1、a，1，透射電子顯微鏡的生物樣品制備技術(shù)，a，2，可分為兩類：透射電子顯微鏡樣品的基本制備技術(shù)-超薄切片技術(shù)-負(fù)染技術(shù)，生物樣品的特殊樣品制備技術(shù)，a，3，超薄切片技術(shù)，a，4，概念：指厚度小于100納米的切片技術(shù)的制備。特點：它是透射電子顯微鏡制備生物樣品最常用和最基本的技術(shù)；是其他技術(shù)方法的基礎(chǔ)；手術(shù)時間長，操作復(fù)雜而精細(xì)。生物醫(yī)學(xué)樣本的特征：1。樣品多樣化，包括組織、細(xì)胞、微生物和生物大分子。2.含水量高，質(zhì)地柔軟，脫水時容易收縮變形。3.機(jī)械度低，抗電子束轟擊能力差。4.它們大多數(shù)由低原子序數(shù)的元素組成，所以導(dǎo)電性差。5.樣品形態(tài)對試劑的酸堿度和溫度敏感。a、6、主要步驟：固定、脫水、

2、浸泡和染色包埋切片；a，7，1。從人體、動植物、細(xì)胞和微生物的培養(yǎng)物中選擇電子顯微鏡觀察材料的過程。從活體取樣時，應(yīng)做到：快速-在1 2分鐘內(nèi)將固定液放入體外-準(zhǔn)確取樣，代表性小-1毫米1毫米，太小時結(jié)構(gòu)少，太大時固定不充分，結(jié)構(gòu)保存不良-動作輕，儀器尖銳而冷-0 4，儀器、容器和固定液預(yù)冷，固定a、8、 2目的盡可能保持組織和細(xì)胞在生活條件下的結(jié)構(gòu)，以固定細(xì)胞中的各種成分，避免在后續(xù)的洗滌和脫水步驟中溶解和損失，防止細(xì)胞內(nèi)酶活性引起的細(xì)胞自溶，防止外部微生物入侵和繁殖引起的腐敗，從而破壞微細(xì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 方法物理法、快速冷凍干燥法、化學(xué)法、浸漬固定法、原位固定法、灌注固定法、a、10、普

3、通固定劑、戊二醛(GA)無色透明液體，pH4，使用濃度2.5 4%，使用溫度4。優(yōu)點：滲透性強(qiáng)，能更好地保存蛋白質(zhì)和碳水化合物的結(jié)構(gòu)及酶的活性，固定保存時間長(4下可達(dá)幾周至幾個月)。缺點：差的組織對比度對脂質(zhì)沒有固定作用。固定后，應(yīng)徹底清洗樣品。一、11、四氧化鋨OsO4，淺黃色塊狀晶體，使用濃度1 4%，使用溫度4。優(yōu)點：對蛋白質(zhì)和脂類有良好的固定效果，可避免組織塊的收縮或膨脹，產(chǎn)生明顯的反差。A，12，四氧化鋨OsO4，缺點：分子量大，滲透能力差，對碳水化合物和酶的固定效果差，固定時間長，容易引起組織脆化，刺激性味道強(qiáng)，對角膜和鼻粘膜有毒性作用，在光熱作用過程中容易發(fā)生變化；A，13，多

4、聚甲醛(多聚甲醛)，白色粉末，當(dāng)其以4%的濃度使用時，具有對組織滲透性強(qiáng)和保存抗原物質(zhì)的優(yōu)點，主要用于免疫電子顯微鏡。缺點是當(dāng)濃度高時，組織結(jié)構(gòu)可能會丟失，并且它們中的大多數(shù)不能單獨使用。a，14，普通緩沖液，0.2M磷酸鹽緩沖液：比0.2M二甲基砷酸鹽緩沖液：更常用于制備固定液和沖洗，用于電子顯微鏡細(xì)胞化學(xué)。a、15、浸泡固定法是一種將樣品直接固定在預(yù)冷的固定液中的方法，適用于大多數(shù)組織和器官。最常用的方法是戊二醛和鋨酸固定。手術(shù)前固定步驟3360:用2.5%-4%的戊二醛在4下沖洗1-2小時或數(shù)月：用4的緩沖液更換2-4小時，共3次，然后固定：用1%的鋨酸在4下沖洗1.5-2小時(培養(yǎng)細(xì)胞

5、30分鐘)，用蒸餾水在4沖洗10分鐘，a，16，原位固定法，以保證器官的血液供應(yīng)，避免缺血引起的組織損傷或自溶。操作步驟：在麻醉后保持血液供應(yīng)的情況下，解剖時最好在取樣部位局部加入固定液，直至組織達(dá)到適當(dāng)?shù)挠捕?。一、一、十七、灌注固定是指灌注的方法包括全身灌注固?對于小動物)和器官灌注固定(對于大動物)。a、18、操作步驟(以全身灌注固定法為例)麻醉待灌注的動物，將動物固定在實驗臺上，打開胸腔暴露心臟，將針刺入左心室，切開右心耳引出血液和灌注液。用注射器或輸液器緩慢注入37，0.9%氯化鈉，直至內(nèi)臟血液顏色消失或流出液失去顏色，注入4固定液，待組織變硬后取樣。a，19，體外培養(yǎng)細(xì)胞的固定，單

6、層細(xì)胞的固定，懸浮細(xì)胞的固定，添加熔化的2%瓊脂或BSA以增加粘附。離心機(jī)。a 20 3。脫水的目的是清除組織內(nèi)的游離水，有利于浸泡和包埋常用的脫水劑乙醇3360，使組織收縮較小，但與包埋劑的混溶性差。丙酮：能溶解脂質(zhì)，與包埋劑有良好的混溶性，但容易使組織變脆。a、21、脫水步驟，將50%乙醇從低濃度脫水到高濃度，在4脫水10 15分鐘，70%乙醇在4脫水10 15分鐘或在80%乙醇室溫脫水10 15分鐘過夜，95%乙醇室溫脫水10 15分鐘，95%乙醇：95%丙酮(11)室溫脫水10 15分鐘。15分鐘無水丙酮在40分鐘室溫下，a，22，4。浸泡和包埋，浸泡：目的是使包埋劑逐漸取代脫水劑滲入

7、組織和細(xì)胞。由于包埋劑與脫水劑不混溶，因此有必要使用與脫水劑和包埋劑都相容的物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。常用的轉(zhuǎn)化劑是環(huán)氧丙烷。包埋：目的是使包埋劑完全滲入組織細(xì)胞，使組織具有一定的硬度、彈性和韌性，并能承受切片時的各種壓力，從而制備超薄切片。常用包埋劑，a，23，具有粘度低、親和力強(qiáng)、切割性能優(yōu)異、切片透明度高、組織結(jié)構(gòu)保存良好的特點，能承受低溫電子束轟擊和聚合。環(huán)氧樹脂Epon812(進(jìn)口)能很容易地滲透到組織中并保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此被廣泛使用。丙烯酸樹脂)618(國產(chǎn))，a，24，低聚丙烯酸K4M:是一種低溫水溶性包埋劑，常用。其特點是在低溫(-35)下保持低粘度；它可以在紫外光(波長360納米)下聚合

8、。聚合后，可在常溫下切片；它能保持植物血凝素的組織結(jié)構(gòu)和抗原性以及結(jié)合位點，減少背景非特異性染色，因此主要用于免疫細(xì)胞化學(xué)包埋后染色。包埋劑配方(K4M) K4M(單體)8.65克交聯(lián)劑1.35克引發(fā)劑50毫克，a，25，LR white:是混合丙烯酸類單體，它們在脂質(zhì)中溶解度低，保存膜結(jié)構(gòu)好，能承受電子束轟擊，因此不能用作支撐膜。60熱聚合；冷聚合-25，促進(jìn)劑輔助聚合。a，26，嵌入方法，1。常規(guī)包埋法適用于大多數(shù)組織塊和細(xì)胞塊在室溫下用環(huán)氧丙烷浸泡20min，環(huán)氧丙烷：包埋劑1:1在室溫下浸泡40-60min，包埋劑在室溫下浸泡3h，將樣品放入包埋板或膠囊中，放置標(biāo)簽并用包埋劑填充進(jìn)行聚

9、合(硬化包埋劑)35 12h 45 12h 55 12h，a，27，2。冰凍切片、半薄切片和單層培養(yǎng)細(xì)胞的某些結(jié)構(gòu)觀察。1.組織塊：固定后，用振動切片機(jī)切成50-100m厚的切片，在顯微鏡下選擇含有所需結(jié)構(gòu)的厚切片進(jìn)行沖洗。在用1%鋨酸固定、用乙醇和丙酮脫水、用環(huán)氧樹脂浸漬后，將厚片放在載玻片上，將具有平頂?shù)膹U物包埋塊放置在切片的特定部分，然后在60聚合以修整該塊，然后常規(guī)切片和染色。a，28，2，切片和單層培養(yǎng)細(xì)胞(需要在載玻片上進(jìn)行):選擇要在光學(xué)顯微鏡下觀察的位置，并用筆在載玻片的反面進(jìn)行標(biāo)記。預(yù)固定、漂洗、后固定、脫水和浸泡與常規(guī)包埋方法相同，但每個步驟的時間可以縮短切片，用途：制備厚

10、度小于100納米的切片。復(fù)合膜載體膜甲醛膜火棉膠膜碳膜用于負(fù)染色技術(shù)支撐網(wǎng)常用的有銅網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)、鎳網(wǎng)和鉑網(wǎng)(用于組織化學(xué))，a、31、a、32、2。半薄切片：的目的是確定要觀察的準(zhǔn)確位置，厚度為0.5 1微米，用甲苯胺藍(lán)染色顯示。a、34、a、35、a、36、a、37、a、38、超薄切片：采用超薄切片操作步驟：包埋塊固定刀固定水箱，加水切片，選擇切片和釣魚切片，a、39、切片帶彎曲的可能原因及解決辦法，a、40、制作支撐膜，可支撐觀察性能良好的支撐膜應(yīng)具備：1。高透明度2。電子顯微鏡下無可見結(jié)構(gòu)。不與各種支持樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，如芳華膜、碳膜、火棉膠基碳膜、硝酸纖維素基碳膜、微濾膜等。a、41

11、、支撐膜、防化膜的生產(chǎn)(防化膜的化學(xué)成分為聚乙烯醇縮甲醛，為淡黃色粉末):制備炭膜的力學(xué)和化學(xué)性能較好，熱漂移減小。噴膜-浮膜-魚膜，a，43，切片厚度可根據(jù)干涉色判斷。深灰色40納米，灰色40-50納米，薄，易被電子束破壞，銀白色60-70納米，最常用的金黃色70-80納米，紫色90納米以上，厚，細(xì)節(jié)不明。a，44，超薄切片的質(zhì)量指標(biāo)，樣品結(jié)構(gòu)保存良好，結(jié)構(gòu)細(xì)膩且無損失。切片厚度均勻，厚度在60-90納米之間。表面沒有皺紋、刀痕和震顫。樣品對比度好，無染料沉淀。支撐膜的厚度適中，在觀察過程中不會發(fā)生漂移或破裂。電子染色，即使用重金屬鹽選擇性地與生物樣品中的不同結(jié)構(gòu)成分結(jié)合，以提高結(jié)構(gòu)成分散射

12、電子的能力，從而增加圖像的對比度，也稱為陽性染色。常用染料： 0.5% 1%醋酸鈾酰能增強(qiáng)核酸、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織纖維的對比度。0.1% 0.4%檸檬酸鉛能增強(qiáng)膜結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)的反差。a，46，陽性染色，a，47，透射電鏡樣品：超薄切片厚度應(yīng)均勻，無震顫，無刀痕，無染色污染，適當(dāng)對比，a，48，a，49，陰性染色技術(shù)，即重金屬鹽與結(jié)構(gòu)背景結(jié)合，增加背景的電子散射能力，使背景變黑，使樣品結(jié)構(gòu)變亮。，a，50，染色磷鎢酸(PTA) pH 6.7-7，染色步驟，涂布網(wǎng)，滴加樣品，滴加染料溶液1-2分鐘，用濾紙吸收染料溶液，觀察優(yōu)點，它適用于懸浮液樣品(細(xì)菌、病毒、其他微生物、大分子、分離細(xì)胞器)，具有操作快速簡單、樣品用量少、圖像結(jié)構(gòu)對比度好等優(yōu)點。取樣：需要精確的零件、小塊、短時間、低溫、尖銳的儀器和減少的機(jī)械損傷。2.戊二醛的固定時間可適當(dāng)延長，一般不超過一周，在此期間應(yīng)更換一次固定劑，并保持低溫固定，充分清洗后再進(jìn)行鋨酸固定1-2小時，時間不能太長進(jìn)行酒精梯度脫水，一般為50%、70%、80%、95%、無水酒精；4.樣品的滲透和嵌入；保持干燥和徹底滲透；5.聚合：由室溫到高溫梯度加熱，如35，45，60的順序；6.超薄切片3360切片器的性能切片時要注意載體網(wǎng)的質(zhì)量。7.在電子染色過程中必須避免一切污染。一、53、注意事項(陰性染色)，樣品濃度應(yīng)適中，無雜質(zhì)樣品的酸堿度應(yīng)與染