1、病毒檢驗技術(shù),VirusDetectionTechnology,1,學(xué)習(xí)交流PPT,前言,目錄,CONTENTS,病毒的分離與培養(yǎng),免疫學(xué)方法,病毒核酸分子檢測,新型核酸擴增檢測技術(shù),2,學(xué)習(xí)交流PPT,前言,01PART,3,學(xué)習(xí)交流PPT,病毒學(xué)檢驗技術(shù)是用實驗室檢驗方法對臨床和流行病學(xué)現(xiàn)場送檢的標(biāo)本（如人或宿主的血液、組織、尿、糞便和組織液等）進行病毒學(xué)的定性和定量分析，為病毒感染和病毒性疾病的診斷、治療和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。,病毒檢驗技術(shù),病毒檢測技術(shù)反映病毒的核酸水平、感染的狀態(tài)、傳染性和評定治療效果，對病情的診斷、治療和用藥上起著關(guān)鍵性的作用，可根據(jù)檢查結(jié)果判斷和選擇患者適宜的抗病毒

2、藥物種類，并制定適宜的最佳治療方案；可根據(jù)病毒核酸量的動態(tài)變化對患者用藥的劑量、時間及是否需要聯(lián)合用藥等提供重要的參考依據(jù)。病毒檢測技術(shù)在評價和觀察抗病毒藥物治療的療效、免疫增強藥物的療效及判定預(yù)后效果都有重要應(yīng)用。,病毒檢驗技術(shù)流程,病毒的分離與培養(yǎng),主要有細胞培養(yǎng)法、雞胚培養(yǎng)法、動物接種法等,而對細胞、雞胚不敏感,又沒有合適動物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。,02PART,6,學(xué)習(xí)交流PPT,細胞培養(yǎng)法,細胞培養(yǎng)瓶,雞成纖維細胞,二倍體細胞株來源于正常人胎兒組織，主要用于培養(yǎng)病毒制備疫苗等；原代細胞是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞，原代細胞的培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、組織和器官后立即進

3、行培養(yǎng)；傳代細胞來源于腫瘤細胞或細胞株傳代過程中變異的細胞。,雞胚培養(yǎng),雞胚培養(yǎng)法是用來培養(yǎng)某些對雞胚敏感的動物病毒的一種培養(yǎng)方法，此方法可用以進行多種病毒的分離、培養(yǎng)，毒力的滴定，中和試驗以及抗原和疫苗的制備等。,一般選用914d的雞胚,優(yōu)點:來源充足、組織分化程度低、本身很少攜帶病毒和細菌、對接種病毒不產(chǎn)生抗體及病毒較易增殖等,不同病毒在雞胚的不同部位的生長特性差異很大，選擇不同的接種部位是病毒分離成功的關(guān)鍵：尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接種、絨毛尿囊膜接種,尿囊腔接種：常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的適應(yīng)和傳代培養(yǎng),動物接種,常用的實驗動物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和

4、雞等；常用的接種途徑包括皮下、皮內(nèi)、腹腔、靜脈、角膜、鼻腔及腦內(nèi)接種等方式；,病毒增殖的觀察,病毒在細胞內(nèi)增殖的鑒定指標(biāo)1細胞形態(tài)的改變2紅細胞吸附3細胞培養(yǎng)液pH值改變病毒數(shù)量及病毒感染性測定1血凝試驗2中和試驗3空斑形成試驗4半數(shù)感染量（ID50）和組織培養(yǎng)半數(shù)感染量（TCID50）,紅細胞吸附,包涵體,細胞形態(tài)改變,光學(xué)顯微鏡,形態(tài)學(xué)檢查及診斷,直接觀察到較大的病毒體（如痘病毒）、包涵體狂犬病毒感染嗜酸性包涵體。,掃描電子顯微鏡,用于觀察病毒和細菌表面結(jié)構(gòu)和附屬結(jié)構(gòu)等。,透射電子顯微鏡,用于觀察病毒的大小、形態(tài)與結(jié)構(gòu)及細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)等。,空斑形成試驗,是一種檢查和準(zhǔn)確測定病毒滴度的方法

5、。將稀釋的病毒懸液加入單層細胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化的半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細胞培養(yǎng)中有限擴散。結(jié)果是每一個有感染性的病毒在單層細胞中可產(chǎn)生一個局限性的感染灶。用活性染料(如中性紅)染色，則活細胞著色，受病毒感染而破壞的細胞不著色，形成肉眼可見的空斑/蝕斑(plaque)。每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成的，稱作空斑形成單位(plaqueformingunit,PFU)。病毒懸液中的感染性病毒量的滴度可用PFUml表示。,免疫學(xué)方法,03PART,13,學(xué)習(xí)交流PPT,ELISA,酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）

6、采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。,病毒核酸分子檢測,04PART,15,學(xué)習(xí)交流PPT,基因芯片,基因芯片(genech

7、ip)又稱基因微矩陣(DNAmicroarry)具有微型化、高通量、并行處理易于自動化等優(yōu)越性,它將大量的靶基因片段有序、高密度地排列在玻片、硅等載體上,用熒光檢測后,通過計算機軟件進行數(shù)據(jù)比較和分析,一次試驗就可對上萬種基因進行快速、準(zhǔn)確、高效的檢測。,實時熒光定量PCR,目前最有效、最靈敏的方法就是實時熒光定量PCR（realtimeRT-PCR），根據(jù)目標(biāo)核酸基因來設(shè)計引物實現(xiàn)對靶標(biāo)的檢測，已廣泛應(yīng)用在臨床樣品的檢測。realtimeRT-PCR是將熒光能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于PCR儀中，在PCR的反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用獲取的熒光信號積累來實時監(jiān)測整個PCR進程，最終通過得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對

8、未知得模板進行定量分析的方法。,新型核酸擴增檢測技術(shù),05PART,18,學(xué)習(xí)交流PPT,NASBA,NASBA（Nuclearacidsequence-basedamplification，核酸依賴性擴增檢測技術(shù)）是一項以RNA模板進行等溫核酸擴增并能實時觀測結(jié)果的檢測方法。該技術(shù)的檢測反應(yīng)有賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、兩種特別設(shè)計的特異性寡核苷酸引物和分子信標(biāo)探針共同協(xié)作而完成。相對于免疫學(xué)方法或其他基因檢測法，NASBA速度快，特異性強，敏感性高，檢測范圍廣泛，缺點在于成本較高。,雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)HCR,雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HybridizationChainReac

9、tion,HCR）是由Dirks與Pierce于2004年提出的一種高效的核酸擴增方法，根據(jù)核酸探針競爭性雜交形成長度不等的亞穩(wěn)態(tài)核酸雙鏈實現(xiàn)輸出信號的放大。HCR反應(yīng)在室溫下即可，無需變溫調(diào)節(jié)、酶的輔助及其它試劑的參與，在核酸信號擴增方面得到廣泛應(yīng)用。HCR反應(yīng)體系由一段啟動探針I(yè)，兩段發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)探針H1、H2構(gòu)成，H1與H2發(fā)夾環(huán)探針結(jié)構(gòu)相似，分為環(huán)部、莖部以及粘性末端三個部分，啟動探針引發(fā)兩段功能性核酸探針競爭性結(jié)合，形成亞穩(wěn)態(tài)的核酸雙鏈，從而實現(xiàn)HCR反應(yīng)。,HCR介導(dǎo)的比色方法,比色法主要通過顏色的變化來實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測。將HCR反應(yīng)與形成G-四連體結(jié)構(gòu)結(jié)合用于檢測一段TBV寡核苷

10、酸序列。,HCR介導(dǎo)的熒光檢測方法,熒光因其特有的發(fā)光性質(zhì)，可通過儀器檢測熒光信號值的變化實現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的實時監(jiān)測，結(jié)合HCR信號擴增技術(shù)后會將信號放大輸出，實現(xiàn)更加靈敏的檢測。,基于HCR介導(dǎo)的核酸檢測方法,HCR介導(dǎo)的納米金方法,當(dāng)靶標(biāo)與兩段探針通過HCR反應(yīng)結(jié)合不斷形成核酸雙鏈結(jié)構(gòu)，核酸探針就會從納米金上脫落下來，使得納米金在鹽溶液中發(fā)生聚集，溶液呈現(xiàn)藍色。通過肉眼觀測到溶液顏色的變化，實現(xiàn)了核酸可視化的檢測。,HCR反應(yīng)與電化學(xué)方法相結(jié)合,發(fā)夾環(huán)核酸探針固定在電極上，通過與待檢靶標(biāo)以及核酸引物堿基互補后，在dNTP與聚合酶作用下，循環(huán)形成多個帶有可啟動HCR序列的引物，與標(biāo)記Biotin的H1、H2進行HCR反應(yīng)，特異性與標(biāo)記SA的堿性磷酸化酶在電極上產(chǎn)生電信號，從而實現(xiàn)對靶標(biāo)的檢測。,自動化,高通量,可視化,集約化,規(guī)?；?病毒檢測技術(shù)中核酸檢測可直接對病毒基因進行檢測，避免抗原和抗