1、基 因 工 程,生 物 技 術(shù) 專 業(yè) 課 程,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程的基本概念,基因工程的基本原理,基因工程所需的基本條件,基因工程的操作過程,目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建,大腸桿菌基因工程,酵母基因工程,哺乳動物基因工程,高等植物基因工程,D 高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移,8 哺乳動物基因工程,C 高等哺乳動物的載體系統(tǒng),B 高等哺乳動物的受體系統(tǒng),A 高等哺乳動物基因工程的基本概念,E 利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白,A 高等哺乳動物基因工程的基本概念,8 哺乳動物基因工程,高等哺乳動物基因工程,高等哺乳動物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù),高等哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù),轉(zhuǎn)基因動

2、物個體,動物工程細(xì)胞,哺乳動物遺傳性狀改良,藥物篩選研究評價模型,人體基因治療,蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn),藥物篩選研究評價模型,B 高等哺乳動物的受體系統(tǒng),8 哺乳動物基因工程,高等哺乳動物細(xì)胞的生長特性,高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件,高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記,常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞,高等哺乳動物細(xì)胞的生長特性,正常的哺乳類動物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征：,錨地依賴性：細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂,血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長因子才能生長,接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后，生長便受到抑制,形態(tài)依賴性：細(xì)胞稱扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),上述特征使得正常的哺乳動物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，

3、一般只能存活50代,且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細(xì)胞生長。有時，正常細(xì)胞,會改變某些特征而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀,態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時的細(xì)胞成為細(xì)胞系。,高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件,以高效表達(dá)外源基因為目標(biāo)的高等哺乳動物受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件,細(xì)胞系特征 喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大,遺傳穩(wěn)定性 外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存,合適的標(biāo)記 便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持,生長快且齊 分裂周期短，生長均一，便于控制,規(guī)模培養(yǎng),大多數(shù)正常的高等哺乳動物細(xì)胞并不能同時具備上述條件，癌細(xì)胞能,安全性能好 不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌,滿足上述前四項要求，

4、但在安全性能上有欠缺。,高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記,營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞,5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）,次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP）,次黃嘌呤核苷（HR）,GMP,AMP,尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）,胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）,胸腺嘧啶核苷（TR）,嘌呤核苷酸生物合成途徑,嘧啶核苷酸生物合成途徑,次黃嘌呤磷酸 核糖轉(zhuǎn)移酶,（HPRT）,（TK）,胸腺嘧啶 核苷激酶,氨基喋呤（AP）,氨基喋呤（AP）,從頭合成途徑,補救合成途徑,高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記,營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞,含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tk -）,不能在含有次黃嘌呤核

5、苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基,上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補,含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞,不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基,上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因hprt與之遺傳互補,（hprt -）,高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記,哺乳動物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記,遺傳標(biāo)記,編碼產(chǎn)物,篩選藥物,作用機(jī)理,APH- 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 G418 APH滅活G418,DHFR 二氫葉酸還原酶 氨甲喋呤 DHFR變體抗氨甲喋呤,HPH- 潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素B HPH滅活潮霉素B,TK- 胸腺嘧啶核

6、苷激酶 氨基喋呤 TK合成TMP,XGPRT- 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMP,ADA- 腺嘌呤核苷脫氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA滅活Xyl-A,常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞,迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn),的高等哺乳動物受體細(xì)胞主要還是中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO），其優(yōu),勢有如下幾個方面：,遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定,與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確,基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善,耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng),被美國FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞（GRAS）,C 高等哺乳動物的載體系統(tǒng),8 哺乳動物基因工程,人腺病毒DNA,猴空泡病毒DNA

7、（SV40）,人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人牛痘病毒DNA,人腺病毒DNA,腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個,成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒,腺病毒的生物學(xué)特性,有6個亞屬，其中常用來構(gòu)建載體的主要是C亞屬的2型（Ad2）和5型,（Ad5）病毒。,腺病毒感染人細(xì)胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，,絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。,|,人腺病毒DNA,腺病毒的基因組DNA,ITR,ITR,E1,E2,E3,E4,IVa2,VA,L1,L2,L3,L4,L5,腺病毒基因組DNA全長36 kb，其包裝上限為原基因組的105%， DNA

8、兩端各有,一個反向重復(fù)序列（ITR）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的,表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子， L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期,基因；IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。E3區(qū)缺失只會影響病毒顆粒,的成熟，不影響基因組的復(fù)制功能，因而在構(gòu)建載體時往往除去這個2.2 kb的片段，,使得載體的裝載量提高到4 kb以上。,人腺病毒DNA,基因重排低 外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個周期,腺病毒DNA載體的特點,安全性能好 不整合人的染色體DNA，不會導(dǎo)致惡性腫瘤,宿主范圍廣 對受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格,使用效果好 外源基因

9、在載體上容易高效表達(dá),猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、,VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNA,SV40的生物學(xué)特性,SV40可以與所有哺乳動物宿主細(xì)胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從,而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。,SV40感染猴細(xì)胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，,便發(fā)生非同源整合而致癌。,猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40的基因組DNA,t / T基因編碼病毒的小抗原和大,抗原與病毒的致癌作用密切相關(guān),SV40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期,狀態(tài)時，每個宿主細(xì)胞含有105個病

10、,毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效,表達(dá)外源蛋白,猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40 DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建,重組的SV40 DNA分子必須經(jīng)過,包裝后才具有感染能力，因此插入的,外源DNA片段不能太大。為了盡量提,高SV40的裝載量，必須刪除一些基因,片段，因此重組的SV40分子必須與野,生型病毒共感染受體細(xì)胞，才能形成,有感染力的重組病毒顆粒。,Apr,ori,viral gene,gpt,SV40 ori,pV2-GPT,pBR322,pBR322,SV40,pV2-GPT是一種SV40 DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其,中g(shù)pt為細(xì)菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基

11、因，用于篩選重組子。該,載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔b-珠蛋白.,猴多瘤病毒DNA（SV40）,利用SV40 DNA載體表達(dá)外源基因的程序,SV40 載體,病毒晚期基因啟動子,篩選標(biāo)記,ori,缺陷的SV40 輔助病毒,去除細(xì)菌序列,插入外源基因,重組分子,分離病毒DNA,轉(zhuǎn)化,篩選,增殖,感染,猴多瘤病毒DNA（SV40）,基因表達(dá)好 外源基因能高效表達(dá),SV40 DNA載體的特點,基因重排高 病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象,宿主范圍窄 只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞,裝載量較小,人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因,組為雙鏈

12、DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，獨立于染色體而自,人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性,主復(fù)制，每個宿主細(xì)胞最高可達(dá)500個拷貝,人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建,BKV - E.coli 穿梭載體,BKV ori,BKV gene,DRE,MMTP,Ap r,E.coli ori,SV40 P,Neo r,刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的,基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成,穿梭載體，它不能整合，同時也不能,形成成熟的病毒顆粒裂解受體細(xì)胞。,安裝細(xì)胞色素P450 dioxin介導(dǎo)的增強,子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動子MMTP，由其帶動外源基因的表達(dá)。,SV40來源的啟動子控制

13、Neor 標(biāo)記基因，以G418篩選重組子。,以此載體在人細(xì)胞系中表達(dá)b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。,人牛痘病毒DNA,人牛痘病毒是一個大型DNA病毒，基因組長185 kb，能在宿主細(xì),胞質(zhì)中自主復(fù)制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建,人牛痘病毒的生物學(xué)特性,出的重組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的,病毒啟動子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外,DNA重組很困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。,人牛痘病毒DNA,目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒,其基因組上插入了一個可表達(dá)的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在,

14、人牛痘病毒DNA表達(dá)載體的構(gòu)建,外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，先以上述的重組病毒感染細(xì)胞，使其大,量表達(dá)T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7啟動子的細(xì)菌型重,組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物受體細(xì)胞，此時外源基因整合在受體細(xì)胞染色體,DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達(dá)出重組蛋白。,人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達(dá)的。,人牛痘病毒DNA,利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序,牛痘病毒 啟動子,T7 RNA 聚合酶基因,T7啟動子,外源基因,細(xì)菌重組質(zhì)粒,感染,轉(zhuǎn)化,培養(yǎng),收集,D 高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移,8 哺乳動物基因工程,哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法,哺乳動物細(xì)胞

15、的物理轉(zhuǎn)化法,利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細(xì)胞的主要優(yōu)點是外源基因表達(dá),盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕,了負(fù)擔(dān)。但外源基因表達(dá)盒進(jìn)入受體細(xì)胞后，往往以多拷貝的形式隨,機(jī)整合在染色體DNA上，導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活、外源基因不表達(dá)。,哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此,時DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；,此時細(xì)胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便進(jìn)入受,體細(xì)胞；,磷酸鈣共沉淀法,將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37保溫4-16小時,棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。,

16、如果在外源DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性DNA可以提高轉(zhuǎn)化,效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒DNA，可使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為,癌細(xì)胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。,哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解受體細(xì)胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的,樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時,電擊轉(zhuǎn)化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細(xì)胞類型，如生長在,懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。,電擊轉(zhuǎn)化法,DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。,哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面,活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。,合，D

17、NA隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。,利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細(xì)胞和HeLa,脂質(zhì)體介導(dǎo)法,將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會與受體細(xì)胞膜融,細(xì)胞。,哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌,鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；,性原核內(nèi)。,上述程序多用于動物個體的轉(zhuǎn)基因過程，由于必須單細(xì)胞逐一操,顯微注射法,借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄,作，所以不太適用于基因的克隆和表達(dá)。,哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,血影細(xì)胞是指哺乳動物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán),境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細(xì)胞膜包裹

18、的細(xì)胞,同時，外源DNA也容易進(jìn)入。當(dāng)上述外界條件消失后，紅細(xì)胞膜又可,恢復(fù)原來的通透性。因此，可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細(xì)胞，然后再將,血影細(xì)胞介導(dǎo)法,核結(jié)構(gòu)。在溶血過程中，紅細(xì)胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的,血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入受,體細(xì)胞。,哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法,以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒,共轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。這種方法具有定向性好、實驗重復(fù)性佳、導(dǎo),入效率高等優(yōu)點，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍,有限，往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價值的家禽和牲畜細(xì)胞等。,E 利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白,8

19、哺乳動物基因工程,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIII,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理,基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊,方式。氨甲喋呤（MTX）是動物細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶,數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細(xì)胞中，dhfr基因均得以擴(kuò),增。這些抗性細(xì)胞正是通過增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶,通過強化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因,（DHFR）的特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多,的表達(dá)水平，從而抵消

20、氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū),哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的基因擴(kuò)增現(xiàn)象,域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時被擴(kuò)增。,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理,通過強化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因,DHFR-MTX高效表達(dá)系統(tǒng),外源基因,dhfr,轉(zhuǎn)染dhfr -細(xì)胞系,單克隆,培養(yǎng),轉(zhuǎn)移,0.05 mM MTX,培養(yǎng),單克隆,轉(zhuǎn)移,培養(yǎng),單克隆,轉(zhuǎn)移,5 mM MTX,0.25 mM MTX,培養(yǎng),單克隆,外源基因擴(kuò)增至100拷貝,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理,通過強化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因,GS-MSX高效表達(dá)系統(tǒng),谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亞砜

21、（MSX）對動物細(xì),胞的毒害作用。先將帶有GS編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì),中不必使用GS缺陷型的受體細(xì)胞，而且在正常的MSX濃度下就能篩,選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是GS-MSX系統(tǒng)比DHFR-,胞中，由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉(zhuǎn)染過程,MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理,通過強化基因轉(zhuǎn)錄高效表達(dá)外源基因,在載體上安裝病毒或細(xì)胞來源的強啟,mRNA前體,AAAAAAAAA,mRNA,動子以及有效的翻譯元件，也是使外源基,因高效表達(dá)的一種手段，如：,細(xì)胞巨化病毒CMV的啟動子,動物珠蛋白基因的內(nèi)含子,SV40的終止子和polyA化

22、信號序列,絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)型載體,上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因為mRNA前體的剪,切能促進(jìn)成熟mRNA向胞質(zhì)的運輸，有利,于翻譯。有的還含有各種信號肽序列。,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白,迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進(jìn)行臨床試驗，但,在哺乳動物工程細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：,b 干擾素 g 干擾素,凝血因子VIII 凝血因子IX,促紅細(xì)胞生成素（EPO） 生長因子（hGH）,白介素 2（IL-2） 乙型肝炎表面抗原,單克隆抗體 CD4受體,組織型纖溶酶原激活劑（tPA）,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體,大多數(shù)惡性淋巴

23、,Neor,鼠金屬硫蛋白啟動子,b 肌動蛋白啟動子,抗體輕鏈cDNA,b 肌動蛋白終止子,pL,dhfr,SV40啟動子,b 肌動蛋白啟動子,抗體重鏈cDNA,b 肌動蛋白終止子,pH,瘤細(xì)胞表面上都,有一種特異性的,糖蛋白campath,用人源化的小鼠,抗campath抗體,治療非霍金淋巴,細(xì)胞瘤患者，效,果良好。重組抗,體采用DHFR-M,TX系統(tǒng)表達(dá)。,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑,第一個由重組哺乳動物,dhfr,啟動子,人tPA cDNA,終止子,細(xì)胞規(guī)模化生產(chǎn)的醫(yī)用蛋白,是治療急性心肌梗塞的溶血,栓藥物：人組織纖溶酶原激,活劑（tPA）。同樣采用,DHFR-MTX系統(tǒng)

24、表達(dá)，受體,細(xì)胞選用CHO系統(tǒng)。目前，,用該工藝路線生產(chǎn)的重組人tPA已經(jīng)商品化。,信號肽編碼序列,此外，人tPA也可由重組大腸桿菌生產(chǎn)，但蛋白的重折疊效率低。,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIII,凝血因子VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關(guān)。多年來，血友病,病人都是使用從人血中分離純化的凝血因子VIII生物制品進(jìn)行治療，然,而由于人的血源污染乙肝病毒或愛滋病病毒，數(shù)千名使用這種血液制,品的血友病人慘遭感染，其中10%的病人最終死于愛滋病而非血友病。,早在上述情況發(fā)生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鑒,定，血源的污染則加速了利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)該藥物的進(jìn)程。與tPA,相

25、似，人凝血因子VIII也是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，必須通過重組哺乳,動物細(xì)胞生產(chǎn)，但目前商品化了的重組人凝血因子VIII尚不能滿足幾代,血友病人的大量需求。,基因治療（Gene therapy ）,基因治療（Gene therapy ） ：指應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達(dá)到治療的目的。,為達(dá)到這一目的，實施相應(yīng)的策略。,一、基因治療策略 策略：直接基因治療和間接基因治療 1、直接基因治療：糾正突變基因 在原位修復(fù)缺陷的基因，以達(dá)到治療目的。為較理想的基因治療策略，由于存在某些問題，目前正在努力之中。（未實現(xiàn)）,2、間接療法： 以正常的基

26、因替代致病基因。 導(dǎo)入外源正常基因，代替有缺陷的基因。而 對靶細(xì)胞而言，沒有去除或修復(fù)有缺陷的基因。 用DNA重組技術(shù)設(shè)法修復(fù)患者細(xì)胞中有缺陷的基因，使細(xì)胞恢復(fù)正常功能而達(dá)到治療遺傳病的目的。,途 徑:,就基因轉(zhuǎn)移的受體細(xì)胞不同， 基因治療有兩種途徑： 1、生殖細(xì)胞基因治療 2、體細(xì)胞基因治療,1、生殖細(xì)胞基因治療,將正?；蜣D(zhuǎn)移到患者生殖細(xì)胞（精細(xì)胞，卵細(xì)胞，早期胚胎）使其發(fā)育成正常個體。為理想的治療方法，從根本上治療遺傳病，使其有害基因不能在人群中散播。,但還存在某些問題：,1）靶細(xì)胞的遺傳修飾至今尚無實質(zhì)性進(jìn)展； 2）基因轉(zhuǎn)移效率不高，只能用顯微注射方法； 3）只適用于排卵周期短而次數(shù)多

27、的動物，很難適用于人類。 （但目前輔助生殖技術(shù)的發(fā)展較為有效的解決了獲取卵細(xì)胞的辦法。一次可獲取少者3-5個，多者十幾個。）,2體細(xì)胞基因治療 somatic cell gene therapy,將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。但有害基因能遺傳給后代。,措 施：,（1）正常基因轉(zhuǎn)移至體外培養(yǎng)的體細(xì)胞，有效 表達(dá)后，再回輸?shù)襟w內(nèi)。 （2）正?；?qū)氚屑?xì)胞，定位整合到染色體 上，準(zhǔn)確的替換異?；颍抢硐氲拇胧?。 （3）隨機(jī)整合，非特定座位，只要有效的表達(dá) 即可達(dá)到治療的目的。 （4）體細(xì)胞基因治療理論上不必矯正所有的體 細(xì)胞。,存在的問題,對特定座位基因轉(zhuǎn)移，目前還

28、存在較大困難； 隨機(jī)插入可能引起后代的基因突變。,二 、基因治療的方法,基因治療的關(guān)鍵性步驟- 目的基因的獲得與轉(zhuǎn)移,基因治療首先獲得目的基因通常從基因組中分離 基因克隆 定 位 表 達(dá) 評價表達(dá)情況,一）目的基因的獲得 正?；虻姆蛛x與克隆,二）外源基因的轉(zhuǎn)移,通過不同方法，將目的基因轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞。,1）物理方法,（1）電穿孔法（electroporotion）將細(xì)胞置于高壓脈沖電場中，通過電壓使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔。周圍基質(zhì)中的DNA可滲進(jìn)細(xì)胞，進(jìn)而表達(dá)。 瞬間 細(xì)胞 細(xì)胞膜核膜通透性增加 高壓脈沖 DNA滲入細(xì)胞,（2）顯微注射法（microinjection ）,利用顯微操作把目的基

29、因直接注入靶細(xì)胞或細(xì)胞核,例：轉(zhuǎn)基因動物的制備,重組基因 DNA 微注射 （體外） 小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 動物模型：轉(zhuǎn)基因鼠 (每個鼠細(xì)胞中都含有外源基因，按孟德爾方式遺傳),clone sheep Dolly 體細(xì)胞 提取 核 重組細(xì)胞 回植 Dolly 卵細(xì)胞 去核 細(xì)胞,（3）微粒子轟擊法,利用亞微粒的鎢和金能吸附DNA，并將其包裹起來形成微粒，通過物理途徑獲得高速度，微粒瞬間既可進(jìn)入靶細(xì)胞，達(dá)到轉(zhuǎn)移目的基因的目的，而不損傷靶細(xì)胞。 該方法可使目的基因在皮膚、肝、胰、胃及乳腺等細(xì)胞中表達(dá)。,2）化學(xué)法,磷酸鈣沉淀法： 目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的DNA 微細(xì)顆粒，易

30、通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并整合到受 體細(xì)胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達(dá)。,磷酸鈣+DNA 混合微細(xì)顆粒 沉淀反應(yīng)2030min 細(xì)胞在沉淀物中暴露 524h 方法簡單，但轉(zhuǎn)化效率低。,3）脂質(zhì)體法（liposome）,應(yīng)用人工制備的類似細(xì)胞膜的膜性結(jié)構(gòu)脂質(zhì)體，包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞，使其表達(dá)。 DNA 細(xì)胞融合 轉(zhuǎn)化細(xì)胞 PEG 仙苔病毒,DNA,脂膜,4）同源重組法,同源重組（homologus recombination）:外源基因和染色體上的基因在同源序列間發(fā)生重組而插入染色體。 是將外源基因定位導(dǎo)入細(xì)胞的染色體上。 單交換 雙交換,通過同源重組定點插入珠蛋白

31、基因,Xba I,BstXI,Xba I,neo,XbaI,BstXI,neo,正常基因座位,帶有珠蛋白基因的質(zhì)粒,C,重組后，插入外源基因片段帶有neo基因（新霉素抗性基因），重組后的細(xì)胞在含有neo 的培養(yǎng)基中生長，沒有插入新基因的細(xì)胞死亡，將有重組的細(xì)胞篩選出來。,5）病毒介導(dǎo)基因內(nèi)轉(zhuǎn)移（Viral mediated transfer）,是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術(shù)與病毒重組，然后去感染受體細(xì)胞,感染細(xì)胞,重組病毒,逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA) 常用的病毒載體 DNA病毒 1) 逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus） 目前應(yīng)用最多、最成功. 病毒感染細(xì)胞后，其基因組RNA

32、 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病毒（provirus），前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒RNA，再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病毒顆粒。,例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結(jié)構(gòu)：,LTR LTR gag pol env U3 R U5 U3 R U5 U3=增強子，R=啟動子，U5=轉(zhuǎn)錄起始位點。 =病毒包裝信號， gag =核心抗原， pol=逆轉(zhuǎn)錄酶， env=外殼蛋白。,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點：,高效感染宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率可達(dá)100% 病毒基因和所載的外源基因都可能表達(dá) 宿主范圍廣，可同時感染大量細(xì)胞并長期存留,缺 點,病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；

33、 病毒隨機(jī)插入靶細(xì)胞基因組中，因病毒具有強大的啟動子和增強子，能使插入點附近的基因過度表達(dá)或失活，插入的 外源基因可能不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)；,逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用，可能使受體細(xì)胞癌變。 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的缺點，人們有目的地將其改造，保留其優(yōu)點，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和包裝信號。,6）受體載體轉(zhuǎn)移法,將含有目的基因的重組質(zhì)粒和某些細(xì)胞表面受體能識別的特異性多肽（配體）形成復(fù)合物，通過細(xì)胞內(nèi)吞途徑達(dá)到轉(zhuǎn)移基因的目的。,重組質(zhì)粒,配體,細(xì)胞膜,復(fù)合物,三）靶細(xì)胞的選擇,靶細(xì)胞是指接受外源Gene的體細(xì)胞 選擇靶細(xì)胞的原則是： 1）必須較堅固，便于體外培養(yǎng)和進(jìn)行遺傳技術(shù) 操作； 2）易于由人體分離又便

34、于輸回體內(nèi) 3）具有增殖優(yōu)勢，生命周期長（能存活幾月至 幾年，或整個生命周期） 4）易于受外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化。,常見的靶細(xì)胞,外周血T淋巴細(xì)胞 上皮細(xì)胞 內(nèi)皮 皮膚成纖維細(xì)胞 造血干細(xì)胞地中海貧血、嚴(yán)重 復(fù)合免疫缺陷病等基因治療 肝C家族性高膽固醇血癥、低密度 脂蛋白病的基因治療 肌細(xì)胞,三、Gene治療的現(xiàn)狀與前景,體細(xì)胞Gene治療臨床實驗已經(jīng)開始，生殖細(xì)胞Gene治療正在完善。進(jìn)行基因治療必須具備下列條件：,具備下列條件,選擇適當(dāng)?shù)募膊?，清楚疾病的發(fā)病機(jī)理，Gene的結(jié)構(gòu)和功能。 被糾正的基因已克隆，并清楚Gene表達(dá)與調(diào)控機(jī)制與條件。 選擇適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞并在體外有效表達(dá)。 安全有效的基因轉(zhuǎn)移方法，以及供利用的動物模型。,基因治療實例,1、復(fù)合免疫缺陷綜合征的基因治療 （人類Gene治療成功例子） ADA缺乏癥-致死性疾病，患者由于腺苷酸脫氨酶（ADA）缺乏。,ADA-Gene + vector （逆轉(zhuǎn)錄病毒） 重組分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 導(dǎo)入 細(xì)胞生長分裂 10天 Gene表達(dá) 回輸患兒體內(nèi) 12月治療一次, 10個月 患兒體內(nèi)ADA水平達(dá)正常人的25%,2、乙型血友病,XR ，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3q27.2。臨床表現(xiàn)，易出血，凝血時間長，輕傷、小手術(shù)后常出血不止。發(fā)病率為1