使用基因特異性引物，而不是隨即引物或oligo(dT)。 3.在開始幾個循環(huán)使用較高的退火溫度，然后使用較低的退火溫度。 4.使用熱啟動Taq DNA酶進(jìn)行PCR，提高反應(yīng)的特異性。,對策,.,2.基因特異性引 物設(shè)計較差 3.RNA中有基 因組DNA的污染,遵循用于擴(kuò)增引物設(shè)計的同樣原則 1.使用擴(kuò)增級DNa

8、se 1處理RNA。 2.設(shè)置沒有逆轉(zhuǎn)錄的對照反應(yīng)檢測DNA污染,對策,對策,.,4.形成引物二 聚體 5.鎂離子濃度 太高 6.沾染外源 DNA,設(shè)計在3端沒有互補(bǔ)序列的引物。 對于每一個模板和引物組化優(yōu)化鎂離子濃度。 使用抗氣霧劑和UDG酶。,對策,對策,對策,.,問題三：產(chǎn)生彌散條帶,.,原因,對策,.,問題四：靈敏度低，須在比預(yù)期更高的循環(huán)中檢出產(chǎn)物?,.,1、 初始模板RNA不充分：增加模板RNA的濃度。 2、 RNA被損害和降解：必要的話更換RNA。 3、 RNAse污染：維持無菌條件;加入RNase抑制劑。 4、 無效的cDNA：通過增加70%乙醇清洗的次數(shù)來去除制備RNA過程中

9、的抑制劑。 5、 無效的PCR擴(kuò)增：注意：反轉(zhuǎn)錄的抑制劑包括SDS、EDTA、胍鹽、甲酰胺、磷酸鈉和亞精胺。調(diào)整cDNA合成溫度或引物設(shè)計。,.,問題五：信號高于預(yù)期，在低于預(yù)期的循環(huán)中即可檢出產(chǎn)物?,1、 反應(yīng)中加的樣品太多：降低模板的濃度。 2、 模板或PCR殘余污染：隔離污染來源，更換試劑，使用專用的精致移液器。在無DNA區(qū)域準(zhǔn)備反應(yīng)，使用抗氣溶膠的吸頭。,.,問題六：電泳后出現(xiàn)意外的條帶 RNA?,原因,對策,.,問題七:產(chǎn)生大分子量的彌散條帶,大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的。對于長片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）,.,問題八： 在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果,通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。 有可能是引物二聚體的