1、急性毒性試驗設(shè)計,1,一、急性毒性,急性毒性指人或動物一次或24 h之內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后，在短期內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括致死效應(yīng)。,2,一次：指瞬間給實驗動物染毒，如經(jīng)口、經(jīng)靜脈注射染毒。 24 h之內(nèi)多次：指外源化學(xué)物毒性過低，需給予動物較大劑量。,3,急性毒性效應(yīng)出現(xiàn)的快慢和毒性反應(yīng)的強(qiáng)度與外源化學(xué)物的性質(zhì)和染毒劑量的大小有關(guān)。 如：丙烯腈，過氧化二碳酸二環(huán)己酯,4,丙烯腈經(jīng)口急性毒性試驗設(shè)計,5,實驗?zāi)康?評價丙烯腈的毒性作用，求出半數(shù)致死量LD50，并根據(jù)LD50進(jìn)行急性毒性分級， 掌握實驗動物隨機(jī)分組的方法和經(jīng)口灌胃的技術(shù)。 觀察丙烯腈急性中毒癥狀；為后續(xù)試驗提供依據(jù)；為毒理學(xué)機(jī)

2、制研究提供線索。,6,器材與試劑,1、實驗動物 ICR小鼠（健康成年小鼠） 2、實驗器材 灌胃針、注射器、吸管、容量瓶、燒杯、滴管、電子天平、動物體重秤、外科剪刀、鑷子 3、實驗試劑 丙烯腈、苦味酸酒精飽和液、伊紅染液,7,實驗方法,1、實驗動物的選擇 2、劑量設(shè)計及隨機(jī)化分組 3、受試物的配制 4、染毒途徑的選擇 5、毒性反應(yīng)的觀察與LD50的計算 6、急性毒性的評價,8,1、物種和品系 對外源化學(xué)物毒性反應(yīng)與人近似易于飼養(yǎng)管理 方便實驗 操作易于獲得 繁殖生育力強(qiáng) 數(shù)量較大能夠保障 品系純化，價格低廉。,一、 實驗動物選擇,9,2、 實驗動物的年齡與體重,動 物 大鼠 小鼠 豚鼠 兔 犬

3、貓 成年年齡（周） 3 2 2 34 34 34 體重（克） 150 15 250 1.5kg 715kg 1kg 壽命（年） 23 23 68 49 1520 1012,10,動物數(shù)量：動物6組，1-5組為實驗組，6組為蒸餾水對照組 性別：雌雄各半 年齡：成年動物,生理與健康狀況：未產(chǎn)未孕者、健康動物 實驗動物的預(yù)檢 實驗動物的給藥前禁食處理。,3、實驗動物的一般要求,11,健康動物標(biāo)志 發(fā)育正常、體態(tài)豐滿、外觀無畸形； 被毛濃密、貼順有光澤、不蓬亂； 胸闊寬闊、脊柱不弓不彎； 眼睛明亮； 表皮無潰瘍、無結(jié)痂（注意尾巴）； 各天然孔干凈、無分泌物； 行動靈活、反應(yīng)敏捷。,12,實驗動物的標(biāo)記

4、,染色法 編號方法：小鼠頭部為1號，順時針編號，用苦味酸編個位數(shù)，用伊紅編十位數(shù)。,13,14,染色法,優(yōu)點： 簡單方便，不痛苦，無損傷。 缺點： 時間較長時，染色劑易褪色； 標(biāo)記容易模糊不清。,15,劑量選擇及分組,劑量選擇 廣泛查閱文獻(xiàn)資料，估計毒性中值 預(yù)試，求出待測化學(xué)物0 %100 %或 10 %90 %的大致致死劑量范圍 設(shè)計正式試驗的劑量和分組,16,預(yù)實驗：,總的原則是先用少量動物，以較大的劑量間距染毒，求出粗略的致死劑量范圍，即確定受試動物全部致死的最小劑量（b）和全部不致死的最大劑量（a），即求出待測化學(xué)物0 %100 %的大致致死劑量范圍，然后在這個劑量范圍內(nèi)按幾何級數(shù)的

5、間距設(shè)計57個劑量組，組間劑量呈等比級數(shù)（r），其比值為1.21.5。進(jìn)行正式實驗。,17,通過預(yù)試，找出受試化學(xué)物引起動物死亡的大致劑量范圍，以此為依據(jù)設(shè)計正式試驗的劑量和分組。 按下式設(shè)計劑量組：,式中：r相鄰兩組劑量的比值，一般為1.21.5， b最低全致死劑量量， a最高不致死劑量， n設(shè)計的組數(shù)。 分組恰當(dāng)與否也是確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確的條件之一。因為組數(shù)過多，需要消耗較多的動物，還可能出現(xiàn)較大劑量組動物死亡率低于較小劑量組；組數(shù)過少，不能較精確求出LD50。,18,根據(jù)公比(r)計算各組劑量 各組劑量分別為 第一組：a 第二組：a r 第三組：a r2 第四組：a r3 第五組：a r4

6、 第六組：a r5,19,隨機(jī)化分組,將實驗動物編號，從隨機(jī)數(shù)字表上任意橫行或縱行的任意數(shù)字開始，順序取下數(shù)字，標(biāo)于每個動物號下，然后用計劃組數(shù)去除隨機(jī)數(shù)字，所得余數(shù)即為所屬組別。,20,以20只動物的完全隨機(jī)分配為例,21,完全隨機(jī)分配后各組所屬動物號,22,20只動物完全隨機(jī)分配的結(jié)果,23,受試物的配制方法,（1）受試化學(xué)物的量?。?固體受試物用稱量法，液體受試物用稱量法或吸量法。 稱量法：取一定量的受試物放入已知重量的容器內(nèi)，稱重，定容，計算濃度mg/ml，備用。 吸量法：依設(shè)計劑量計算出應(yīng)吸取液態(tài)受試物的容積，加入容量瓶中，用溶劑加至刻度。,24,吸量法，計算公式為：X 式中： X應(yīng)

7、吸取受試物的容積； A設(shè)計要求的受試物濃度（ mg/ml ）； V容量瓶容積（ml）； d受試化學(xué)物比重；,25,受試物的配制方法,（2）受試化學(xué)物的稀釋 等濃度稀釋法： 等容量稀釋法：,26,等濃度稀釋法,將受試物配制成一種濃度，不同劑量組實驗動物單位體重所給受試物的體積不同，劑量越高，所用的體積越大；劑量越低，所用的體積越小。比如某受試物的試驗劑量分別為100、200、400和800mg/kg，受試物配制成10 mg/ml，每組動物每10g體重分別給與0.1、0.2、0.4和0.8 ml。,27,等容量稀釋法,將受試物配制成不同濃度，不同劑量組實驗動物單位體重所給受試物的體積相同，劑量越大

8、，受試化學(xué)物配制的濃度越高。上例中，若實驗動物按0.2ml/10g b.w容量灌胃,則應(yīng)配制成4個不同濃度,即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml。,28,染毒途徑的選擇,經(jīng)消化道染毒：經(jīng)口灌胃法 采用專用小鼠灌胃針。 左手抓住動物雙耳后至背部的皮膚，將動物固定成垂直體位，腹部面向操作。 右手持注射器，將針頭由動物口腔側(cè)插入，避牙齒，沿咽后壁緩緩滑人食管。若遇阻力，可輕輕上下滑動探索，一旦感覺阻力消失，即深人至胃部。 如遇動物掙扎，應(yīng)停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，千萬不能強(qiáng)行插入，以免穿破食，甚至誤入氣管，導(dǎo)致動物 立即死亡。,29,觀察指標(biāo),中毒癥狀：確定靶器官 行動：不安定、

9、多動、發(fā)聲； 神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：舉尾、振顫、痙攣、運動失調(diào)、姿態(tài)異常； 自主神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)：眼球突出、流涎、流淚、排尿、下瀉、豎毛、皮膚變色、呼吸。 死亡和死亡時間 病理學(xué)檢查及其他指標(biāo),30,LD50的計算（改良寇氏法）,當(dāng)急性毒性試驗的最大劑量死亡率為100%，最小劑量的死亡率為0%；各組動物數(shù)相等；各劑量組的組距等比或劑量對數(shù)等差時，用下述基本公式計算LD50：,31,當(dāng)不含0%和100%死亡率時，用下式計算LD50：,Xm最大劑量對數(shù) P各劑量組死亡率 Pm最高死亡率 q各組劑量存活率，q=1-p,以上各式中：i組距，即相鄰兩組劑量對數(shù)劑量之差,Pn最低死亡率 p各劑量組死亡率之和 n各組動物數(shù),32,LD50的局限性,消耗動物量大 獲得的信息有限 動物死亡和觀察的癥狀不足以反應(yīng)生理學(xué)、血液學(xué)和其它化驗檢查所提供的毒性信息 有許多因素影響LD50值的測定，實際上測得的LD50是近似值,33,急性毒性