1、大腸埃希菌的檢測,檢測意義 大腸埃希菌是腸道中存在的正常菌群，故常來源于人和動物的糞便，所以常作為糞便污染的指標(biāo)。一旦被檢藥物中查出大腸埃希菌，表明該藥品已被糞便污染，可能存在腸道致病菌和寄生蟲卵，患者服用該藥物后有引起感染的危險。因此，大腸埃希菌被列為重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌。國家藥品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定口服藥品不得檢出大腸埃希菌。,檢測原理：,中國藥典采用了MUGIndole快速測定藥品中大腸埃希菌。 在MUG試驗中，將MUG（4-甲基傘形酮葡糖苷酸）作為目標(biāo)菌的基本營養(yǎng)物加入培養(yǎng)基中，被大腸埃希菌的-葡萄糖醛酸酶直接分解產(chǎn)物又作為一種指示系統(tǒng)，在366 nm紫外光下呈現(xiàn)蘭白色熒光，即MUG陽性；若無熒光

2、，即MUG陰性。 靛基質(zhì)（Indole）試驗中，大腸埃希菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。,因此根據(jù)大腸埃希菌的這一性質(zhì)，對MUG呈陽性者，再加對-甲氨基苯甲醛試劑數(shù)滴，輕搖試管，培養(yǎng)液上層呈現(xiàn)玫瑰紅色者(陽性)，報告檢出大腸埃希菌。如果兩者都為陰性，報告未檢出大腸埃希菌。如果一陰一陽，需要進(jìn)一步的培養(yǎng)和生化試驗檢查。 本方法對大腸埃希菌的檢出率達(dá)98。 培養(yǎng)溫度：控制菌培養(yǎng)溫度為3035。,實訓(xùn)器材：,蒸汽滅菌物品： 1.乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基試管10支 干熱滅菌物體： 5mL移液管1支 1mL移液管5支,

3、流程圖：,甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養(yǎng)基,胨10.0g 硫酸錳0.5mg 硫酸鋅0.5mg 硫酸鎂0.1g 氯化鈉5.0g 氯化鈣50.0mg 磷酸二氫鉀0.9g 磷酸氫二鈉6.2g 亞硫酸鈉40.0mg 去氧膽酸鈉1.0g MUG 75mg 水1000mL 除MUG外，取上述成分，混合。微溫溶解，調(diào)節(jié)PH7.2-7.4，加入MUG，溶解，每管分裝5mL，滅菌。,實驗步驟：,取供試供試液1mL，直接或處理后接種在制好的100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,在37恒溫箱中培養(yǎng)1824 h，進(jìn)行增菌培養(yǎng)。 取上述培養(yǎng)物0.2mL,接種至含5mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，于5小時，24小時在366nm紫

4、外燈光下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基做本底對照。 若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性，不呈現(xiàn)熒光，則為MUG陰性。,觀察后，沿著培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，葉面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性，呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。 本底對照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。 靛基質(zhì)實驗原理 某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。,伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）,蛋白胨水瓊脂培養(yǎng)基100ml，20%乳糖溶液2ml，2%伊紅水溶液2ml，0.5%美藍(lán)水溶液1ml，將已滅菌的蛋白胨水瓊脂培養(yǎng)基（pH7.6）加熱溶化，冷卻至6

5、0左右時，再把已滅菌的乳糖溶液，伊紅水溶液及美藍(lán)溶液按上述量以無菌操作加入。搖勻后，立即倒平板。乳糖在高溫滅菌易被破壞必須嚴(yán)格控制滅菌溫度，115滅菌20min。,結(jié)果分析：,1.MUG、靛基質(zhì)結(jié)果判斷 MUG培養(yǎng)結(jié)果：在366nm紫外線下觀察 靛基質(zhì)結(jié)果：液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試液本色，為靛基質(zhì)陰性 MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判檢出大腸桿菌； MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌； MUG陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，需進(jìn)一步做以下檢查,2。EMB培養(yǎng)結(jié)果判斷 EMB培養(yǎng)18-24h后，檢查有無疑似大腸埃希菌菌落（大腸埃希菌落形態(tài)特征見表），若無，判供試品未檢出大腸埃希菌；若有，進(jìn)一步做以下試驗大腸埃希菌落形態(tài)特征,檢驗依據(jù)： 2010年版中國藥典二部附錄J 微生物限度檢查法檢驗標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：口服制劑細(xì)菌數(shù)1g不得超過1000個；1ml不得超過100個。霉菌及酵母菌數(shù)1g不得超過100個?？刂凭?g（1ml）不得檢出大腸埃希菌。,注意事項,1實訓(xùn)過程要嚴(yán)格無菌操作。 2供試液稀釋及注入培養(yǎng)皿時應(yīng)搖勻再取，供試液從制備至加入培養(yǎng)基不得超過1h. 3配制MUG培養(yǎng)基時，務(wù)必調(diào)pH，否則pH偏高，MUG分解，本身則