1、1,發(fā)酵過程優(yōu)化與控制技術(shù)研究,堵國成 江南大學(xué) gcdu,2,生物質(zhì)原料,化學(xué)品 精細(xì)化學(xué)品 大宗化學(xué)品 食品添加劑 生物塑料 溶劑 酚類 粘合劑 脂肪酸 碳黑、顏料 燃料、香料、墨水 洗滌劑,生物能源 生物酒精 生物柴油 甲醇 氫氣 沼氣,工業(yè)生物技術(shù)主要部分-發(fā)酵工程,3,獲得應(yīng)用價值的微生物,反應(yīng)器及過程放大,發(fā)酵過程優(yōu)化和控制,發(fā)酵工程研究,發(fā)酵產(chǎn)物分離提取,4,發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義,微生物能夠積累最大目的產(chǎn)物 (產(chǎn)量)的條件是什么？,高產(chǎn)量 便于產(chǎn)品分離提取,關(guān)鍵問題1,工程意義1,相關(guān)研究：微生物生理、遺傳特性和營養(yǎng)、環(huán)境因素,5,底物最多被微生物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物 (轉(zhuǎn)化率)的

2、條件是什么？,糧食原料為底物 高轉(zhuǎn)化率 降低原料成本,關(guān)鍵問題2,工程意義2,相關(guān)研究：微生物代謝途徑和過程條件,發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義,6,微生物最快速度發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物的條件是什么？,分批操作為主 高生產(chǎn)強(qiáng)度 縮短生產(chǎn)周期,工程意義3,關(guān)鍵問題3,相關(guān)：微生物反應(yīng)動力學(xué)和系統(tǒng)優(yōu)化,發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義,7,條件確定,過程優(yōu)化,初始條件,過程分析,過程強(qiáng)化,發(fā)酵優(yōu)化的研究思想：發(fā)酵是一個過程,8,基于細(xì)胞表觀特性進(jìn)行優(yōu)化,基于細(xì)胞內(nèi)部分析進(jìn)行優(yōu)化,高產(chǎn)量,高底物轉(zhuǎn)化率,高生產(chǎn)強(qiáng)度,優(yōu)化策略,在理論和技術(shù)上有突破，在工業(yè)生產(chǎn)中能廣泛應(yīng)用 顯著提高發(fā)酵過程的經(jīng)濟(jì)性和科學(xué)性,研究方法

3、,9,1 基于微生物反應(yīng)原理的培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(shù),優(yōu)化微生物生長的物理和化學(xué)環(huán)境 保證微生物生長處于最適條件,基本思想,奠定基礎(chǔ),基于底物運(yùn)輸、生化反應(yīng)、產(chǎn)物排出,確定不同環(huán)境條件對微生物生長和代謝產(chǎn)物分布的影響,Prod. Distribution,發(fā)酵優(yōu)化技術(shù),10,培養(yǎng)基組成的優(yōu)化技術(shù) 發(fā)酵環(huán)境條件的優(yōu)化技術(shù),確定培養(yǎng)基組分的最小用量，避免底物的過量或不足 減少副產(chǎn)物的形成，使底物轉(zhuǎn)化率明顯提高 對關(guān)鍵物質(zhì)的濃度及其供給方式進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量明顯提高 分析不同環(huán)境條件下微生物的生理學(xué),目的,內(nèi)容,11,2 基于微生物代謝特性的分階段培養(yǎng)技術(shù),研究思想,發(fā)酵優(yōu)化技術(shù),12,3 基于反應(yīng)

4、動力學(xué)和人工智能的優(yōu)化和控制技術(shù),研究思想,建立動力學(xué)模型，求解參數(shù)并評價其適用性,對發(fā)酵進(jìn)程和產(chǎn)量指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測,以數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)的優(yōu)化,優(yōu)化發(fā)酵過程,發(fā)酵優(yōu)化技術(shù),13,以生理模型為基礎(chǔ)的優(yōu)化,采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、專家系統(tǒng)、模糊邏輯控制技術(shù),對發(fā)酵過程進(jìn)行在線狀態(tài)預(yù)測和模式識別,自適應(yīng)最優(yōu)化控制系統(tǒng)的開發(fā)、計算機(jī)模擬和實(shí)際應(yīng)用,14,4 基于代謝通量分析的過程優(yōu)化技術(shù),研究思想,發(fā)酵優(yōu)化技術(shù),15,分析不同發(fā)酵產(chǎn)品合成途徑中主要代謝節(jié)點(diǎn)的性質(zhì)，結(jié)合發(fā)酵過程中胞內(nèi)能量代謝情況，提出一系列發(fā)酵優(yōu)化策略。,目的,16,長期脅迫可遺傳性的應(yīng)答（遺傳變異） 短期脅迫不可遺傳性的應(yīng)答（生理性的),Pyru

5、vate,NAD+,NADH,ADP,ATP,ethanol,Anaerobic,Aerobic,Mitochondrion,ATP,環(huán)境壓力或脅迫 饑餓、高溫、高壓、機(jī)械剪切、冷凍、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高滲透壓（高鹽）、活性氧、有毒化學(xué)物質(zhì)等,細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的臨時改變，酶原的激活以及代謝途徑的臨時調(diào)整等,5 基于環(huán)境脅迫條件下微生物生理應(yīng)答的過程優(yōu)化技術(shù),發(fā)酵優(yōu)化技術(shù),17,研究一些重要的工業(yè)微生物的抗脅迫因子及其抗脅迫機(jī)制，考察環(huán)境脅迫條件下特定微生物蛋白轉(zhuǎn)錄和代謝途徑變化，采用不同環(huán)境脅迫手段或措施對微生物的生長或代謝進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)微生物生長或大量合成目的產(chǎn)物。,學(xué)術(shù)思想,18,學(xué)

6、術(shù)思想,6 基于微生物代謝的輔因子調(diào)控的過程優(yōu)化技術(shù),研究輔因子形式及其濃度在物質(zhì)代謝和信號傳遞途徑中控制代謝流方向和流量分配的作用機(jī)制、物質(zhì)流和輔因子流的變化規(guī)律，對微生物的生長或代謝進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)微生物合成目的產(chǎn)物的代謝流的最大化和快速化。,發(fā)酵優(yōu)化技術(shù),19,發(fā)酵過程優(yōu)化與控制技術(shù)研究舉例,20,舉例1：丙酮酸發(fā)酵,Glucose,Pyruvate,Alanine,Acetaldehyde,Ethanol,Citrate,OAA,-KG,AcCoA,Pyruvate,OAA,B1： 硫胺素 NA： 煙酸 Bio：生物素 B6： 吡哆醛,光滑球擬酵母中丙酮酸代謝途徑,如何得到丙酮酸高產(chǎn)量發(fā)

7、酵？-菌株選育和培養(yǎng)條件優(yōu)化,選育自身不能合成維生素的酵母(維生素缺陷型) 控制培養(yǎng)基中維生素濃度,21,動力學(xué)分析,如何提高丙酮酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度？-分階段溶氧控制,22,高產(chǎn)量(89.4 g/L) 高產(chǎn)率(0.636 g/g) 高生產(chǎn)強(qiáng)度(1.95 g/(Lh),確定分階段供氧模式:發(fā)酵0-16 h控制kLa為450 h-1，16 h后將kLa降低至200 h-1,碳平衡分析,前16 h較高溶氧有利于碳流合成細(xì)胞；,采用單一高或低供氧模式，不能同時達(dá)到高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強(qiáng)度！,16 h后耗氧速率恒定，碳流轉(zhuǎn)向合成丙酮酸,結(jié)果,如何提高丙酮酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度?-分階段溶氧控制,分階

8、段溶氧控制！如何分階段？,23,舉例2：維生素C發(fā)酵微生物的功能優(yōu)化與調(diào)控,我國是世界最大的維生素C生產(chǎn)國和出口國，2009年生產(chǎn)10萬噸左右，產(chǎn)值45億，占世界市場90,小菌(氧化葡萄糖桿菌G. oxydans ),大菌(巨大芽孢桿菌B. megaterium ),關(guān)鍵科學(xué)問題：維生素C發(fā)酵微生物的功能關(guān)系,L-山梨糖,2-酮基-L-古龍酸,現(xiàn)況：維生素C兩步發(fā)酵工藝 小菌單獨(dú)培養(yǎng)生長、產(chǎn)酸困難 大菌本身不產(chǎn)酸，促進(jìn)小菌生長和產(chǎn)酸,團(tuán)隊承擔(dān)的國家863重點(diǎn)項目和國家支撐項目,與南開大學(xué)功能基因組學(xué)中心、國內(nèi)最大Vc生產(chǎn)企業(yè)合作,實(shí)現(xiàn)組學(xué)技術(shù)解決發(fā)酵工業(yè)長期問題的典型,+,24,基因組測序步驟

9、,鳥槍法測序,提取基因組DNA,打斷基因組DNA,基因文庫構(gòu)建,大規(guī)模測序,羅氏GSFLX高通量基因組測序,銜接子連接,單鏈DNA與磁珠結(jié)合,油滴中PCR反應(yīng),序列拼接,測序反應(yīng),填補(bǔ)缺口,基因組注釋,代謝途徑分析,小菌測序,大菌測序,代謝途徑分析,代謝途徑分析,從代謝途徑角度解析兩菌關(guān)系,25,氧化葡萄糖酸桿菌中心代謝途徑分析,缺失編碼琥珀酸鹽脫氫酶的基因，檸檬酸循環(huán)不完全,無編碼磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，不能通過糖異生生產(chǎn)C6,G.oxydans基因組含編碼氧化戊糖磷酸途徑和D途徑的全部酶基因,缺失編碼磷酸果糖激酶的基因，糖酵解途徑不完全,26,蛋白質(zhì)組學(xué),小菌單獨(dú)發(fā)酵時胞內(nèi)蛋白表達(dá),大菌存

10、在時小菌胞內(nèi)蛋白表達(dá),功能蛋白確定，研究大菌影響小菌產(chǎn)酸的機(jī)制,K. Vulgar,B. megaterium,27,發(fā)酵優(yōu)化,提高糖酸轉(zhuǎn)化率 提高VC產(chǎn)量 提高生產(chǎn)強(qiáng)度,基因測序,功能蛋白,產(chǎn)物解析,3-磷酸甘油醛,丙酮酸,葡萄糖,TCA循環(huán),大菌特定的代謝途徑,Vc,目標(biāo)1：確定微生物之間的功能關(guān)系，提高效能,目標(biāo)2：構(gòu)建Vc一步發(fā)酵菌株，實(shí)現(xiàn)重大創(chuàng)新,舉例2：維生素C發(fā)酵微生物的功能優(yōu)化與調(diào)控,28,舉例3：透明質(zhì)酸(HA)發(fā)酵過程優(yōu)化與控制,透明質(zhì)酸三級結(jié)構(gòu),優(yōu)良理化性質(zhì)：粘彈性 高保濕性 生物相容性,食品添加劑,關(guān)節(jié)炎治療,化妝美容,高粘度和低溶氧傳遞速率是HA發(fā)酵過程的重要瓶頸,乳

11、酸對細(xì)胞生長和HA合成有著較強(qiáng)的抑制作用,細(xì)胞生長和HA合成之間存在對碳源和關(guān)鍵輔因子的競爭,HA發(fā)酵存在問題,29,透明質(zhì)酸發(fā)酵過程的混合與傳質(zhì)特性優(yōu)化研究,問題,高粘度和低溶氧傳遞速率是HA發(fā)酵過程的重要瓶頸,溶氧水平,表觀黏度,有效攪拌區(qū)域模型,有效攪拌區(qū)域控制模型的混合與傳質(zhì)動力學(xué)(Va=1）,剪切力對菌體形態(tài)影響,理想HA發(fā)酵模式：低剪切、高傳質(zhì)、高溶氧,溶氧水平,溶氧傳遞系數(shù),表觀粘度,攪拌轉(zhuǎn)速,30,降解透明質(zhì)酸提高發(fā)酵過程的混合及傳質(zhì)效率,問題,高粘度和低溶氧傳遞速率是HA發(fā)酵過程的重要瓶頸,氧化還原降解HA提高混合與傳質(zhì)效率,FT-IR分析結(jié)果,過氧化氫/抗壞血酸氧化還原降解

12、HA,氧化還原降解HA沒有破壞其基本結(jié)構(gòu)單元,HA氧化還原降解對HA發(fā)酵的影響,添加H2O2/抗壞血酸對流體力學(xué)影響,添加H2O2,Vc,31,Transglutaminase (TGase, Protein glutamine -glutamyltransferase, EC 2.3.2.13 ),舉例4： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization,通過 N-(-谷酰胺) 賴氨酸鍵交聯(lián)蛋白質(zhì) 催化蛋白質(zhì)中Gln的-羧酰胺基與伯胺間發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng) 蛋白質(zhì)脫酰胺作用 通過形成脂鍵共價連接蛋白質(zhì)和脂肪酸的

13、長鏈-羥基 目前唯一商業(yè)化并大規(guī)模生產(chǎn)的可在蛋白質(zhì)間形成共價交聯(lián)的酶制劑,32,Activation Mechanism of Transglutaminase,舉例4： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization,33,根據(jù)該TGase活化模型：在發(fā)酵過程的產(chǎn)酶初期: *添加1000 U/mL的胰蛋白酶，使發(fā)酵過程酶活提高31.2 % *添加10 mg/mL的CTAB，使發(fā)酵過程酶活提高21.8 %,舉例4： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization,34,Two-stage pH and agitation speed control strategy for TGase fermentation.,DO1,DO2,DO2,DO1,pH1,pH2,舉